張雅靜 杜昆利

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，其發(fā)病率居全球惡性腫瘤第3位[1]。早期結(jié)腸癌患者臨床癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)處于晚期，術(shù)后的5年生存率較低[2]。研究報(bào)道，全球每年約有120萬(wàn)以上的結(jié)腸癌新發(fā)病例，約有60萬(wàn)人死于結(jié)腸癌[3]。在中國(guó)，近年來(lái)由于人們生活方式的改變，結(jié)腸癌發(fā)病率及病死率均呈升高趨勢(shì)[4]。目前缺乏敏感度和特異度均較高的結(jié)腸癌早期診斷標(biāo)志物。隨著對(duì)結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制的深入研究，探索與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物對(duì)于早期診斷和治療結(jié)腸癌，以及改善患者的預(yù)后具有重要的意義。

miRNA是廣泛存在于生物體內(nèi)的非編碼RNA，其作為一類(lèi)重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，可與靶基因結(jié)合，調(diào)控與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)[5-7]。miRNA不僅可作為腫瘤早期診斷、治療和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，還可作為治療靶點(diǎn)[8]。miR-26位于19q14.12染色體，有研究報(bào)道其在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、轉(zhuǎn)化、侵襲等過(guò)程，且與患者的臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，目前其在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚未完全明確[9-11]。本研究探討了血清miR-26水平與老年結(jié)腸癌患者臨床病理特征及長(zhǎng)期預(yù)后的關(guān)系，以期為結(jié)腸癌的早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)提供有價(jià)值的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2013年3月至2015年3月空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科收治的45例60歲及以上的結(jié)腸癌患者作為結(jié)腸癌組，另選擇同期50名60歲及以上的健康體檢者作為對(duì)照組。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選者均簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)腸癌患者均為首診，行結(jié)腸鏡檢查，活體組織病理確診為結(jié)腸癌；(2)對(duì)照組行結(jié)腸鏡檢查未見(jiàn)異常，且無(wú)惡性腫瘤病史；(3)年齡≥60歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：有高血壓、糖尿病及心血管、肝、腎等慢性疾病患者，嚴(yán)重?zé)?、酒嗜好者。結(jié)腸癌組中，男性27例(60%)，女性18例(40%)，年齡60～79歲，平均年齡為(68.22±12.11)歲；對(duì)照組中，男性28例(56%)，女性22例(44%)，年齡60～81歲，平均年齡為(67.41±12.43)歲。兩組的性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

1.2 主要儀器與試劑

miR-21、miR-26及miR-141引物由廣州銳博生物公司合成；RT-PCR儀器(ABI VeritiPro PCR)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；總RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript○RRT reagent Kit和qPCR試劑盒SYBR Green qPCR assay均購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.3 方法

收集兩組的臨床資料，包括性別、年齡及臨床病理特征等。結(jié)腸癌組于術(shù)前1周抽取5 mL外周靜脈血，對(duì)照組于體檢當(dāng)日清晨抽取5 mL外周靜脈血。將外周血置于離心機(jī)中，2 000 r/min離心10 min，分離上清液，加入TRIzol試劑提取血清中總RNA，用酶標(biāo)儀測(cè)定RNA的質(zhì)量和水平。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將cDNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，以U6為內(nèi)參，DNA為模板，采用RT-PCR法測(cè)定血清miR-21、miR-26和miR-141水平，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。血清miR-21、miR-26及miR-141水平以2-△△Ct表示。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 隨訪

對(duì)結(jié)腸癌患者術(shù)后通過(guò)門(mén)診或電話(huà)隨訪，隨訪開(kāi)始時(shí)間為2013年7月，截止時(shí)間為2020年3月，隨訪終點(diǎn)為患者死亡。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例(%)表示。采用ROC曲線分析血清miR-21、miR-26、miR-141單項(xiàng)檢測(cè)及3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)腸癌的效能。采用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線，預(yù)后的影響因素采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組的血清miR-21、miR-26、miR-141水平比較

結(jié)腸癌組的血清miR-21、miR-26水平均顯著高于對(duì)照組，血清miR-141水平顯著低于對(duì)照組(P均<0.001)。見(jiàn)表2。

表2 兩組的血清miR-21、miR-26、miR-141水平比較

2.2 血清miR-26水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

不同性別、年齡、腫瘤最大直徑的結(jié)腸癌患者血清miR-26水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，而不同臨床分期、腫瘤分化程度、局部浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者血清miR-26水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)果提示血清miR-26水平與年齡、性別、腫瘤最大直徑均無(wú)相關(guān)性，而與臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及局部浸潤(rùn)深度均有相關(guān)性。見(jiàn)表3。

表3 血清miR-26水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血清miR-21、miR-26、miR-141單項(xiàng)檢測(cè)與聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能比較

血清miR-21、miR-26、miR-141單項(xiàng)檢測(cè)及3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)腸癌的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.847(95%CI：0.765～0.929)、0.812(95%CI：0.721～0.903)、0.932(95%CI：0.872～0.991)及0.980(95%CI：0.953～1.000)，敏感度分別為88.9%、82.6%、84.4%和97.8%，特異度分別為71.1%、95.6%、94.8%和95.6%，這提示3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能顯著優(yōu)于單項(xiàng)檢測(cè)(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-21、miR-26、miR-141單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)腸癌的ROC曲線 A 血清miR-21檢測(cè) B 血清miR-26檢測(cè) C 血清miR-141檢測(cè) D 3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)

2.4 血清miR-21、miR-26及miR-141與預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)ROC曲線的約登指數(shù)計(jì)算得出最佳截?cái)嘀?。血清miR-21以1.50為界，將患者分為miR-21高表達(dá)組(26例)和低表達(dá)組(19例)，高表達(dá)組的5年總生存率顯著低于低表達(dá)組(46.15%比78.95%，P<0.05)； miR-26以2.28為界，將患者分為miR-26高表達(dá)組(24例)和低表達(dá)組(21例)，高表達(dá)組的5年總生存率顯著低于低表達(dá)組(50.00%比71.43%，P<0.05)；miR-141以1.65為界，將患者分為miR-141高表達(dá)組(22例)和低表達(dá)組(23例)，高表達(dá)組的5年總生存率顯著高于低表達(dá)組(68.18%比43.47%，P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 血清miR-21、miR-26及miR-141與結(jié)腸癌患者5年總生存率的關(guān)系 A 血清miR-21 B 血清miR-26 C 血清miR-141

2.5 預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析

將臨床分期、腫瘤分化程度、局部浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以及血清miR-21、miR-26、miR-141水平作為自變量進(jìn)行結(jié)腸癌預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析，結(jié)果顯示臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、局部浸潤(rùn)深度T3～T4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以及血清miR-21、miR-26高表達(dá)和miR-141低表達(dá)是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響因素分析

3 討論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)由于人口老齡化及人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，中國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[12]。盡管結(jié)腸癌的治療方法在不斷改進(jìn)，但仍有不少患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響了預(yù)后。研究顯示，早期結(jié)腸癌患者術(shù)后的5年生存率高達(dá)90%，而晚期患者卻低于10%[13]。因此，尋找高效的早期診斷標(biāo)志物對(duì)于延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間、提高生存質(zhì)量具有十分重要的意義。

目前，血清癌胚抗原水平是臨床上較為常用的診斷標(biāo)志物，但其用于結(jié)腸癌篩查的敏感度和特異度均較低，故亟需尋找敏感度和特異度均較高的結(jié)腸癌早期診斷標(biāo)志物[14]。miRNA近年來(lái)成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，研究表明miRNA在多種惡性腫瘤細(xì)胞和組織中表達(dá)異常，其可通過(guò)調(diào)控促癌基因或抑癌基因的表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后預(yù)測(cè)方面發(fā)揮著重要作用[15]。

既往研究表明，miR-26與多種惡性腫瘤關(guān)系密切，其通常發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用[11,16-17]。Liu等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，乳腺癌組織中的miR-26表達(dá)水平顯著升高，且與乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移相關(guān)。黃昌俊等[19]對(duì)46例肝內(nèi)膽管癌患者的組織標(biāo)本及不同肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)miR-26在肝內(nèi)膽管癌組織中呈高表達(dá)，可通過(guò)PTEN/Akt通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并且其高表達(dá)是影響肝內(nèi)膽管癌患者整體生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前miR-26與結(jié)腸癌的關(guān)系尚不完全清楚，本研究對(duì)結(jié)腸癌患者的血清miR-26水平進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組的血清miR-26水平顯著高于對(duì)照組，這說(shuō)明miR-26可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步通過(guò)ROC曲線分析血清miR-26用于結(jié)腸癌診斷的價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AUC為0.812、敏感度為82.6%、特異度為95.6%，這說(shuō)明血清miR-26檢測(cè)有助于結(jié)腸癌篩查。

研究表明，與單基因檢測(cè)相比，多基因聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率、敏感度及特異度均更高。余海婷[20]的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，結(jié)腸癌患者的血清miR-21表達(dá)顯著升高，ROC曲線分析結(jié)果顯示其診斷結(jié)腸癌的AUC、敏感度及特異度分別為0.82、75.6%、81.4%。王亞南等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-141診斷結(jié)腸癌的AUC為0.72。本研究中ROC曲線分析顯示，血清miR-21、miR-26及miR-141聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)腸癌的AUC、敏感度和特異度均優(yōu)于單項(xiàng)檢測(cè)。

為進(jìn)一步探討miR-26在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究分析了血清miR-26水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示miR-26與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這說(shuō)明血清中miR-26高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)行更深入的體內(nèi)外細(xì)胞研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-26水平升高還與結(jié)腸癌患者的臨床分期、腫瘤分化程度、局部浸潤(rùn)深度及5年總生存率有關(guān)，這說(shuō)明miR-26可以作為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究是單中心研究且樣本量較少，因此結(jié)果可能存在一定的局限性，今后將深入開(kāi)展多中心大樣本量的相關(guān)研究。

綜上所述，血清miR-26水平與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其可作為結(jié)腸癌早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，其與血清miR-21、miR-141聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能優(yōu)于單項(xiàng)檢測(cè)。