蘇晨玉， 胡 娜， 董 琦， 王洪倫，*

(1.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所/藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810008；2.青海省藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810008； 3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(Hippophae)植物，具有耐干旱、耐鹽堿、耐貧瘠性等特征[1-2]，并具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。沙棘含有黃酮類、三萜類、多糖和氨基酸等活性成分[3-4]，是一種藥食同源植物，在《晶珠本草》《藏藥志》等典籍中均有藥用記載。同時(shí)沙棘作為原料生產(chǎn)的副食品在市場(chǎng)上深受消費(fèi)者青睞，目前有沙棘酸奶、沙棘果醋、沙棘冰酒和沙棘咀嚼片等產(chǎn)品?，F(xiàn)階段對(duì)沙棘的研究主要集中于沙棘果和沙棘葉等方面[5-8]，對(duì)沙棘果加工過(guò)程中產(chǎn)生的大量沙棘果渣研究和利用較少，造成了資源的浪費(fèi)[9]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10-12]，沙棘果渣中也含有豐富的生物活性成分，因此具有極高的研究?jī)r(jià)值。

通過(guò)高效液相色譜法可測(cè)定沙棘中含有的三萜酸類化合物類型[13]。三萜酸類化合物中，五環(huán)三萜酸以游離或苷類形式廣泛存在于自然界，是沙棘中含量最豐富的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，分為烏蘇烷型、齊墩果烷型、羽扇豆烷型和木栓烷型4種結(jié)構(gòu)類型，代表化合物有熊果酸、科羅索酸、山楂酸、齊墩果酸和樺木酸[14]。五環(huán)三萜酸類化合物有廣泛的藥理和生物活性作用[15-17]，具有降血糖、護(hù)肝、抗腫瘤、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等功效。枇杷葉和夏枯草等植物中所含的熊果酸、科羅索酸和齊墩果酸通過(guò)對(duì)糖原磷酸化酶的抑制作用來(lái)降低血糖水平并對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出抑制活性[18-21]。沙棘果渣中三萜酸類化合物含量豐富，總?cè)扑岷靠蛇_(dá)11.605 mg/g[22]，并且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙棘果渣提取物對(duì)糖尿病大鼠表現(xiàn)出較好的療效[23]。

針對(duì)沙棘果渣利用率較低的現(xiàn)狀，本研究通過(guò)對(duì)沙棘果渣三萜酸進(jìn)行富集，提高各組分中三萜酸的含量，對(duì)富集組分中三萜酸成分進(jìn)行表征和含量測(cè)定，同時(shí)對(duì)其α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為沙棘果渣的進(jìn)一步深度開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘果渣，青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰?；甲醇(色譜純) ，德國(guó)Merck公司；制備分離用球形十八烷基鍵合硅膠填料(ODS- A- HG)，粒徑50 μm、孔徑12 nm，日本YMC公司；阿卡波糖，上海源葉科技有限公司；α-葡萄糖苷酶(酵母來(lái)源)，美國(guó)Sigma公司；對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AcquityTMultra型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Triple TOF5600+型飛行時(shí)間質(zhì)譜(配有電噴霧離子源，ESI)，美國(guó)AB SCIEX公司；Eppendorf minispan型離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；EPOCH2型酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1沙棘果渣三萜酸的提取

將干燥的沙棘果渣粉碎后，按料液比(kg/L)1∶10加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，加熱回流提取3次，提取溫度70 ℃，每次1.5 h，過(guò)濾后合并濾液。將濾液減壓濃縮，即得沙棘果渣乙醇浸膏，-20 ℃冷凍保存。

1.3.2沙棘果渣三萜酸的富集

稱取沙棘浸膏1.0 kg，加入2 L蒸餾水，60 ℃水浴加熱溶解，靜置沉淀后過(guò)濾，濾渣干燥后即得三萜酸粗提物。取干燥后的粗提物6.20 g，加入甲醇溶解后過(guò)濾，與ODS按照質(zhì)量比1.0∶1.5拌樣并干燥。裝入減壓玻璃柱，依次使用3～5倍柱體積的體積分?jǐn)?shù)20%、60%、80%、100%甲醇和氯仿- 甲醇溶液(體積比90∶10)按照流動(dòng)相極性由大到小進(jìn)行梯度洗脫。收集各部分餾分，并濃縮，干燥后即得不同極性富集物。

1.3.3沙棘果渣三萜酸含量的測(cè)定

使用香草醛冰乙酸法測(cè)定三萜酸含量，以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品在紫外波長(zhǎng)547 nm下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各富集組分的三萜酸含量[24]。

分別稱取干燥后的浸膏、粗提物、不同極性組分10.0 mg，加入少量甲醇溶解后，再加入無(wú)水乙醇定容至50 mL。每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取0.5 mL樣品溶液于具塞試管中，每種樣品取6份，3份為實(shí)驗(yàn)組，3份為對(duì)照組，置于沸水浴揮干溶劑后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均加入1.6 mL高氯酸，而后實(shí)驗(yàn)組加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的香草醛- 冰乙酸溶液0.4 mL，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均在70 ℃下反應(yīng)15 min，最后實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組分別加入8.0 mL和8.4 mL冰乙酸終止反應(yīng)，于547 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算三萜酸含量。

1.3.4HPLC-Q-TOF-MS/MS實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定

1.3.4.1 液相條件

稱取三萜酸含量最高的組分7.5 mg，1 mL甲醇- 水溶液(體積比80∶20)溶解后，過(guò)0.45 μm濾膜用于測(cè)試。色譜柱：Agilent SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇- 水溶液(體積比85∶15)，等度洗脫，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為30 ℃。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

負(fù)離子掃描模式，離子源溫度550～600 ℃；離子源電壓為4 500～5 500 V；掃描范圍m/z100～1 500。

1.3.5α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[25]的方法并改良，實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組、樣品組和樣品空白組，各反應(yīng)物按表1中的劑量加入96孔板，每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，將待測(cè)試劑、磷酸緩沖液和酶溶液混合均勻，在恒溫振蕩器中37 ℃保溫10 min，加入50 μL 0.5 mmol/LpNPG溶液，充分混勻，于37 ℃反應(yīng)10 min，最后加入50 μL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)式(1)計(jì)算各組α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC50。

(1)

式(1)中，AC為空白組吸光度，AB為對(duì)照組吸光度，AS為樣品組吸光度，ASB為樣品空白組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。差異顯著性分析采用Graph Pad 8.0軟件進(jìn)行，繪圖采用Origin 9.0軟件。

表1 酶活性抑制實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Design of enzyme activity inhibition experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘果渣三萜酸的富集與含量測(cè)定結(jié)果

通過(guò)ODS減壓富集共得6個(gè)不同的極性組分，分別命名為F1～F6。其中，20%甲醇洗脫為F1組分；60%甲醇洗脫為F2組分；80%甲醇洗脫為F3組分；純甲醇洗脫時(shí)，明顯分為2個(gè)不同顏色的色帶，其中首先被洗脫下來(lái)的色帶為F4組分，最后被洗脫下來(lái)的色帶為F5組分；氯仿- 甲醇洗脫得到的組分為F6。

以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=2.835 8x-0.019，R2=0.998 8，由此計(jì)算沙棘果渣各極性組分總?cè)扑岬暮?，如?。經(jīng)過(guò)富集共得三萜酸粗提物179.12 g，取6.20 g粗提物進(jìn)行減壓富集后，共得三萜酸含量較高的F3組分0.51 g，F(xiàn)4組分1.75 g，其三萜酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為63.24%和75.01%，說(shuō)明沙棘果渣中的三萜酸主要集中在低極性組分中，ODS減壓富集可快速高效地將化合物按照不同極性進(jìn)行富集，且具有較高的回收率，F(xiàn)4組分三萜酸回收率為51.30%。

表2 富集組分中三萜酸含量Tab.2 Triterpene acid contents in enriched components %

2.2 沙棘果渣富集組分F4的特征分析

由于F4組分三萜酸含量最高，故利用HPLC- Q- TOF- MS/MS對(duì)富集后的組分F4進(jìn)行了分析，以明確其特征成分，其液相色譜和總離子流圖分別如圖1和圖2。組分F4經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)主要含有11種五環(huán)三萜類化合物，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 組分F4的HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of component F4

根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，結(jié)合分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜碎片離子峰，推測(cè)出化合物類型?；衔?的m/z487 (M-H)-m/z469(M-H2O)豐度值較高，對(duì)比結(jié)果為化合物2α,3β,24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸。對(duì)比文獻(xiàn)[26]，化合物10和11為差向異構(gòu)體齊墩果酸和熊果酸，齊墩果酸由于相鄰2個(gè)甲基空間結(jié)構(gòu)的影響，造成m/z439(M2-H2O)-m/z421 (M3-H2O)豐度值較高；而熊果酸和化合物5中m/z411 (M3-HCOOH)-m/z393 (M4-H2O)和m/z455 (M3-HCOOH)-m/z409(M4-H2O)豐度值較為突出?；衔?與10、5與11間相對(duì)分子質(zhì)量相差16，且具有相同的裂解規(guī)律，因此，推測(cè)化合物4為山楂酸，化合物5為科羅索酸。化合物6～9比山楂酸相對(duì)分子質(zhì)量增加了146，結(jié)合文獻(xiàn)[27-30]和碎片峰信息可推測(cè)為香豆酰三萜酸，即化合物6～9分別為山楂酸和科羅索酸的衍生物。

圖2 組分F4的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of component F4

表3 HPLC- Q- TOF- MS/MS表征組分F4中的三萜酸

2.3 三萜酸提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性分析

不同極性組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，除組分F1抑制活性極顯著低于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖外，沙棘果渣粗提物及組分F2～F6均對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制活性，且都極顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組阿卡波糖。組分F4抑制活性最強(qiáng)，IC50僅為0.040 mg/mL；其次為組分F3，IC50為0.047 mg/mL。由于組分F1三萜酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他組分，因此其抑制活性較差，IC50大于2.000 mg/mL。結(jié)果表明，不同組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性與三萜酸含量呈正相關(guān)。

表4 不同組分對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度Tab.4 Semi-inhibitory concentration of different components mg/mL

3 結(jié) 論

目前對(duì)三萜酸類化合物的富集多采用大孔樹(shù)脂乙醇洗脫法。在純化過(guò)程中多采用水溶液進(jìn)行上樣吸附，由于提取液成分復(fù)雜，化合物極性較小等原因，樣品溶解性較差，容易造成樹(shù)脂的污染和堵塞，因此，上樣前需進(jìn)行預(yù)處理，且上樣濃度不能過(guò)大，導(dǎo)致富集效率較低[31-34]。本研究采用的ODS減壓洗脫法與固相萃取有類似之處，二者均為減壓條件下進(jìn)行梯度洗脫。蔣紅紅[35]研究發(fā)現(xiàn)，固相萃取法對(duì)白頭翁中的五環(huán)三萜皂苷類化合物的富集具有良好的回收率。ODS減壓洗脫法采用拌樣吸附進(jìn)行干法上樣，改善了樣品溶解性較差的問(wèn)題，并且增大了上樣量，ODS法的上樣量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于固相萃取法，再通過(guò)甲醇- 水溶液進(jìn)行梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)了不同極性組分的分離與富集。同時(shí)，該方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性。結(jié)果表明：ODS減壓洗脫法富集后，F(xiàn)4組分三萜酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到了75.01%，且具有較高的回收率，達(dá)到51.30%。同時(shí)結(jié)合液- 質(zhì)聯(lián)用色譜分析對(duì)F4組分所含三萜酸成分進(jìn)行表征，結(jié)果顯示：F4組分含有11種五環(huán)三萜類化合物，表明ODS減壓洗脫法對(duì)極性較小的五環(huán)三萜類化合物具有良好的富集效果。

研究發(fā)現(xiàn)：植物中的三萜酸類成分對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制活性，其中熊果酸對(duì)α-葡萄糖苷酶有顯著的抑制活性，其IC50僅為0.76 μg/mL，科羅索酸和齊墩果酸的IC50分別為1.14、1.27 μg/mL[36-37]，因此，推測(cè)F4組分中的熊果酸、科羅索酸和齊墩果酸這3種五環(huán)三萜對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制發(fā)揮了主要的作用。本研究通過(guò)一步步提高富集組分三萜酸含量，并進(jìn)行不同組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著三萜酸含量的提高，富集組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用也隨之增強(qiáng)，且顯著高于藥物對(duì)照組阿卡波糖，表明三萜酸類化合物具有降低糖尿病人餐后血糖的潛在活性。