王星星， 陳 洲， 韓盼盼， 劉楊柳， 李思霆， 賈英民

(北京工商大學 食品與健康學院， 北京 100048)

食源性腐敗微生物是引起食品變質的重要因素之一，而抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)被認為是極具應用潛力的新型生物防腐劑[1-2]，能抑制或殺死常見的食品腐敗菌和部分耐藥細菌等[3]，同時具有在生物體內不易殘留、無免疫原性等特點。研究表明：同種生物機體中具有抗菌活性的AMPs通常是由多種肽混合而成，組成AMPs的組分不同，其抗菌特性及抗菌效果也不同[4]。因此，改變AMPs的組分構成，對推廣AMPs的生產和應用具有深遠意義。

微生物源抗菌肽憑借發(fā)酵周期短、成本低廉、易于實現(xiàn)工業(yè)化等優(yōu)勢而備受關注，其中，氨基酸殘基數少于18個的小分子肽通常是由非核糖體肽合成酶催化形成[5]，該酶的A結構域具有特異性識別氨基酸或其衍生物(如L-苯丙氨酸[6]、L-纈氨酸[7]、L-蘇氨酸[8])的獨特功能，可以在一定程度上“掌控”微生物AMPs的氨基酸種類甚至組分結構。直接操縱A結構域以改變微生物分泌AMPs的種類還難以實現(xiàn)，但可通過添加外源氨基酸等特異性氨基酸或其衍生物來人工擴大A結構域的底物識別范圍，進而改變AMPs的組分構成。Isabelle等[9]在培養(yǎng)基中添加L-異亮氨酸，產生2種新的表面活性素；Iwase等[10]在培養(yǎng)基中添加氨基酸改變了伊枯草菌素A中同系物的比例；孫力軍等[11]在培養(yǎng)基中添加谷氨酸，選擇性促進了脂肽中芬介素組分的分泌。本研究以一株高產AMPs的優(yōu)良菌株——側孢短芽孢桿菌S62- 9(BrevibacilluslaterosporusS62- 9, BL)為研究對象[12-13]，該菌株能夠同時分泌5種不同結構的AMPs(分別命名為Brevilaterin A、B、C、D、E)，且各組分的抗菌特性也存在差異。通過前期探索發(fā)現(xiàn)，該菌分泌AMPs的組分會受到外源氨基酸很大的影響。目前，研究主要集中在探究添加一種或分別添加幾種氨基酸對AMPs組分合成的影響，而少有系統(tǒng)大量研究其對AMPs組分合成的影響。為此，本研究將系統(tǒng)探究外源氨基酸的存在對BL分泌AMPs組分產生的影響，希望為未來實現(xiàn)人工改變微生物合成新型、高效的AMPs奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗菌株：酶與蛋白質工程實驗室篩選的側孢短芽孢桿菌。

抗菌活性實驗用指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, ATCC 25923)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

主要試劑：分析純氨基酸(D/L-色氨酸、D/L-甲硫氨酸、D/L-纈氨酸、L-丙氨酸、L-甘氨酸、D-組氨酸、D/L-絲氨酸、L-羥脯氨酸、D/L-異亮氨酸、D/L-亮氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸、L-胱氨酸、L-脯氨酸、L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-谷氨酰胺、D-天冬氨酸、D/L-苯丙氨酸、L-鳥氨酸鹽酸鹽)及色譜純三氟乙酸，上海麥克林生化科技有限公司；分析純氨基酸衍生物(3-氨基丁酸、L-蛋氨酸亞砜、S-甲基-L-半胱氨酸、2-氨基丁酸、2-羥基-4-甲基戊酸、2-氧代-3-甲基丁酸、2-羥基-3-甲基丁酸、α-酮戊二酸)，上海源葉生物科技有限公司；色譜純乙腈，北京邁瑞達科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TGL- 20bR型離心機，上海飛鴿股份有限公司；Scan 4000型全自動菌落計數儀，法國Interscience公司；IF 260型培養(yǎng)箱，德國Memmert 公司；T6型新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1培養(yǎng)基配制

營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化鈉5。pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

營養(yǎng)肉湯瓊脂(NA)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化鈉5，瓊脂15。pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨12，氯化鋅0.008 6，氯化鈣1.38，吐溫20 1.0。pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3.2種子液制備

從斜面培養(yǎng)基中挑取適量BL劃線接種到NA培養(yǎng)基上，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。再挑取適量活化好的BL于50 mL NB培養(yǎng)基中，32 ℃、240 r/min搖床培養(yǎng)12 h，進行活化。

1.3.3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將活化好的種子液混勻，按體積分數4%的量分別接種于添加5 g/L不同氨基酸或其衍生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 ℃、240 r/min發(fā)酵培養(yǎng)24 h，以未添加氨基酸或其衍生物的為空白對照組。

1.3.4BL菌體量的測定

發(fā)酵完成后，分別取搖勻的發(fā)酵液2 mL，適當稀釋，采用紫外分光光度計測定600 nm波長下樣品的OD值，即為菌體量。

1.3.5發(fā)酵液抗菌活性及Brevilaterin組分的測定

樣品前處理：分別取添加不同氨基酸或其衍生物發(fā)酵的發(fā)酵液1.5 mL，8 000 r/min離心5 min(4 ℃)，取上清液用0.22 μm的無菌濾膜過濾備用。

發(fā)酵液抗菌活性的測定：采用瓊脂擴散法[14]，以金黃色葡萄球菌為指示菌，將活化至對數期的指示菌液稀釋至OD600為0.7～0.8，取稀釋后的菌液，以體積分數3%的量接種于45 ℃左右的NA培養(yǎng)基中，混勻，倒平板，待冷卻凝固，將無菌牛津杯置于平板上，分別加入50 μL上清液，于37 ℃培養(yǎng)12～16 h，全自動菌落計數儀測定抑菌直徑。將添加不同氨基酸或其衍生物的上清液的抑菌直徑記為A1，對照組抑菌直徑記為A0，抑菌直徑增長率計算見式(1)。

(1)

Brevilaterin組分的測定：采用高效液相色譜法[15]，色譜柱為InfinityLab Poroshell 120 EC- C18(4.6 mm×150 mm，4 μm)、XBridge?Peptide BEH C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)、XSelect?Peptide CSHTMC18(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流動相A為體積分數0.1%的TFA水溶液，流動相B為體積分數0.1%的TFA乙腈溶液，檢測波長為220 nm，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進樣量20 μL，洗脫流程見表1。

1.4 數據處理

實驗均重復3次，采用Excel 2019和Origin 8.1軟件進行數據處理。

表1 洗脫流程Tab.1 Elution process

2 結果與討論

2.1 L-氨基酸對發(fā)酵液抗菌活性及Brevilaterin組分構成的影響

2.1.1L-氨基酸對發(fā)酵液抗菌活性的影響

以菌體量為指標，考察了不同L-氨基酸對菌體生長情況的影響(表2)。結果顯示：18種L-氨基酸的添加在不同程度上影響了菌體生長。其中，與對照組相比，L-鳥氨酸鹽酸鹽的促進作用最明顯，其菌體量增加了54.97%，L-異亮氨酸和L-亮氨酸次之，分別為27.81%和26.49%；而L-甘氨酸對菌體生長呈明顯的抑制作用，其菌體量下降了39.07%。

同時，以抑菌直徑增長率為指標，考察了不同L-氨基酸對發(fā)酵液抗菌活性的影響(表2)。結果顯示：18種L-氨基酸對發(fā)酵液抗菌活性具有不同程度的影響。L-纈氨酸、L-鳥氨酸鹽酸鹽、L-甲硫氨酸的添加均能明顯提高發(fā)酵液抗菌活性，其中以L-纈氨酸的促進作用最強，其抑菌直徑的增長率達18.08%，L-鳥氨酸鹽酸鹽次之；而L-異亮氨酸和L-亮氨酸卻表現(xiàn)出較強的抑制作用，其抑菌直徑分別降低了13.52%和13.28%。

表2 不同L-氨基酸對發(fā)酵液抗菌活性的影響Tab.2 Effects of different L-amino acids on antibacterial activity of fermentation broth

2.1.2L-氨基酸對Brevilaterin組分構成的影響

外源添加L-氨基酸能夠顯著影響發(fā)酵液抗菌活性，而發(fā)酵液中AMPs的組分構成不同，表現(xiàn)出的抗菌活性也不同[11]，因此，本研究進一步通過HPLC分析了添加L-氨基酸后發(fā)酵液中Brevilaterin 組分構成的變化情況，見圖1(由于Brevilaterin A的含量很低，在文中不予以比較)。當未添加L-氨基酸發(fā)酵時，BL分泌的AMPs以Brevilaterin B、C和E為主。相比而言，添加L-鳥氨酸鹽酸鹽能選擇性提高Brevilaterin B、C和E的含量[圖1(a)]；而L-亮氨酸或L-異亮氨酸的添加卻使得Brevilaterin B、C、D和E的含量均顯著降低[以圖1(b)為例]；添加L-纈氨酸發(fā)酵后，Brevilaterin B、C、D和E之間的相對比例發(fā)生很大變化，Brevilaterin B的含量顯著降低，而Brevilaterin E未檢測出，同時還出現(xiàn)了多種未知組分[圖1(c)]；添加L-甲硫氨酸后，HPLC只能檢測到Brevilaterin B和C，二者間相對比例發(fā)生了反轉[圖1(d)]；而添加其余L-氨基酸對Brevilaterin的組分構成幾乎無影響。

小分子AMPs通常是由非核糖體肽合成酶催化形成，該酶是一個龐大的酶組體系，由多種具備不同催化功能的催化蛋白按特定空間順序排列而成，各模塊專一性催化對應單元并組裝到新生肽鏈當中[16]。其中，腺苷酰化酶主要負責特異性識別氨基酸底物，它可直接參與調控小分子肽結構中的氨基酸種類和數量[17]。從本研究結果來看，外源添加的氨基酸確實能顯著影響AMPs的分泌，推測原因是外源添加的氨基酸能為該酶組體系的催化合成提供更多的底物選擇，進而改變AMPs的組分構成。

氨基酸作為重要的生物小分子，在微生物發(fā)酵過程中對菌體生長及其次級代謝物的合成起著關鍵性作用[18]。董難等[19]發(fā)現(xiàn)：在培養(yǎng)基中添加L-谷氨酸不僅能促進Streptomycessp. M- Z18的生長，還能促進ε-聚賴氨酸的分泌。結合2.1.1節(jié)中添加L-氨基酸對菌體生長情況的影響，本研究發(fā)現(xiàn)：添加L-鳥氨酸鹽酸鹽不僅能促進菌體生長，還能選擇性促進Brevilaterin B、C和E的分泌。Wu等[20]報道，在培養(yǎng)基中添加L-酪氨酸會抑制伊枯草菌素A的分泌。本研究也發(fā)現(xiàn)，添加L-異亮氨酸或L-亮氨酸顯著抑制了Brevilaterin B、C、D和E的分泌。此外，Yulia[21]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加L-纈氨酸能明顯改變伊枯草菌素A中各組分間的相對比例。朱玲燕等[22]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸和L-纈氨酸均能選擇性提高表面活性素中C15組分的分泌量。孫力軍等[11]也發(fā)現(xiàn)添加L-谷氨酸發(fā)酵后，可產生3種新的表面活性素組分。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)：添加L-纈氨酸或L-甲硫氨酸能改變Brevilaterin初始組分間的相對比例；而添加L-甲硫氨酸能顯著促進Brevilaterin B的分泌，添加L-纈氨酸則產生了新的AMPs組分。添加L-鳥氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸或L-甲硫氨酸影響了發(fā)酵液中Brevilaterin的組分構成，進而表現(xiàn)出不同的抗菌活性。

圖1 不同L-氨基酸對Brevilaterin組分構成的影響Fig.1 Effects of different L-amino acids on component constitution of Brevilaterin

2.2 D-氨基酸對發(fā)酵液抗菌活性及Brevilaterin組分構成的影響

2.2.1D-氨基酸對發(fā)酵液抗菌活性的影響

考察了不同D-氨基酸對菌體生長情況的影響(表3)。結果顯示：D-組氨酸的促進作用最明顯，菌體量增加了46.56%，D-甲硫氨酸次之；但D-苯丙氨酸、D-絲氨酸和D-纈氨酸對菌體生長具有一定的抑制作用，其菌體量分別下降了30.53%、29.77%、11.45%。

D-氨基酸對發(fā)酵液抗菌活性影響的實驗結果顯示：添加D-組氨酸能明顯提高發(fā)酵液抗菌活性，抑菌直徑增長率為7.04%；而添加D-異亮氨酸、D-亮氨酸、D-纈氨酸、D-甲硫氨酸則表現(xiàn)出抑制作用，其中D-異亮氨酸、D-亮氨酸和D-纈氨酸的抑制作用最強，抑菌直徑分別降低了33.61%、23.14%、23.13%。

表3 不同D-氨基酸對發(fā)酵液抗菌活性的影響Tab.3 Effects of different D-amino acids on antibacterial activity of fermentation broth

2.2.2D-氨基酸對Brevilaterin組分構成的影響

圖2 不同D-氨基酸對Brevilaterin組分構成的影響Fig.2 Effects of different D-amino acids on component constitution of Brevilaterin

本研究進一步通過HPLC分析了添加D-氨基酸后Brevilaterin組分構成的變化情況(圖2)。添加D-組氨酸能選擇性提高Brevilaterin B、C和E的含量[圖2(a)]；添加D-纈氨酸后，HPLC只能檢測出Brevilaterin C和E，其含量均顯著降低[圖2(b)]；添加D-甲硫氨酸后，HPLC只能檢測出Brevilaterin B和C，其含量也顯著降低[圖2(c)]；添加D-亮氨酸和D-異亮氨酸后則均只檢測出一個新組分[以圖2(d)為例]；而添加其余D-氨基酸對Brevilaterin的組分構成幾乎無影響。添加D-組氨酸、D-異亮氨酸或D-亮氨酸、D-纈氨酸或D-甲硫氨酸影響了發(fā)酵液中Brevilaterin的組分構成，進而表現(xiàn)出不同的抗菌活性。此外，結合2.2.1節(jié)中添加D-氨基酸對菌體生長情況的影響，發(fā)現(xiàn)添加D-組氨酸不僅能夠促進菌體生長，還能選擇性促進Brevilaterin B、C和E的分泌。

廖福榮[23]發(fā)現(xiàn)在半合成培養(yǎng)基中添加L-纈氨酸可促進環(huán)孢菌素A的合成；相反，添加D-纈氨酸卻抑制了環(huán)孢菌素A的形成。Wu等[24]發(fā)現(xiàn)添加D-甲硫氨酸和D-苯丙氨酸能促進乳酸鏈球菌素的產生，但添加L型的氨基酸卻不產生任何影響。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)：添加L-氨基酸對Brevilaterin組分的影響不同于D-氨基酸。

2.3 氨基酸衍生物對發(fā)酵液抗菌活性及Brevilaterin組分構成的影響

2.3.1氨基酸衍生物對發(fā)酵液抗菌活性的影響

不同氨基酸衍生物對菌體生長情況的影響見表4。結果顯示：3-氨基丁酸的促進作用最明顯，菌體量增加了42.86%，2-氧代-3-甲基丁酸次之；而添加2-氨基丁酸、2-羥基-3-甲基丁酸或2-羥基-4-甲基戊酸卻表現(xiàn)出一定的抑制作用，菌體量分別下降了21.80%、12.78%、11.28%。

氨基酸衍生物對發(fā)酵液抗菌活性影響的實驗結果顯示：2-氧代-3-甲基丁酸的添加能顯著提高BL發(fā)酵液抗菌活性，其抑菌直徑增長率達8.83%；添加2-氨基丁酸則表現(xiàn)出顯著的抑制作用，其抑菌直徑降低了8.39%。

表4 不同氨基酸衍生物對發(fā)酵液抗菌活性的影響Tab.4 Effects of different amino acid derivatives on antibacterial activity of fermentation broth

2.3.2氨基酸衍生物對Brevilaterin組分構成的影響

本研究通過HPLC進一步分析了添加氨基酸衍生物后Brevilaterin組分構成的變化情況(圖3)。添加2-氧代-3-甲基丁酸后，HPLC檢測出多種未知組分，而Brevilaterin B、C、D、E均未檢測出[圖3(a)]；添加2-氨基丁酸后，HPLC只能檢測出Brevilaterin B和C，其含量也顯著降低[圖3(b)]；而添加其余氨基酸衍生物對Brevilaterin的組分構成幾乎無影響。

除添加氨基酸對AMPs的合成有影響外，某些氨基酸的衍生物同樣會對AMPs的合成產生重要影響。Traber等[25]發(fā)現(xiàn)加入2-氨基丁酸能促進環(huán)孢菌素A的合成，加入3-氨基丁酸卻抑制了其合成。Kobel等[26]發(fā)現(xiàn)添加D/L-α-氨基丁酸可抑制除環(huán)孢霉素A外的所有環(huán)孢霉素的形成。本研究結果表明：添加2-氧代-3-甲基丁酸能促進BL分泌多種新組分，添加2-氨基丁酸則抑制了Brevilaterin B和C的合成。添加2-氧代-3-甲基丁酸或2-氨基丁酸影響了發(fā)酵液中Brevilaterin的組分構成，進而表現(xiàn)出不同的抗菌活性。此外，結合2.3.1中添加氨基酸衍生物對菌體生長情況的影響，發(fā)現(xiàn)添加2-氧代-3-甲基丁酸不僅能促進菌體生長，還能產生新的Brevilaterin組分。

圖3 不同氨基酸衍生物對Brevilaterin組分構成的影響Fig.3 Effects of different amino acid derivatives on component constitution of Brevilaterin

3 結 論

本研究以BL分泌的Brevilaterin為對象，考察了18種L-氨基酸、9種D-氨基酸和8種氨基酸衍生物對BL發(fā)酵液抗菌活性及所產Brevilaterin組分的影響。結果表明：添加L-纈氨酸、L-鳥氨酸鹽酸鹽、L-甲硫氨酸、D-組氨酸和2-氧代-3-甲基丁酸均能提高發(fā)酵液抗菌活性，L-纈氨酸效果最明顯；而添加L/D-異亮氨酸、L/D-亮氨酸、D-纈氨酸、D-甲硫氨酸或2-氨基丁酸則相反。此外，這些氨基酸的添加均能改變Brevilaterin的組分構成。添加L-甲硫氨酸后發(fā)酵液中只能檢測到Brevilaterin B和C，且二者的相對比例也發(fā)生了反轉；而添加L-纈氨酸和2-氧代-3-甲基丁酸后還能促進BL分泌新的Brevilaterin組分?？梢?，外源氨基酸的加入既能提高發(fā)酵液的抗菌活性，又能改變AMPs的組分構成，研究旨在為未來人工調控微生物合成新型、高效AMPs提供理論依據。