鄭苗欣，張振偉，王雪婷，周偉堅(jiān)，莫轉(zhuǎn)林，莫美華**

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與實(shí)踐訓(xùn)練中心，廣東 廣州 510642）

作為一種傳統(tǒng)中藥，靈芝（Ganoderma lucidum）在我國有悠久的應(yīng)用歷史，具有抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等多種功效[1-5]。靈芝三萜是其最主要的功能活性成分之一，具有抗氧化、保肝護(hù)肝、增強(qiáng)免疫等多種藥理作用[6-8]。

靈芝三萜主要是從子實(shí)體或孢子粉中獲取。然而相較于菌絲體的培養(yǎng)，子實(shí)體及孢子粉的生產(chǎn)都更為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且成本較高，難以保證質(zhì)量與產(chǎn)量[9]。不同靈芝子實(shí)體含有的三萜種類不同[10]，靈芝菌絲體提取的三萜中含有子實(shí)體和孢子粉三萜中所沒有的7-O-乙基靈芝酸O[11-12]。因此，靈芝液體發(fā)酵作為高效生產(chǎn)靈芝三萜的方法受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[4，13-15]。

為優(yōu)化靈芝三萜提取工藝，采用超聲輔助提取法提取靈芝三萜，通過正交試驗(yàn)確定最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

靈芝菌株T0，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院應(yīng)用真菌試驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1，pH 自然。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g·L-1、玉米粉 10 g·L-1、麥麩 10 g·L-1、蛋白胨 5 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、MgSO4·7H2O 2 g·L-1，pH 自然。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

1.2.1 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-1D超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DSX-280A/LDZX-40高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ-500E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；101-3電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司；HH-2恒溫水浴鍋，江蘇金壇市宏華儀器廠；H2050R高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；YB-500A高速多功能粉碎機(jī)，上海力箭機(jī)械有限公司；AB204-N電子天平，上海Mettler-Toledo有限公司。

1.2.2 主要試劑

葡萄糖，廣州化學(xué)試劑廠；瓊脂，廣州環(huán)凱生物公司；磷酸二氫鉀，廣州化學(xué)試劑廠；硫酸鎂，天津市福晨試劑廠；蛋白胨，廣州展晨生物科技有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；冰乙酸，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；香草醛，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司。試劑均為分析純。

1.3 靈芝菌絲體的培養(yǎng)

1.3.1 菌種的活化培養(yǎng)

取活化的斜面菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，放入26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長滿平板。

1.3.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

使用1.1.2的液體培養(yǎng)基配方。玉米粉和麥麩加適量蒸餾水煮沸，用4層紗布過濾，將配方中其他成分加入濾液中溶解，并用蒸餾水定容。制備好的培養(yǎng)基裝入250 mL錐形瓶中，每瓶100 mL，加入15顆玻璃珠，121℃滅菌30 min，滅菌結(jié)束后冷卻備用。

1.3.3 接種和培養(yǎng)

用打孔器在長滿菌絲的平板培養(yǎng)基表面取直徑9 mm的圓片狀菌塊，接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，每瓶接種2塊；封口后放入26℃恒溫?fù)u床中，160 r·min-1培養(yǎng) 10 d。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)材料預(yù)處理

取培養(yǎng)10 d的液體發(fā)酵產(chǎn)物，用蒸餾水充分清洗菌絲體6次，抽濾，收集菌絲體；置于55℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中，烘干至恒重；粉碎機(jī)粉碎，過80目篩。

1.4.2 靈芝菌絲體三萜的提取工藝

靈芝三萜的提取采用超聲輔助醇提法。精確稱取1 g靈芝菌絲體干粉，加入95%乙醇溶液30 mL，50℃超聲浸提30 min，冷卻至室溫；將提取液真空抽濾，濾渣用適量95%乙醇充分洗滌，合并濾液；轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，即為樣品總?cè)铺崛∫骸?/p>

1.5 單因素試驗(yàn)

1.5.1 乙醇濃度

精確稱取1 g靈芝菌絲體干粉，分別加入30 mL濃度為80%、85%、90%、95%、100%的乙醇溶液；50℃、500 W超聲浸提30 min，冷卻至室溫；提取液真空抽濾，濾渣用適量相同濃度的乙醇充分洗滌，合并濾液；轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用相同濃度的乙醇定容至刻度。

1.5.2 提取時(shí)間

精確稱取1 g靈芝菌絲體干粉，加入30 mL95%的乙醇；50℃、500 W超聲浸提10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，冷卻至室溫；提取液真空抽濾，濾渣用適量95%乙醇充分洗滌，合并濾液；轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度。

1.5.3 料液比

精確稱取1 g靈芝菌絲體干粉，分別以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 加入 95%的乙醇溶液；50℃、500 W超聲浸提30 min，冷卻至室溫；提取液真空抽濾，濾渣用適量95%乙醇充分洗滌，合并濾液；轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度。

1.6 正交優(yōu)化試驗(yàn)

1.6.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C） 3個(gè)因素作為影響靈芝菌絲體三萜得率的工藝條件，設(shè)定3因素3水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factor and level of orthogonal test

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品為對照品，采用香草醛-冰乙酸-高氯酸法繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。

1.6.3 靈芝菌絲體三萜的測定及得率的計(jì)算

精確量取1 mL樣品總?cè)铺崛∫?，揮干乙醇后，采用和測定標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的操作方法，在560 nm波長下測定吸光度值，按每100克菌絲體干粉中提取到的總?cè)瓶藬?shù)計(jì)算。樣品三萜得率（w，%）的計(jì)算公式為：

式中：Y為提取液中總?cè)频馁|(zhì)量（μg）；M為樣品的質(zhì)量（mg）；V為樣品總?cè)铺崛∫旱捏w積（mL）。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)計(jì)算與處理使用SPSS 26和DPS 7.05軟件，圖片的繪制使用Origin 2018。所有試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對靈芝三萜得率的影響

不同乙醇濃度對靈芝三萜得率的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對靈芝菌絲體三萜得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of triterpenoid from Ganoderma lucidum mycelium

如圖1所示，當(dāng)其他條件相同時(shí)，在80%～95%范圍內(nèi)靈芝菌絲體三萜得率隨乙醇濃度的升高而顯著升高。三萜得率在乙醇濃度為95%時(shí)最高，為2.75%。靈芝中的三萜大都為醇溶性成分[17]，因而在相同體積下，乙醇濃度越高，三萜的得率越高。而當(dāng)乙醇濃度為100%時(shí)，三萜得率低于95%乙醇濃度，推測原因可能為100%乙醇濃度未能將極性較高的水溶性三萜提取出來[18]。

2.1.2 提取時(shí)間對靈芝三萜得率的影響

不同提取時(shí)間對靈芝三萜得率的影響見圖2。

圖2 提取時(shí)間對靈芝菌絲體三萜得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of triterpenoid from Ganoderma lucidum mycelium

如圖2所示，當(dāng)其他條件相同時(shí)，靈芝菌絲體三萜得率在50 min內(nèi)隨提取時(shí)間延長而升高。提取前30 min三萜得率增長率較低；隨著物料與溶劑的充分接觸，三萜得率從30 min開始明顯提高；提取50 min時(shí)三萜得率最高，達(dá)到2.74%，但得率增長率有所下降。這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長，除了三萜以外還有許多其他的物質(zhì)被提取出來，給三萜的浸提增加了阻礙[19]。此外，也可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長，三萜的生物活性也在逐步喪失[20]。綜合考慮成本，靈芝菌絲體三萜的最優(yōu)提取時(shí)間為40 min。

2.1.3 料液比對靈芝三萜得率的影響

不同料液比對靈芝三萜得率的影響見圖3。

圖3 料液比對靈芝菌絲體三萜得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of triterpenoid from Ganoderma lucidum mycelium

如圖3所示，當(dāng)其他條件相同時(shí)，三萜得率在料液比為1∶30時(shí)最大，達(dá)到2.68%；之后隨著提取溶劑的增加，三萜得率呈現(xiàn)下降的趨勢；因此，提取靈芝菌絲體三萜的最優(yōu)料液比為1∶30。由結(jié)果推測，當(dāng)提取溶劑較少時(shí)不利于超聲的空化作用及其在溶劑中的傳播速度，靈芝菌絲體細(xì)胞壁未被完全破壞，故而三萜得率較低[21]。料液比為1∶40、1∶50時(shí)得率降低，可能是因?yàn)樵谙嗤β氏?，提取溶劑的增加?dǎo)致超聲無法完全破壞細(xì)胞壁，三萜無法完全溶出[22]；或是因?yàn)槿埔鸦救艹黾?xì)胞，胞外、胞內(nèi)的三萜濃度相等[23]。

2.1.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）為變量，以靈芝菌絲體三萜得率為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal test

由表2可知，通過對極差R進(jìn)行比較，判斷各因素對靈芝菌絲體三萜得率的影響順序是：A＞B＞C，即乙醇濃度＞提取時(shí)間＞料液比。在對k值進(jìn)行對比后判斷3個(gè)因素的最佳組合是A2B2C3，即乙醇濃度85%、提取時(shí)間30 min、料液比1∶30。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到靈芝菌絲體三萜的平均得率為3.50%。

對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表3。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由表3方差分析結(jié)果可知，乙醇濃度對三萜得率的影響顯著，提取時(shí)間、料液比的影響不顯著。

2.2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，以560 nm測得的吸光度值為橫坐標(biāo)，齊墩果酸的質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。

圖4 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Fig.4 Standard curve of oleanolic acid

如圖4所示，三萜含量在0～100 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。得到的齊墩果酸線性回歸方程為：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.998 6。

3 討論與結(jié)論

劉奇等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在單因素試驗(yàn)中，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，三萜得率達(dá)到最高，這與此次試驗(yàn)得到的結(jié)果一致。推測當(dāng)其他條件相同，而料液比為1∶30時(shí)，超聲所產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動可使細(xì)胞壁完全破裂，三萜溶出量最大[21]。但乙醇濃度和提取時(shí)間的單因素試驗(yàn)結(jié)果卻和其他報(bào)道有較大差異，比如鄭士彬[24]試驗(yàn)得到的最佳乙醇濃度為75%，最佳提取時(shí)間為120 min；這可能與超聲功率和其他報(bào)道的試驗(yàn)條件不同有關(guān)。另外，試驗(yàn)使用的靈芝品種也不相同，不同品種的靈芝含有的三萜類型、含量具有很大差異[25-28]；而不同的提取條件會影響三萜的活性，且甾醇、皂苷、油酸等雜質(zhì)的溶出也會影響結(jié)果[29-31]。

在此優(yōu)化條件下靈芝菌絲體三萜平均得率為3.50%，高于正交試驗(yàn)中其他提取條件下的結(jié)果，驗(yàn)證條件可行。江和棟等[32]利用多種方法對靈芝孢子粉三萜進(jìn)行提取，超聲提取工藝下三萜得率為3.51%，與本試驗(yàn)中的三萜提取工藝相近，且三萜得率近乎相等。但劉奇等[23]通過正交試驗(yàn)得到最優(yōu)提取方案的三萜得率僅為0.71%；而劉世柱等[33]通過正交試驗(yàn)得到最優(yōu)提取方法的三萜得率達(dá)7.76%；可見三萜得率不僅與提取工藝有關(guān)，而且與選用的菌種有很大關(guān)系。不同的提取工藝對三萜得率有較大影響，但提取工藝對三萜結(jié)構(gòu)是否會產(chǎn)生影響進(jìn)而改變其功能活性的研究還尚未見相關(guān)報(bào)道，有待進(jìn)一步探討。

靈芝三萜不僅具有廣泛的生理活性和良好的應(yīng)用前景，且隨著人們對健康越來越重視，市場對靈芝三萜的需求量也在持續(xù)上升。雖然靈芝菌絲體液體發(fā)酵已大大減少了生產(chǎn)過程中所耗費(fèi)的人力物力，但仍不足以滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。因此，試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究靈芝菌絲體三萜的提取工藝具有重要意義，也為靈芝三萜的開發(fā)奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。