呂達(dá)，楊慧楠，劉春城，b，王樂，趙宏宇，b，蔡祿，b

內(nèi)蒙古科技大學(xué) a.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 b.內(nèi)蒙古自治區(qū)功能基因組生物信息學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭 014010

塵肺病是因?yàn)榛颊唛L期接觸生產(chǎn)性粉塵，呼吸系統(tǒng)的清除和防御機(jī)制受到損害，進(jìn)而引起肺組織纖維化［1］。目前塵肺病發(fā)病機(jī)制尚未解釋清楚，所以一旦確診，臨床上沒有根治的方法［2］。

有研究表明，塵肺病發(fā)病與炎癥反應(yīng)等免疫響應(yīng)具有密切的關(guān)系［3］。二氧化硅（SiO2）進(jìn)入肺部首先作用于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，促使這些細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，引起血小板聚集，促進(jìn)血管擴(kuò)張和增加血管滲透性，使炎癥細(xì)胞聚集到損傷部位［4］。在塵肺病發(fā)病初期和發(fā)病末期均有巨噬細(xì)胞誘發(fā)炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞能夠合成并且釋放腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6 等炎癥因子。隨著炎癥的發(fā)展，肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放促纖維化和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）。TGF-β具有多種功能，通過刺激成纖維細(xì)胞以及肌成纖維細(xì)胞分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)以及調(diào)控蛋白多糖的表達(dá)參與塵肺病的發(fā)病過程［5］。

氧化應(yīng)激反應(yīng)在纖維化發(fā)生發(fā)展階段扮演了非常重要的角色［6］。人類肺組織相較于其他器官暴露于更高濃度的氧環(huán)境中，更容易受到氧化應(yīng)激的損傷。當(dāng)體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過多或抗氧化能力不足時(shí)，過量的ROS 存在于組織或細(xì)胞內(nèi)，可以誘發(fā)氧化應(yīng)激，將導(dǎo)致肺組織的損傷。Matsuzawa 等［7］通過檢測血清氧化應(yīng)激標(biāo)志物，得出了纖維化進(jìn)展過程中存在氧化/抗氧化失衡的結(jié)論。氧化應(yīng)激可以通過刺激相關(guān)基因表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和死亡，進(jìn)而促進(jìn)肺纖維化。

肺組織中膠原纖維的生成與聚集是塵肺病的標(biāo)志［8］。細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和纖維灶的形成是肺纖維化的標(biāo)志性特征。I型膠原和α-平滑肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肺內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)中的重要成分和特征性標(biāo)志物。纖維灶主要是由活化的肌成纖維細(xì)胞組成，肌成纖維細(xì)胞能夠合成膠原、α-SMA 等細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。有研究人員通過對(duì)間質(zhì)性肺炎活檢分析發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞死亡后，肺泡表面基底膜脫落，在成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞等間充質(zhì)細(xì)胞中會(huì)大量合成新的細(xì)胞外基質(zhì)，從而加速肺部纖維化［9］。

目前，同時(shí)從炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及膠原沉積三個(gè)方面綜合研究粉塵顆粒導(dǎo)致肺纖維化的工作較少，而這對(duì)于理解塵肺病的致病機(jī)理具有重要的意義。鑒于此，本研究擬對(duì)染塵后的小鼠進(jìn)行為期56 d 的實(shí)驗(yàn)，在此期間對(duì)不同染塵時(shí)間的小鼠樣本進(jìn)行病理學(xué)研究，同時(shí)測定炎癥因子、氧化應(yīng)激因子以及膠原形成相關(guān)的基因mRNA 的表達(dá)量，為塵肺病的發(fā)病機(jī)制研究提供一定的依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010；動(dòng)物飼養(yǎng)溫度控制在25℃左右，空氣濕度50%～60%，光照時(shí)間晝夜交替各12 h；適應(yīng)飼養(yǎng)7 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，審批號(hào)為NMGKJDX-2017-03。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器Nanodrop 2000 紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher 科技公司，美國），Eclipse Ti-U 熒光倒置顯微鏡（尼康株式會(huì)社，日本），Synergy HT 多功能酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司，美國），實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）。

1.2.2 主要試劑TNF-α、TGF-β、成纖維生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、ROS、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的酶免試劑盒（江蘇南京晶美生物科技有限公司，中國）；蘇木素-伊紅染色（haematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、Masson 染色試劑盒、羥脯氨酸（北京索萊寶有限公司，中國）；直徑1～5 μm 的SiO2粉末（Sigma公司，美國）；總RNA 提取試劑（RNAiso Plus）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScpriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（TB GreenTMPremix EX TaqTMⅡ，TaKaRa 公司，日本）；Col1a2基因和α-SMA基因擴(kuò)增引物（蘇州金維智公司，中國），其他試劑（分析純，國藥集團(tuán)，中國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 構(gòu)建小鼠模型根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定染塵劑量。將35只SPF級(jí)C57BL/6小鼠（雄性、體重約20～25 g、8～10 周）隨機(jī)分成空白對(duì)照組（5 只）、生理鹽水對(duì)照組（10只）、20 g·L-1SiO2染塵組（10 只）、60 g·L-1SiO2染塵組（10 只）共4 組。采用非氣管暴露法構(gòu)建小鼠模型，每只小鼠灌注SiO2的量為50 mg·kg-1和150 mg·kg-1（以小鼠體重計(jì)），用無菌的生理鹽水配制20 g·L-1和60 g·L-1的SiO2懸濁液，按照小鼠體重灌注不同體積的SiO2懸濁液［8-9］。分別于第0天和第14天進(jìn)行二次灌注。

1.3.2 樣本采集空白對(duì)照組全部在第28天處死，其余各組小鼠分別于第28 天和第56 天處死。用剪刀鑷子剪開胸腔，分離出肺組織，然后用生理鹽水將肺組織沖洗干凈，濾紙拭干。將左肺葉剪下浸泡在4%（體積分?jǐn)?shù)，后同）的多聚甲醛溶液。

1.3.3 HE 與Masson 染色將小鼠肺組織浸泡在4%的多聚甲醛固定液中24 h 后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片操作，然后按照索萊寶HE 染色和Masson 染色步驟進(jìn)行染色操作，將染好色的切片放到光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照記錄并比較不同樣本間的差異。

1.3.4 肺組織TGF-β、TNF-α、FGF測定采用ELISA法測定，TGF-β 和FGF 的檢出限為0.337 5 ng·g-1，TNF-α 的檢出限為0.27 ng·g-1。首先將肺組織切成小塊，加入適量pH為7.4的磷酸鹽緩沖液。用勻漿器將樣本研磨充分，3 000 r·min-1（離心半徑10 cm）離心20 min，收集上清液待測。檢測過程按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行，結(jié)果以每克濕肺組織中含上述因子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（后稱含量）表示。

1.3.5 血清中SOD、ROS、MDA測定采用ELISA測定血清中SOD、ROS、MDA，SOD 檢出限為0.105 μg·L-1，ROS檢出限為0.3 U·L-1，MDA 的檢出限為0.03 μmol·L-1。小鼠眼球取血，室溫血液自然凝固20 min，2 500 r·min-1（離心半徑10 cm）離心20 min，收集到的上清液即為血清。檢測過程按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行。

1.3.6 羥脯氨酸含量檢測稱取約20 mg 肺組織于消解管中，按照200 μL∶20 mg（鹽酸：肺組織）的比例加入6 mol·L-1鹽酸，煮沸3 h后16 000 r·min-1（離心半徑10 cm）離心20 min，然后用10 mol·L-1的氫氧化鈉溶液中和至pH值為7，加蒸餾水定容至400 μL，用分光光度計(jì)在560 nm波長下測得光密度（D）值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算每克濕肺組織含羥脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（后稱含量）。

1.3.7 Col1a2 基因和α-SMA 基因表達(dá)檢測將小鼠肺組織用液氮研磨充分加入1 mL TaKaRa 公司的RNAiso Plus，然后按照總RNA 提取試劑的說明書步驟進(jìn)行RNA 提取，分光光度計(jì)檢測所得到的總RNA 濃度和純度，再按反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA鏈，以cDNA 鏈作為模板鏈，GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)定為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，57℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。以基因GAPDH為內(nèi)參，以生理鹽水對(duì)照組為基準(zhǔn)，通過處理組目的基因與內(nèi)參基因的Ct差值（?Ct處理）減去對(duì)照組目的基因與內(nèi)參基因的Ct差值（?Ct對(duì)照），得出??Ct，然后以2-??Ct值計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)相對(duì)量。引物序列見表1。

表1 RT-PCR 分析的引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 進(jìn)行分析，使用±s描述，組間差異采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化

光鏡下觀察HE 染色的切片結(jié)果（圖1）：生理鹽水對(duì)照組組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔均勻，無間質(zhì)纖維組織增生。20 g·L-1和60 g·L-1兩組小鼠染塵第28 天時(shí)，肺部結(jié)構(gòu)被破壞，肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)有大量的細(xì)胞浸潤；當(dāng)染塵到第56 天時(shí)，小鼠肺部炎性細(xì)胞有所減少，血管壁增厚，形成明顯的纖維結(jié)節(jié)。

圖1 小鼠肺組織HE染色結(jié)果Figure 1 HE staining results of lung tissues of mice

2.2 肺組織中炎癥因子水平的變化

炎癥因子檢測結(jié)果顯示（圖2）：空白對(duì)照組小鼠肺組織中，TGF-β、FGF 和TNF-α 含量分別是1.09、3.63、3.13 ng·g-1，與空白對(duì)照組相比，生理鹽水組小鼠在第28 天和第56 天時(shí)肺組織中3 種炎癥因子的含量均無明顯變化（P＞0.05）；20 g·L-1和60 g·L-1染塵組小鼠在染塵至第56 天時(shí)，TGF-β、FGF、TNF-α 含量分別是3.42、3.62 ng·g-1，15.20、19.78 ng·g-1和9.02、11.30 ng·g-1，較生理鹽水組均有增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 小鼠肺組織炎癥因子檢測結(jié)果Figure 2 Inflammatory factor levels in lung tissues of mice

2.3 血清中氧化應(yīng)激水平指標(biāo)的變化

氧化應(yīng)激因子檢測結(jié)果顯示（圖3）：空白對(duì)照組小鼠血清中，MDA、ROS 和SOD 的水平分別是0.19 μmol·L-1、7 U·L-1和0.58 μg·L-1；與空白對(duì)照組相比，在第28、56天時(shí)生理鹽水組小鼠血清中上述3種因子水平均無明顯變化（P＞0.05）；20 g·L-1染塵組小鼠在染塵第28、56天時(shí)，MDA濃度為0.23、0.26 μmol·L-1，ROS水平均為11、11 U·L-1，SOD質(zhì)量濃度為0.43、0.44 μg·L-1；60 g·L-1染塵組小鼠在染塵第28、56 天時(shí)，MDA 濃度為0.28、0.34 μmol·L-1，ROS 水平為13、14 U·L-1，SOD 質(zhì)量濃度為0.38、0.36 μg·L-1；在染塵第28、56 天時(shí)，兩個(gè)染塵組小鼠血清中MDA、ROS 水平增加，SOD 水平下降，與生理鹽水組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 小鼠血清中氧化應(yīng)激因子檢測結(jié)果Figure 3 Oxidative stress factor levels in serum of mice

2.4 肺組織中膠原含量的變化

如圖4所示：在第28、56 天時(shí)，生理鹽水組小鼠肺組織羥脯氨酸含量均為0.15 mg·g-1，與空白對(duì)照組（0.12 mg·g-1）相比無差異（P＞0.05）；在染塵第28、56 天時(shí)，20 g·L-1染塵組小鼠，羥脯氨酸含量為0.25、0.28 mg·g-1；60 g·L-1染塵組為0.32、0.43 mg·g-1，較生理鹽水對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如圖5所示：Masson 染色可將膠原纖維染成藍(lán)色，肌纖維染成紅色，隨著纖維化進(jìn)程加重，膠原纖維累積；生理鹽水組有少量藍(lán)色，SiO2染塵組明顯比生理鹽水組藍(lán)色范圍更加廣闊。通過檢測基因表達(dá)量可知（圖6）：相較于生理鹽水組，60 g·L-1染塵組小鼠在第28 天時(shí)，Col1a2和α-SMA基因表達(dá)量分別上升至1.62倍和2.05倍；在第56天時(shí)，上升至3.08倍和3.34倍。

圖4 小鼠肺組織中羥脯氨酸含量檢測結(jié)果Figure 4 Hydroxyproline levels in lung tissues of mice

圖5 小鼠肺組織Masson染色結(jié)果Figure 5 Masson staining results of lung tissues of mice

圖6 肺組織中Col1a2（A）和α-SMA（B）基因mRNA表達(dá)水平Figure 6 mRNA expression levels of Col1a2 (A) and α-SMA (B)in lung tissues of mice

3 討論

本研究的結(jié)果表明，在小鼠染塵后肺組織出現(xiàn)了纖維化的特征。染塵組小鼠肺組織中出現(xiàn)了血管壁增厚現(xiàn)象，肺部形成了纖維結(jié)節(jié)；隨著染塵時(shí)間的延長，炎癥因子和氧化應(yīng)激因子的含量出現(xiàn)不同程度的增加；羥脯氨酸含量的增加表明肺組織中積累過量SiO2后可導(dǎo)致肺部膠原纖維增多；α-SMA和Col1a2基因表達(dá)水平明顯升高，Masson 染色顯示染塵組的小鼠肺組織中染藍(lán)區(qū)域增多，同樣說明肺組織中出現(xiàn)了膠原纖維增多的現(xiàn)象。以上結(jié)果可以看出，小鼠肺內(nèi)SiO2染塵可導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)纖維化的癥狀。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，小鼠染塵進(jìn)行到第56 天時(shí)，TGF-β、TNF-α、FGF 含量均隨著SiO2濃度增加而增加，說明SiO2在小鼠肺部沉積能夠引發(fā)明顯的炎癥反應(yīng)；而染塵至第28 天時(shí)，僅有高濃度染塵組小鼠TGF-β 略有升高。有研究顯示塵肺病患者在病理學(xué)上的最初表現(xiàn)為肺泡炎癥，此時(shí)大量炎性細(xì)胞向肺內(nèi)浸潤活化，釋放多種具有生物活性的細(xì)胞因子［10］；也有研究將塵肺病的發(fā)展過程分為正常期、炎癥期、進(jìn)展期和纖維化期四個(gè)時(shí)期［11］。在本實(shí)驗(yàn)小鼠染塵至第28 天時(shí)可能正處于纖維化的誘發(fā)階段，故而出現(xiàn)上述結(jié)果。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可判斷染塵至第56 天時(shí)小鼠肺組織局部已經(jīng)形成了纖維化，3 種細(xì)胞因子的含量均增加，說明這3 種因子在纖維化的形成過程中可能都發(fā)揮了重要的功能。有研究人員同樣發(fā)現(xiàn)在SiO2染塵大鼠肺纖維化進(jìn)程中TGF-β、TNF-α、FGF 等細(xì)胞因子水平明顯增加［3］。這些結(jié)果均表明，炎癥反應(yīng)在塵肺病發(fā)生發(fā)展過程具有非常重要的作用，免疫響應(yīng)分泌的炎癥因子對(duì)后續(xù)肺纖維化可能起到了重要的促進(jìn)效應(yīng)。

除了炎癥反應(yīng)之外，氧化應(yīng)激反應(yīng)也參與了肺纖維化的過程［12］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，當(dāng)SiO2在肺部累積刺激肺組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激因子，ROS隨著纖維化進(jìn)程最高提升至近2倍；小鼠染塵后MDA提高到1.78倍，SOD 含量最多降低了38%。正常的肺穩(wěn)態(tài)需要細(xì)胞內(nèi)外氧化物和抗氧化物的平衡，自由基在塵肺病患者肺部積累引起自由基對(duì)機(jī)體長期、反復(fù)的損害，促進(jìn)肺纖維化的形成［13］。有研究表明，小鼠血清中MDA 含量的升高加重了氧自由基對(duì)機(jī)體的損害；而SOD 水平隨著染塵時(shí)間延長而降低，意味著小鼠肺組織纖維化程度加深，體內(nèi)清除氧自由基能力減弱［14］。也是學(xué)者發(fā)現(xiàn)隨著慢性阻塞性肺疾病患者病情的加重，機(jī)體中出現(xiàn)了氧化應(yīng)激反應(yīng)［15］。這些結(jié)果表明機(jī)體氧化應(yīng)激失衡與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)從Masson 染色、羥脯氨酸含量變化和α-SMA和Col1a2基因表達(dá)水平的角度表明了SiO2的刺激會(huì)促使肺組織中膠原累積導(dǎo)致肺纖維化。肺纖維化組織中膠原蛋白、彈性蛋白和纖維連接蛋白等成分的聚集會(huì)促使膠原纖維的形成［16］。也有研究表明，通過非氣管暴露法灌注博來霉素可導(dǎo)致大鼠α-SMA的表達(dá)水平和膠原含量明顯升高［14］。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著染塵時(shí)間的延長，炎癥反應(yīng)更劇烈，氧化應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)增強(qiáng)，膠原累積量逐漸增多，這些因素異常升高對(duì)肺纖維化的進(jìn)程起到了促進(jìn)作用。從這三個(gè)角度出發(fā)研究SiO2致肺纖維化的生物學(xué)效應(yīng)，可為塵肺病致病機(jī)理的理解和后期治療提供一定的參考價(jià)值。