伊夢楠，臧丹，2，易娟，劉帥，周偉，王俊程，沈美麗，王婷，段化偉，黃先青，戴宇飛

1.中國疾病預(yù)防控制中心，職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所/化學(xué)污染物與健康重點(diǎn)實驗室，北京 100050

2.北京市豐臺區(qū)市場監(jiān)督管理局，北京 100050

3.深圳市職業(yè)病防治院，廣東 深圳 510000

三氯乙烯是一種無色易揮發(fā)的有機(jī)溶劑，具有良好的去污、脫脂能力，主要用于去除金屬部件的雜質(zhì)以及織物清潔和染色等各種工藝中。鑒于其溶劑特性，三氯乙烯可以通過吸入和皮膚接觸進(jìn)入人體［1］。流行病學(xué)調(diào)查顯示職業(yè)暴露于三氯乙烯是導(dǎo)致職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎（trichloroethylene-induced hypersensitive dermatitis，TIHD）發(fā)生的直接原因［2］，職業(yè)性三氯乙烯暴露后2 周至2 個月出現(xiàn)四肢、面部、頸部或軀干皮疹，伴有不同程度的發(fā)燒、淋巴結(jié)腫大等［3］。機(jī)體暴露于三氯乙烯后，三氯乙烯經(jīng)由肝臟細(xì)胞色素P450氧化代謝等通路生成的代謝產(chǎn)物為三氯乙醛和水合氯醛，后經(jīng)由醇脫氫酶和醛脫氫酶催化生成三氯乙醇和三氯乙酸［4］；而水合氯醛在機(jī)體內(nèi)能夠被乙醇脫氫酶迅速代謝為三氯乙酸和三氯乙醇，導(dǎo)致水合氯醛在血液和尿液中含量均較低。研究證實三氯乙醇是機(jī)體內(nèi)三氯乙烯和水合氯醛的主要代謝產(chǎn)物［5］；三氯乙酸也被認(rèn)為是引起肝損傷的三氯乙烯主要代謝產(chǎn)物［4］。目前國內(nèi)外針對三氯乙烯代謝產(chǎn)物三氯乙酸和三氯乙醇是否參與TIHD的發(fā)病過程存在爭議［5］，因此本研究擬分為兩部分，第一部分為體外細(xì)胞實驗：受試物為三氯乙酸和三氯乙醇，體外實驗選取人髓系白血病單核細(xì)胞株（THP-1），檢測三氯乙烯代謝產(chǎn)物對炎癥因子白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和一氧化氮（nitric oxide，NO）合成過程中重要的限速酶誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的影響。第二部分為人群研究：檢測三氯乙酸和三氯乙醇對TIHD患者外周血單個核細(xì)胞增殖能力的影響，從代謝角度解析三氯乙烯誘發(fā)致敏反應(yīng)起始階段的關(guān)鍵分子。

1 對象與方法

1.1 主要試劑及儀器

三氯乙酸、三氯乙醇、DMSO（Sigma，美國）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素（Gibco，美國）；兔抗人 iNOS 多克隆抗體（Abcam，英國）；山羊抗兔抗體（北京中杉金橋試劑，中國）；高效化學(xué)發(fā)光試劑盒（Santa Cruz，美國）；DC 蛋白測定試劑盒、酶標(biāo)儀（Bio-Rad，美國）；異丙醇、甲醇、電泳液、電轉(zhuǎn)液等試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.2 體外細(xì)胞實驗

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)THP-1細(xì)胞株購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。配制含有10%～15%（體積分?jǐn)?shù)，后均相同）胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)THP-1 細(xì)胞，每隔24 h 觀察細(xì)胞形態(tài)。待細(xì)胞數(shù)量達(dá)到顯微鏡視野下80%左右時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 THP-1 細(xì)胞存活率的檢測用CCK-8 法檢測各處理組中細(xì)胞相對存活率。調(diào)整THP-1 細(xì)胞密度為2×105個·mL-1，將2×104個THP-1 細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)，并設(shè)置至少3 個平行孔，設(shè)置空白組、對照組及染毒組，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h。每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。設(shè)置酶標(biāo)儀波長為450 nm檢測每孔光密度（D）值，按照公式：細(xì)胞相對存活率=（D染毒組-D空白組）/（D對照組-D空白組）×100%，計算不同濃度三氯乙酸和三氯乙醇對細(xì)胞存活率的影響。

1.2.3 THP-1 細(xì)胞IL-8 表達(dá)的檢測用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個·mL-1，取2 mL 細(xì)胞懸液接種于6 孔板中；根據(jù)文獻(xiàn)［6］報道和細(xì)胞對化學(xué)物的敏感性設(shè)置三氯乙酸和三氯乙醇的染毒劑量均為：0、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol·L-1，各濃度組均設(shè)置3 個平行孔，培養(yǎng)48 h 后，分離細(xì)胞上清和細(xì)胞。利用細(xì)胞上清液檢測IL-8 表達(dá)水平，利用細(xì)胞提取全蛋白進(jìn)行Western blotting檢測。

1.2.4 THP-1 細(xì)胞內(nèi)iNOS 表達(dá)的檢測每個染毒處理組細(xì)胞用2 mL PBS 清洗3 遍后，加入250 μL 的RIPA裂解液，渦旋混勻，冰上充分裂解2 h，14 000×g離心15 min 后取上清為全蛋白。每組蛋白定量吸取35 μg，并與5×上樣緩沖液按照4∶1 的比例混勻，配制上樣體系體積為20 μL，100℃水浴加熱10 min。配制10%的凝膠，加入5 μL 的蛋白marker 和10 μL 的各處理組蛋白，60 V 電泳1 h 后轉(zhuǎn)為90～110 V 繼續(xù)電泳1～2 h；250 mA轉(zhuǎn)膜2.5 h。轉(zhuǎn)膜完成后，PVDF膜浸泡于10～15 mL 1×TBST 中搖床漂洗10 min×3 次；用5%脫脂奶粉溶液浸泡PVDF 膜，室溫封閉1 h；稀釋比為1∶500的iNOS抗體4℃冰箱孵育過夜或超過12 h。漂洗PVDF 膜10 min×3 次。以1∶5 000 比例稀釋二抗，室溫孵育1 h后，水平搖床漂洗PVDF 膜10 min×3 次。加入化學(xué)發(fā)光試劑曝光后，以β-actin為內(nèi)參，采用Image pro plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 TIHD患者研究

1.3.1 研究對象選擇標(biāo)準(zhǔn)研究對象共57人，分為4組。非接觸對照組：20人，選擇深圳職業(yè)病防治院體檢科上崗前健康體檢結(jié)果處于正常范圍的職業(yè)工人，均未接觸過三氯乙烯，排除職業(yè)性有機(jī)溶劑接觸史及藥物食物過敏史；接觸對照組：20人，選擇與病例同車間同工種接觸三氯乙烯但未發(fā)病的健康工人，排除藥物食物過敏史；病例組：共17 人，選擇2008—2010年在深圳市職業(yè)病防治院進(jìn)行治療的TIHD 患者，均為按照GBZ 185—2006《職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》臨床確診的病例，有明確三氯乙烯接觸史，接觸時間不超過3 個月，平均約30 d，排除其他藥物食物過敏史，發(fā)病前2 周均無藥物服用史；其中10 人正在接受治療，為入院病例組，另7人激素用量減至每天2 mg或停用，血常規(guī)和肝功能檢查未發(fā)現(xiàn)異常，身體各項機(jī)能均基本恢復(fù)，為出院病例組。所有研究對象經(jīng)過詳細(xì)的人口學(xué)調(diào)查以及職業(yè)病接觸史、既往疾病史、家族遺傳病史等資料收集，均排除糖尿病、哮喘、過敏性皮炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、遺傳性過敏性疾病等免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病以及其他類似的職業(yè)有害因素接觸史和藥物食物過敏史。本研究已經(jīng)中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：無）。

1.3.2 研究對象外周血單個核細(xì)胞存活率的測定采集所有被納入人員晨起空腹肘靜脈血5 mL，1∶1 加入淋巴細(xì)胞分離液，800×g離心20 min 后，小心吸取淋巴細(xì)胞層，加入2 倍體積的PBS 混勻，300×g離心10 min 后，收集沉淀即為外周血單個核細(xì)胞，用含有10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，調(diào)節(jié)各組細(xì)胞濃度為1×106個·mL-1接種于96 孔板，加入0.5 mmol·L-1和2 mmol·L-1的三氯乙酸和三氯乙醇后，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h，檢測細(xì)胞存活率，方法同“1.2.2”。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

IL-8 數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布和方差齊性，采用完全隨機(jī)化設(shè)計的多組獨(dú)立樣本的秩和檢驗（Kruskal-Wallis 法）進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)采用M（Min，Max）表示。其他符合正態(tài)分布和方差齊性的指標(biāo)，采用方差分析比較，組間比較采用LSD 法，數(shù)據(jù)采用±s表示。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 THP-1細(xì)胞實驗結(jié)果

2.1.1 THP-1 細(xì)胞相對存活率和IL-8 的表達(dá)水平與對照組相比，0.5 mmol·L-1三氯乙酸和三氯乙醇組細(xì)胞存活率略有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；1.0 mmol·L-1及以上劑量組，隨著三氯乙酸和三氯乙醇濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低；IL-8 表達(dá)水平逐漸增多，表現(xiàn)為劑量依賴性（均P＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度三氯乙酸和三氯乙醇對細(xì)胞存活率和IL-8的影響（n=3）Table 1 Effects of different concentrations of trichloroacetic acid and trichloroethanol on cell survival rates and IL-8 (n=3)

2.1.2 THP-1 細(xì)胞iNOS 的表達(dá)水平與對照組相比，0.5 mmol·L-1三氯乙酸和三氯乙醇組iNOS 表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；隨著染毒濃度增高，1.0、2.0、4.0 mmol·L-1三氯乙酸組iNOS 的表達(dá)水平分別增高93.73%、87.08%、238.06%（P＜0.05），1.0、2.0、4.0 mmol·L-1三氯乙醇組iNOS 的表達(dá)水平分別增高95.99%、486.29%、735.72%（P＜0.05）；但1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1三氯乙酸兩個處理組之間iNOS 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度受試物對THP-1 細(xì)胞iNOS表達(dá)水平的影響Figure 1 Effects of different concentrations of trichloroacetic acid and trichloroethanol on iNOS expression in THP-1 cells

2.2 職業(yè)接觸人群的研究結(jié)果

2.2.1 研究對象一般情況各組研究對象基本情況見表2。其中，非接觸對照組均無三氯乙烯接觸史，接觸對照組平均接觸工齡為（466.09±280.65）d，入院病例組和出院病例組的平均接觸工齡分別為（32.00±19.81）、（29.17±10.82）d。

表2 2008—2010年深圳市職業(yè)病防治院研究對象基本資料Table 2 General information of participants from Shenzhen Preventive and Treatment Center for Occupational Diseases in 2008—2010

2.2.2 研究對象外周血單個核細(xì)胞增殖能力的變化各組人群外周血單個核細(xì)胞在加入不同濃度三氯乙酸和三氯乙醇處理后，與未染毒細(xì)胞相比，各組細(xì)胞存活率均降低（P＜0.05）。與非接觸對照組相比，0.5、2.0 mmol·L-1三氯乙酸處理細(xì)胞后，出院病例組細(xì)胞存活率分別增加5.81%和5.64%（P＜0.05）；而接觸對照組、入院病例組的細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。4 組人群外周血單個核細(xì)胞經(jīng)0.5、2.0 mmol·L-1三氯乙醇處理后的細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同濃度三氯乙酸和三氯乙醇對外周血單個核細(xì)胞存活率的影響（±s）Table 3 Effects of different concentrations of trichloroacetic acid and trichloroethanol on survival rate of peripheral blood mononuclear cells (±s)單位（Unit）：%

表3 不同濃度三氯乙酸和三氯乙醇對外周血單個核細(xì)胞存活率的影響（±s）Table 3 Effects of different concentrations of trichloroacetic acid and trichloroethanol on survival rate of peripheral blood mononuclear cells (±s)單位（Unit）：%

［注］*：與未染毒對照相比，P＜0.05；a：與非接觸對照組相比，P=0.012；b：與非接觸對照組相比，P=0.007。［Note］*:Compared with the control group,P＜0.05;a:Compared with the non-exposure control group,P=0.012;b:Compared with the non-exposure control group,P=0.007.

三氯乙酸（Trichloroacetic acid） 三氯乙醇（Trichloroethanol）0.5 mmol·L-1 2.0 mmol·L-1 0.5 mmol·L-1 2.0 mmol·L-1非接觸對照組（Non-exposure control group） 20 100.00±0.00 83.13±6.19* 71.67±4.97* 85.47±5.32* 73.53±5.94*接觸對照組（Exposure group） 20 100.00±0.00 83.22±3.74* 73.18±3.61* 85.26±4.43* 75.80±5.94*入院病例組（Admitted group） 10 100.00±0.00 82.17±4.60* 69.56±4.42* 84.35±6.23* 74.98±5.81*出院病例組（Discharged group） 7 100.00±0.00 88.94±5.50*a 77.31±6.05*b 86.97±3.03* 77.39±5.86*F——2.937 4.315 0.386 0.914 P——0.042 0.009 0.764 0.440組別（Group） 例數(shù)（Number） 未染毒對照（Control）

3 討論

大量研究表明，職業(yè)接觸三氯乙烯是引起TIHD發(fā)生的直接原因［3］。根據(jù)三氯乙烯引起的超敏反應(yīng)的特征及發(fā)病機(jī)制，將其劃分為IV 型超敏反應(yīng)即遲發(fā)型超敏反應(yīng)，該反應(yīng)是由效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞與抗原作用后引起單個核細(xì)胞浸潤和組織損傷，并且伴有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)［6］。由于三氯乙烯進(jìn)入機(jī)體后產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物例如水合氯醛、三氯乙酸、三氯乙醇等，因此三氯乙烯是否需經(jīng)過代謝以后才具體致敏作用一直存在爭議，有研究指出三氯乙烯及其代謝產(chǎn)物三氯乙酸和三氯乙醇可能均是引起TIHD 的致敏原［7-8］。本次研究結(jié)果表明：三氯乙酸在TIHD 發(fā)病過程中，發(fā)揮其致敏能力；但三氯乙醇是否在TIHD 發(fā)病過程中發(fā)揮其致敏能力尚無證據(jù)。

多數(shù)具有致敏性的化學(xué)物能夠促進(jìn)THP-1 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，例如IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α 等，因而THP-1 細(xì)胞株被廣泛應(yīng)用于驗證、檢測小分子化學(xué)物的致敏性［9］，并且在致敏性化學(xué)物的作用下THP-1細(xì)胞IL-8 的表達(dá)水平增加，因此IL-8 被認(rèn)為是THP-1細(xì)胞體外驗證化學(xué)物致敏能力的重要篩查指標(biāo)［9-10］。此外，機(jī)體在致敏原的誘導(dǎo)下可以促進(jìn)iNOS 的表達(dá)，在iNOS 的催化作用下促進(jìn)機(jī)體內(nèi)釋放大量的NO，參與炎癥過程，對機(jī)體造成損傷［10-11］。iNOS 作為NO 合成過程中重要的限速酶，影響NO 的產(chǎn)生，在一定程度上同樣可以作為化學(xué)物致敏能力的篩查指標(biāo)。本研究結(jié)果表明：隨著三氯乙酸、三氯乙醇濃度增加，IL-8 表達(dá)水平增加，并且THP-1 細(xì)胞iNOS 表達(dá)水平增加，該趨勢與IL-8 變化趨勢一致（P＜0.05）。上述體外實驗結(jié)果初步證明了三氯乙酸和三氯乙醇均具有致敏能力。

三氯乙烯致敏主要包括兩個過程：誘導(dǎo)過程和激發(fā)過程［12］。誘導(dǎo)過程中，化學(xué)物或其活性代謝物與內(nèi)源性肽相互作用形成復(fù)合物，即形成具有免疫原性的完全抗原。完全抗原在機(jī)體內(nèi)能夠被抗原呈遞細(xì)胞識別加工，進(jìn)而促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞的增殖分化，使得機(jī)體內(nèi)記憶T 淋巴細(xì)胞大量增加；激發(fā)過程中，當(dāng)機(jī)體再次接觸相同的抗原時，記憶T 淋巴細(xì)胞活化為效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞，引起機(jī)體免疫應(yīng)答［13-14］。目前，利用抗原特異性T 淋巴細(xì)胞特點(diǎn)檢測外源性化學(xué)物具有免疫原性的方法包括淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗和皮膚斑貼實驗［15］。為驗證三氯乙酸和三氯乙醇是否在TIHD 過程中發(fā)揮其致敏作用，本研究采取淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗檢測三氯乙酸和三氯乙醇對三氯乙烯職業(yè)暴露人群和非暴露人群外周血T 淋巴細(xì)胞的增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相對于非接觸對照組，出院病例組，分離其外周血單個核細(xì)胞與三氯乙酸共培養(yǎng)，細(xì)胞存活率上升，提示患者體內(nèi)可能存在三氯乙酸抗原特異性的T淋巴細(xì)胞，當(dāng)這類細(xì)胞再次接觸特異性半抗原三氯乙酸時，T 細(xì)胞發(fā)生增殖；而入院治療組細(xì)胞存活率無明顯變化，可能是因為患者入院后，治療TIHD 的藥物（如糖皮質(zhì)激素）對機(jī)體的免疫應(yīng)答具有一定的抑制作用；當(dāng)患者出院后激素停用，藥物對機(jī)體的免疫抑制作用減弱，因此特異性抗原的促增殖效應(yīng)能夠被檢測出來。

此外，Huang等［16］采用皮膚斑貼試驗對致敏原進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)19例TIHD康復(fù)病例中，對0.05%、0.5%和5.0%三氯乙醇斑貼呈陽性的比率分別為52.6%、73.7%、89.5%；5.0%三氯乙酸陽性率為47.4%，0.5%三氯乙酸斑貼試驗均為陰性；Watanabe 等［5］發(fā)現(xiàn)三氯乙醇、三氯乙酸均能引起TIHD 患者皮膚斑貼試驗陽性。結(jié)合本研究的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗和文獻(xiàn)報道的斑貼試驗結(jié)果，可以認(rèn)為三氯乙酸是參與TIHD 的發(fā)病過程的致敏原之一；而本研究結(jié)果尚無法確定三氯乙醇是否參與TIHD 的發(fā)病。導(dǎo)致研究結(jié)果差異性的原因可能是由于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗所使用的淋巴細(xì)胞與斑貼試驗中皮膚角質(zhì)細(xì)胞的敏感性差異、受試物濃度差異等多種因素引起。為進(jìn)一步驗證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量，增設(shè)化學(xué)物的干預(yù)劑量和干預(yù)時間，進(jìn)一步驗證三氯乙醇、三氯乙酸以及其他代謝產(chǎn)物在TIHD 發(fā)病過程中的作用。