聞星，徐洪呂，伍曉艷，，陶舒曼，楊婭娟，盛杰，詹凱，齊云霞，劉雯雯，鄒立巍，謝陽，李婷婷，陶芳標(biāo)，

1.安徽醫(yī)科大學(xué) a.公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)系 b.出生人口健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 c.人口健康與優(yōu)生安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 d.國(guó)家衛(wèi)生健康委配子及生殖道異常研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230032

2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所安徽省畜禽產(chǎn)品安全工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230032

晝夜節(jié)律紊亂是一種內(nèi)源性生物鐘與環(huán)境光、暗循環(huán)失調(diào)的狀態(tài)［1］，常見的表現(xiàn)形式為睡眠紊亂，多項(xiàng)研究顯示晝夜節(jié)律紊亂與兒童青少年的身心健康密切相關(guān)，如肥胖、心血管疾病、代謝功能異常、內(nèi)分泌失調(diào)、抑郁等［2-3］。睡眠時(shí)型是評(píng)價(jià)晝夜節(jié)律的一種方法［4］。鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，作為增塑劑廣泛應(yīng)用于個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、家居擺設(shè)、食品藥品等包裝材料中［5］，人群研究發(fā)現(xiàn)PAEs 暴露與睡眠紊亂如失眠、睡眠中斷有關(guān)［6］，動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可引起動(dòng)物晝夜活動(dòng)模式改變，降低活動(dòng)水平［7］。目前關(guān)于PAEs暴露與人群晝夜節(jié)律的研究較少。晝夜偏好在青春期啟動(dòng)時(shí)開始向“夜晚型”轉(zhuǎn)變，在青春期結(jié)束時(shí)達(dá)到頂峰［8］。本研究擬以處于青春期晚期的大學(xué)生為研究對(duì)象，分析大學(xué)生尿液PAEs 代謝物與睡眠時(shí)型之間的關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究在2019年10—11月對(duì)中國(guó)江西省上饒市1 所綜合類學(xué)校和安徽省合肥市1 所醫(yī)科類院校的學(xué)生進(jìn)行了橫斷面調(diào)查，采用隨機(jī)整群抽樣的方法，以專業(yè)為抽樣單位，抽取1 152 名調(diào)查對(duì)象進(jìn)行問卷調(diào)查和采集尿樣?；厥諉柧? 151 份，排除4 份無效問卷后，最終納入有效問卷1 147 份，有效回收率為99.7%。收集晨尿樣本721 份。納入問卷信息完整和有尿液樣本的713 人進(jìn)行分析。在調(diào)查前所有參與者均簽署了知情同意書。本研究獲得安徽醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批號(hào)：20200965）。

1.2 方法

1.2.1 問卷調(diào)查研究對(duì)象分批次集中在教室中，通過手機(jī)掃描指定的二維碼獲取自編的大學(xué)生健康相關(guān)行為電子問卷，在調(diào)查人員說明填寫要求后填寫問卷，填寫時(shí)間為20～30 min。調(diào)查內(nèi)容包括一般人口學(xué)特征（年齡、性別、專業(yè)、父母文化程度等）、家庭經(jīng)濟(jì)狀況（與周圍同學(xué)相比，自評(píng)家庭經(jīng)濟(jì)狀況）、最近一個(gè)月內(nèi)吸煙和飲酒情況（有或無）、最近一個(gè)月內(nèi)影響睡眠的因素（如吃夜宵、喝咖啡、喝茶等）的發(fā)生頻率、體力活動(dòng)水平（使用國(guó)際體力活動(dòng)問卷［9］評(píng)估）。

1.2.2 睡眠時(shí)型評(píng)估采用清晨型與夜晚型量表（Morning and Evening Questionnaire-5，MEQ-5）調(diào)查研究對(duì)象的睡眠時(shí)型［10］。MEQ-5 由5 個(gè)條目所構(gòu)成，總分范圍為4～25 分，其中4～11 分為夜晚型、12～17 分為中間型、18～25分為清晨型［10］。清晨型指早睡早起，并且起床后保持精力充沛；相反，夜晚型指晚睡晚起，在起床后一段時(shí)間感覺疲倦，而在晚上發(fā)揮最佳狀態(tài)；中間型介于兩者之間；與清晨型相比，夜晚型的晝夜節(jié)律延遲2～12 h［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，MEQ-5 在不同年齡人群中均具有良好的效度和信度［13-14］。本研究中，該量表的Cronbach’sα系數(shù)為0.74。

1.2.3 尿樣收集與檢測(cè)將已經(jīng)編號(hào)的試管和聚丙烯尿杯在采集尿樣前1 d 分發(fā)給研究對(duì)象，次日清晨由調(diào)查人員前往學(xué)生宿舍回收裝有晨尿的試管。晨尿經(jīng)離心后用聚丙烯凍存管分裝上清液，置于-80℃冷凍柜冷凍保存。檢測(cè)時(shí)取冷凍儲(chǔ)存的尿液，在室溫下解凍，采用固相萃取法［15］前處理尿液中6 種PAEs 代謝物：鄰苯二甲酸單甲酯（monomethyl phthalate，MMP）、鄰苯二甲酸單乙酯（monoethyl phthalate，MEP）、鄰苯二甲酸-單-（2-乙基-5-羥己基）酯［mono（2-ethyl-5-hydroxyhexyl）phthalate，MEHHP］、鄰 苯二甲酸單丁酯（monobutyl phthalate，MBP）、鄰苯二甲酸-單-（2-乙基-5-氧己基）酯［mono（2-ethyl-5-oxohexyl）phthalate，MEOHP］和鄰苯二甲酸單（2-乙基己）酯（mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP）。使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)量6 種PAEs 代謝物的濃度［16］，采用手持式折射計(jì)（ATAGO，日本）測(cè)量尿比重［17］。

1.3 質(zhì)量控制

按照相同的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一培訓(xùn)調(diào)查員。大學(xué)生按照專業(yè)分別集中到教室，通過現(xiàn)場(chǎng)掃描二維碼填寫線上問卷，有問題及時(shí)解答；線上問卷設(shè)置一個(gè)學(xué)號(hào)只能填寫一次；大學(xué)生獨(dú)立填寫問卷，不能互相討論。調(diào)查人員通過問卷系統(tǒng)后臺(tái)核對(duì)問卷信息的完整性和填寫質(zhì)量。

在采樣、離心、分裝、運(yùn)輸以及檢測(cè)等各個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格遵循操作規(guī)范，避免環(huán)境污染。選用聚丙烯材質(zhì)的尿杯采集樣品，首先是因?yàn)榫郾┠虮蠵AEs 含量較低；其次，尿中的酶沒有水解PAEs 的能力，不影響PAEs 代謝物的檢測(cè)；最后，用質(zhì)譜級(jí)水重復(fù)采樣過程，跟尿樣一同采用尿管采集、離心和儲(chǔ)存，上機(jī)檢測(cè)未檢出目標(biāo)代謝物。在實(shí)驗(yàn)室中每一個(gè)步驟盡量由同一個(gè)人完成，減少實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)使用的玻璃制品清洗干凈防止交叉污染。每天做質(zhì)控樣品檢測(cè)反映實(shí)驗(yàn)的精密度，其日內(nèi)、日間變異系數(shù)分別為1.9%～9.0%和1.3%～6.8%。在前處理過程中采用前加標(biāo)回收率來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，40、60、80 μg·L-1的前加標(biāo)回收率為90.7%～114.9%。不同PAEs 代謝物的檢出限（limit of detection，LOD）以儀器3 倍信噪比估算，LOD 為0.046～1.194 μg·L-1［18］。PAEs 代謝物水平低于LOD 時(shí)，分析計(jì)算時(shí)以LOD/2 表示。采用尿比重來校正個(gè)體尿液PAEs 代謝物濃度［19］，對(duì)校正后的濃度進(jìn)行l(wèi)og10轉(zhuǎn)換。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用EpiData 3.1 軟件建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)6 種PAEs 代謝物濃度的分布進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。采用卡方檢驗(yàn)比較不同人口學(xué)特征研究對(duì)象之間的睡眠時(shí)型差異。根據(jù)三分位數(shù)，將PAEs 代謝物濃度分為低（＜P33.3）、中（P33.3～P66.7）和高（≥P66.7）水平組。將睡眠時(shí)型作為應(yīng)變量，PAEs 代謝物濃度作為自變量，學(xué)校、家庭居住地、獨(dú)生子女、父母文化程度、吸煙、飲酒、睡眠影響因素以及體力活動(dòng)等混雜因素為分類變量，使用廣義線性回歸分析PAEs 代謝物與睡眠時(shí)型之間的關(guān)聯(lián)，并按性別進(jìn)行分層分析，同時(shí)做趨勢(shì)性檢驗(yàn)。其中睡眠時(shí)型的類型作為有序分類變量、PAEs 代謝物濃度作為連續(xù)性變量和分類變量分別納入分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大學(xué)生睡眠時(shí)型的分布特征

大學(xué)生夜晚型、中間型、清晨型睡眠時(shí)型的檢出率分別8.0%、68.0%和24.0%。不同性別、專業(yè)、家庭居住地、獨(dú)生子女以及體力活動(dòng)水平分組大學(xué)生的睡眠時(shí)型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同人口學(xué)特征的大學(xué)生睡眠時(shí)型分布［n（%）］Table 1 Distribution of chronotypes among college students with different demographic characteristics [n (%)]

2.2 大學(xué)生尿液PAEs 代謝物檢出情況

大學(xué)生尿液中MMP、MEP、MEHHP、MBP、MEOHP、MEHP 的檢出率分別為97.5%、97.9%、98.6%、98.6%、98.7%和80.5%，尿比重調(diào)整后質(zhì)量濃度中位數(shù)分別為16.02、24.61、15.33、263.25、12.19、2.94 μg·L-1。見表2。

表2 大學(xué)生尿液PAEs代謝物質(zhì)量濃度分布Table 2 Distribution of urinary phthalate metabolite concentrations among college students

2.3 大學(xué)生PAEs 代謝物與睡眠時(shí)型的關(guān)聯(lián)

廣義線性回歸模型性別分層分析結(jié)果顯示，女大學(xué)生PAEs 代謝物濃度與睡眠時(shí)型存在關(guān)聯(lián)，男性中未發(fā)現(xiàn)此關(guān)聯(lián)。在控制混雜變量后，女性MMP 與睡眠時(shí)型呈負(fù)向關(guān)聯(lián)（OR=0.55，95%CI：0.33～0.89），MEHHP 與睡眠時(shí)型呈負(fù)向關(guān)聯(lián)（OR=0.24，95%CI：0.06～0.93）。將PAEs代謝物濃度作為分類變量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與低水平組MMP比較，女性高水平組MMP與睡眠時(shí)型呈負(fù)向關(guān)聯(lián)（OR=0.51，95%CI：0.28～0.92），且MMP趨勢(shì)性分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 大學(xué)生PAEs代謝物與睡眠時(shí)型關(guān)聯(lián)的廣義線性回歸模型分析Table 3 Relationships between phthalate metabolites and chronotypes among college students by generalized linear model

續(xù)表3

3 討論

本研究中大學(xué)生6 種PAEs 代謝物在尿液中的檢出率為80.5%～98.7%，表明研究對(duì)象普遍暴露于PAEs。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果顯示的PAEs 代謝物濃度并不一致，可能與檢測(cè)方法或納入人群不同有關(guān)，但多數(shù)研究結(jié)果均提示MBP、MEP 的暴露水平較高［20-22］。PAEs 與塑料制品的結(jié)合不穩(wěn)定，容易遷移到環(huán)境中，從而導(dǎo)致人體的暴露［23］。

美國(guó)國(guó)家健康和營(yíng)養(yǎng)檢查調(diào)查（National Health and Nutrition Examination Surveys，NHANES）發(fā)現(xiàn)，PAEs代謝物與成年人夜間醒來有關(guān)，且多種內(nèi)分泌干擾物與睡眠紊亂有關(guān)［24］。其內(nèi)在機(jī)制目前尚不明確，有研究認(rèn)為內(nèi)分泌干擾物能夠與雌激素受體結(jié)合，引起肥胖相關(guān)問題，間接導(dǎo)致睡眠紊亂［25］。睡眠紊亂是晝夜節(jié)律紊亂的一種常見表現(xiàn)形式，本研究用睡眠時(shí)型來評(píng)價(jià)晝夜節(jié)律，發(fā)現(xiàn)大學(xué)生清晨型的檢出率（24.0%）高于夜晚型（8.0%）。然而在另一項(xiàng)美國(guó)大學(xué)生研究中，夜晚型的比例（28.6%）高于清晨型（12.7%）［26］。Haraden 等［27］針對(duì)美國(guó)兒童青少年的研究發(fā)現(xiàn)，清晨型與夜晚型的檢出率接近，分別為10%和11%。睡眠時(shí)型的差異可能與研究地區(qū)、人群有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)MMP 與女性夜晚型睡眠時(shí)型有關(guān)，未發(fā)現(xiàn)任何PAEs代謝物與男性睡眠時(shí)型相關(guān)。夜晚型作息與多種不良心理和身體健康結(jié)果有關(guān)［28-29］。

睡眠時(shí)型的影響因素很多。最近研究關(guān)注到內(nèi)分泌干擾物與晝夜節(jié)律的關(guān)聯(lián)，提示內(nèi)分泌干擾物可能擾亂晝夜節(jié)律，引起晝夜活動(dòng)模式改變［7，30］。有研究表明女童比男童更早進(jìn)入青春期，青春期結(jié)束也更早［31］。在青春期啟動(dòng)時(shí)，睡眠相位由兒童時(shí)期早睡早起逐漸向晚睡晚起轉(zhuǎn)變［8］。同時(shí)，大量研究發(fā)現(xiàn)PAEs暴露與女童青春發(fā)動(dòng)時(shí)相提前有關(guān)［32-33］，促使女童較早進(jìn)入青春期。晝夜活動(dòng)模式的相位、振幅和周期由雌激素和雄激素調(diào)節(jié)［34］，PAEs 可能通過類雌激素作用調(diào)控晝夜節(jié)律［35］，或者通過刺激下丘腦促性腺激素釋放，調(diào)節(jié)青春期發(fā)生發(fā)展，從而間接調(diào)控晝夜節(jié)律［36］，促使女童較早向夜晚型睡眠時(shí)型轉(zhuǎn)變。晝夜節(jié)律的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋循環(huán)有關(guān)，此循環(huán)受到一系列基因或蛋白質(zhì)調(diào)控，包括鐘基因（circadian locomotor output cycles kaput，Clock）、腦和肌肉芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)樣蛋白1 基因（brain and muscle ARNTlike 1，Bmal1）、隱色素基因（cryptochrome，Cry）和周期基因（period，Per）［37］。動(dòng)物研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAEs 代謝物可直接上調(diào)雌鼠子代下丘腦視交叉上核的Clock、Per1基因的表達(dá)，從而調(diào)控雌鼠晝夜節(jié)律［38］。在斑馬魚研究中發(fā)現(xiàn)，暴露于內(nèi)分泌干擾物雙酚A 和雌二醇后，斑馬魚晝夜節(jié)律均發(fā)生改變，雌二醇暴露后還觀察到斑馬魚活動(dòng)模式發(fā)生改變［30］。

本研究檢測(cè)了大學(xué)生尿液中多種PAEs 代謝物，結(jié)果具有良好的準(zhǔn)確度和精確度；并且，本研究首次報(bào)告了大學(xué)生PAEs 暴露與睡眠時(shí)型的關(guān)聯(lián)。然而，研究也存在局限性：首先，本研究只采集了單個(gè)時(shí)點(diǎn)的尿液樣本，因?yàn)镻AEs 生物半衰期短，幾乎在24 h 內(nèi)完全代謝［39］，所以不能代表每日接觸PAEs 的平均水平；其次，本研究采用自填問卷的方式評(píng)價(jià)睡眠時(shí)型，可能無法避免報(bào)告偏倚；此外，睡眠時(shí)型的影響因素很多，雖然本研究將一些可能影響睡眠時(shí)型的因素納入分析，但不能排除還有其他混雜因素未納入研究而可能造成偏倚；本研究為橫斷面研究，未來需要開展縱向研究來驗(yàn)證PAEs 暴露對(duì)睡眠時(shí)型的影響以及性別差異，并且還需開展實(shí)驗(yàn)研究了解其生物學(xué)機(jī)制。

綜上，大學(xué)生普遍暴露于多種PAEs，MMP 暴露與女大學(xué)生夜晚型睡眠時(shí)型有關(guān)。