樊嘉琦，馬維武，周學章 (寧夏大學 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021)

腸道外致病性大腸桿菌(extraintestinal pathogenicE.coli,ExPEC)是一類能在腸道內(nèi)無癥狀定殖，但能引起機體其他組織器官感染的病原體，它能吸收宿主體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，且能逃逸宿主的免疫防御[1-2]。最初，ExPEC僅見于尿路感染、新生兒腦膜炎和敗血癥中，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其可在宿主多種部位引起感染，于是 RUSSO等[3]在2000年最先將這類能引起腸外疾病的非共生性大腸桿菌稱為ExPEC。分子生物學研究發(fā)現(xiàn)，ExPEC含有iutA(螯鐵蛋白受體)、papA/papC(P菌毛)、afa/dra(Dr抗原結(jié)合位點)、sfa/foc(S和F1C菌毛)、kpsMTⅡ(Ⅱ型莢膜多糖)5種毒力基因。PEIRANO等[4]證實含有2種及2種以上毒力基因便可確證為ExPEC。近年來，ExPEC引發(fā)的多種疾病已給畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，其攜帶多種毒力基因，呈現(xiàn)多重耐藥性，且能造成人畜傳播，對人類健康存在潛在威脅[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，ExPEC可導致豬、雞、貂、羊、狐貍、華南虎和虎鯨等動物發(fā)病，但在雙峰駝中的相關研究未見報道。本試驗為查明內(nèi)蒙古阿拉善雙峰駝群體性死亡的原因，采集死亡雙峰駝臟器，進行病原菌分離鑒定及生物學特性分析，測定菌株耐藥性，檢測毒力基因，為及時治療發(fā)病雙峰駝提供用藥方案，也為該地區(qū)雙峰駝的疫病防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源及其疾病發(fā)生背景內(nèi)蒙古阿拉善左旗屬溫帶荒漠干旱區(qū)，典型的中溫帶大陸氣候，以風沙大、年降雨量低、日照充足、年蒸發(fā)量高為主要特點。2018年9月，該地區(qū)異常連續(xù)降雨，在低洼地區(qū)形成積水。阿拉善左旗飼養(yǎng)的8 600多峰雙峰駝，在飲用積水后有740峰發(fā)病，l04峰死亡。發(fā)病雙峰駝的臨床癥狀為腹脹，腹瀉，嘔吐，眼結(jié)膜充血，體溫升高至40℃左右，呼吸加快且沉重。發(fā)病雙峰駝大多在72 h內(nèi)死亡。對死亡雙峰駝進行病理解剖發(fā)現(xiàn)，瘤胃內(nèi)有污黑色酸臭液體；真胃黏膜充血、出血；小腸出血；腸淋巴腫大；肝腫大，有點狀出血；肺臟充血，局部有出血點；腎皮質(zhì)有出血點且腫大。采集死亡雙峰駝肺臟、肝臟、腎臟、心臟和腸管等組織器官，進行病原微生物分離鑒定。

1.2 實驗動物試驗用鼠為6周齡昆明小鼠，體質(zhì)量約為20 g，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.3 主要試劑營養(yǎng)肉湯瓊脂、LB肉湯、哥倫比亞血瓊脂、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA Agar)、瓊脂粉購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術公司；藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司；5種腸道內(nèi)致病性大腸桿菌核酸檢測預分裝試劑盒購于深圳生科原生物有限公司。

1.4 樣品的處理以及病原菌的分離無菌采集死亡雙峰駝的肺臟、肝臟、腎臟、心臟、腸管等組織器官樣本，分別接種于營養(yǎng)肉湯瓊脂平板，于37℃培養(yǎng)。

1.5 革蘭染色和菌落形態(tài)觀察革蘭染色后觀察細菌的形態(tài)及顏色，分別涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基和哥倫比亞血平板，在37℃培養(yǎng)18～24 h。

1.6 生化鑒定挑取單菌落，用生理鹽水調(diào)節(jié)麥氏比濁度至0.5，加入生化鑒定板中，使用全自動細菌生化鑒定儀進行鑒定。

1.7 分離菌的型別劃分和鑒定分離株經(jīng)培養(yǎng)后提取DNA，按照5種腸道內(nèi)致病性大腸桿菌核酸檢測預分裝試劑盒(熒光PCR法)說明書進行PCR反應，反應條件：95℃ 10 min；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 90 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。

1.8 菌落基因組測序提取菌株的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京百邁客生物科技有限公司進行測序。

1.9 菌落16S rRNA序列分析提取菌株的基因組DNA，PCR擴增16S rRNA基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程(上海)有限公司測序。對測序結(jié)果進行BLAST分析并構(gòu)建該病原菌系統(tǒng)進化樹及同源性圖。

1.10 動物回歸試驗用無菌生理鹽水將細菌懸液調(diào)整至3×108CFU/mL。隨機選取體質(zhì)量為(20±5) g 的12只健康小鼠，試驗組6只，對照組6只。試驗組小鼠腹腔注射0.25 mL(10 g)菌液，對照組小鼠注射等量生理鹽水。正常條件下飼養(yǎng)并觀察小鼠活動情況，解剖死亡小鼠，并取其內(nèi)臟器官進行病理觀察。

1.11 菌株藥物敏感性試驗將菌株涂布于LB平板，無菌條件下將藥敏紙片(分別包括氯霉素類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類和多肽類等20種藥物)貼到LB平板上，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.12 耐藥基因的檢測根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，對耐藥基因進行初步判定和分析，參照文獻[7-8]設計并合成耐藥基因鑒定引物，提取細菌DNA和質(zhì)粒進行檢測。耐藥基因包括基因sul-1、sul-2、aph(3) -2、aph(3)-1、qnrA、qnrB、qnrS、acc(6)-ib-cr、aac(3)-Ⅳ、aac(3)-Ⅱ、cmlA、floR、cat-1、SHV、CMY-2、CTX-M、CTX-M-3、TEM、tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(E)、ant(3')-Ⅰ。

1.13 重要毒力基因PCR檢測參照文獻[9-10]，合成毒力基因的PCR引物，提取DNA和質(zhì)粒進行檢測。毒力基因包括irp2、fyuA、iucA、iucD、iutA、fimA、fimC、iss、hlyA、tsh、eaeA、vat、stx1、stx2、colV、colBM、hlyA、sheA、ehly和ehx。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離及培養(yǎng)特征對死亡雙峰駝各臟器進行細菌分離，結(jié)果顯示，在肝臟中分離出細菌(圖1A)，將分離出的菌株進行純化，命名為M。通過染色和顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)M為革蘭陰性桿菌，形態(tài)均勻，末端圓鈍，呈聚集或分散排列(圖1E)。M在LB瓊脂培養(yǎng)基上形成白色、圓形且光滑的菌落(圖1B)；在伊紅美藍培養(yǎng)基上菌落呈亮金屬的光澤(圖1C)；在哥倫比亞血平板上出現(xiàn)溶血環(huán)(圖1D)。

A.營養(yǎng)肉湯瓊脂平板分離病原菌；B.病原菌在LB瓊脂培養(yǎng)基的生長情況；C.病原菌在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基的生長情況；D.病原菌在哥倫比亞血平板的生長情況；E.病原菌革蘭染色結(jié)果圖1 M在不同培養(yǎng)基的生長情況及革蘭染色結(jié)果

2.2 細菌生化鑒定結(jié)果全自動生化儀生化鑒定顯示，M屬于大腸桿菌屬。D-山梨醇、D-海藻糖、β-半乳糖、乳酸鹽產(chǎn)堿、D-葡萄糖、琥珀酸產(chǎn)鹽堿、葡萄糖發(fā)酵、α-半乳糖苷酶、D-麥芽糖、D-甘露糖、D-甘露醇、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、β-葡萄糖苷酸酶、O/129耐受和酪氨酸芳胺醇為陽性，其余為陰性。

2.3 5種腸道內(nèi)致病性大腸桿菌核酸檢測結(jié)果通過熒光PCR檢測發(fā)現(xiàn)，PCR基線減去曲線擬合相對熒光單位的最大Ct值為7.04。M不屬于腸侵襲性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌和腸集聚型大腸桿菌中的任何一種。

2.4 基因組測序結(jié)果對菌株M基因組進行測序和分析發(fā)現(xiàn)其為大腸桿菌，基因總長度為4 768 782 bp。進一步分析其毒力基因，發(fā)現(xiàn)M含有832種毒力基因，且含有腸道外大腸桿菌特有的papA/papC、sfa/foc和kpsMTⅡ 3種毒力基因，充分證明菌株M為ExPEC。測序檢測進一步發(fā)現(xiàn)該菌株含有氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、磺胺類、四環(huán)素類、多肽類等29種耐藥基因。

2.5 大腸桿菌16S rRNA系統(tǒng)進化分析將菌株M的16S rRNA序列與GenBank中其他12株大腸桿菌的16S rRNA核酸序列進行對比，結(jié)果顯示菌株M與其他大腸桿菌間的核苷酸同源性為93.4%～99.7%，其中與加拿大野豬源分離株(CP062901)、中國雞源分離株(CP055259)、中國豬源分離株(CP047461)的序列同源性最高，達到99.7%，而與加拿大牛源分離株(GQ222405)、中國豬源分離株(KJ477007)的序列相似性最低，僅為93.4%。通過MEGA 7.0的Clusta W工具對齊后，利用Maximum-likelihood模型構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，同時使用SDT V1.2軟件分析菌株M與其他12株大腸桿菌的序列相似性。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，菌株M與CP062901、CP055259、CP047461的同源相似性最高，屬于同一遺傳分支；與鴨源、人源、牛源、麋鹿源等其余9種大腸桿菌相似性較低，不屬于同一分支(圖2A)；同源相似性結(jié)果表明，菌株M與CP062901、CP055259、CP047461相交的顏色最深，表明菌株M與這3株大腸桿菌的相似性最高(圖2B)。

圖2 16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(A)及同源相似性圖(B)

2.6 動物回歸試驗結(jié)果注射菌液10 min后，與對照組相比，試驗組小鼠更加亢奮，運動量明顯增加。12 h后，試驗組小鼠死亡5只，1只精神萎靡，行動遲緩，被觸碰時無明顯反抗動作，對照組小鼠無任何異常。對死亡小鼠進行解剖后發(fā)現(xiàn)，肺臟有明顯出血并有輕微花斑，肝臟充血并且腫大，其余器官無明顯變化(圖3)。從死亡小鼠的肺臟、肝臟和脾臟組織中均分離出菌株M。

從左到右為肺臟、腎臟、脾臟、心臟、肝臟圖3 死亡小鼠臟器

2.7 藥物敏感性試驗結(jié)果藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，分離株對頭孢噻肟、新霉素、慶大霉素、丁胺卡那、多粘菌素、環(huán)丙沙星、氟氧沙星敏感，對阿莫西林、苯唑西林、氨芐西林、土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素/強力霉素、鏈霉素、磺胺嘧啶、復方新諾明、磺胺異噁唑/甲氧芐啶、恩諾沙星、氟苯尼考耐藥。

2.8 基因組和質(zhì)粒DNA的耐藥基因檢測結(jié)果分別以菌株M的基因組和質(zhì)粒DNA為模板，對24種耐藥基因進行PCR擴增。結(jié)果如圖4所示，可以檢測出磺胺類耐藥基因sul-1、sul-2；β-內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM、四環(huán)素類耐藥基因tet(B)、氨基糖苷類耐藥基因aph(3)-1和氯霉素類耐藥基因cmlA、cat-1。

A.基因組DNA的PCR擴增結(jié)果；B.質(zhì)粒的PCR擴增結(jié)果。M.DL2000 DNA Marker；1～9分別為TEM、tet(B)、aph(3)-1、aac(3)-1、sul-1、sul-2、qnrB、cmlA、cat-1圖4 大腸桿菌分離株的耐藥基因PCR擴增

2.9 基因組和質(zhì)粒DNA的毒力基因檢測結(jié)果分別以該菌株的基因組和質(zhì)粒DNA為模板，對其毒力基因進行PCR擴增。結(jié)果如圖5所示，在細菌基因組和質(zhì)粒中都可以檢測到HPI毒力島基因irp2和fyuA，Ⅰ型菌毛基因fima和fimC，Iss蛋白基因iss，大腸桿菌素基因colBM、溶細胞素基因sheA以及氣桿菌素基因iucA。

A.基因組PCR擴增結(jié)果;B.質(zhì)粒PCR擴增結(jié)果。M.DL2000 DNA Marker；1～8分別為irp2、fyuA、iucA、fimA、fimC、iss、colBM、sheA圖5 大腸桿菌分離株的毒力基因PCR擴增

3 討論

根據(jù)臨床特點和致病特性，ExPEC主要分為致腎盂腎炎大腸桿菌(UPEC)、新生兒腦膜炎大腸桿菌(NMEC)、禽致病性大腸桿菌(APEC)和敗血性大腸桿菌(SEPEC)[8]。ExPEC是一種重要的病原菌，可導致人畜共患傳染病，該致病菌可以穿透機體屏障，如NMEC能突破血腦屏障引起新生兒腦膜炎，部分APEC也能突破血腦屏障引起新生大鼠腦膜炎。ExPEC缺乏宿主特異性，可以跨種屬傳播，所以其危害程度遠高于腸道內(nèi)致病性大腸桿菌[6,11]。近年來，在動物體內(nèi)ExPEC的分離率越來越高，通過對其血清型、多位點序列、外膜蛋白、核糖體基因和毒力因子分析，發(fā)現(xiàn)動物源ExPEC與人源ExPEC具有高度相似性(如人與家禽分離的ExPEC中ColV/ColBM質(zhì)粒相似性極高)[5]。JOHNSON等[6]研究證實人的UPEC能跨越宿主屏障定殖于家養(yǎng)寵物體內(nèi)。范克偉等[12]在急性死亡華南虎肝臟中分離出1株APEC，認為其有可能來自于飼喂的家禽。KRISHNAN等[11]發(fā)現(xiàn)APEC可在人類中引起感染，而人源ExPEC有可能在禽類中引起大腸桿菌病。DAIRA等[13]發(fā)現(xiàn)，因環(huán)境或食物的污染，虎鯨體內(nèi)存在多重耐藥和攜帶大量毒力基因的ExPEC，因此推測ExPEC可在不同宿主之間傳播，環(huán)境和食物的污染可導致ExPEC的致病性越發(fā)增強。

本研究從死亡雙峰駝肝臟中分離出1株革蘭陰性菌，將其命名為M，生化鑒定發(fā)現(xiàn)該病原菌屬于大腸桿菌屬，測序結(jié)果表明菌株M中存在papA/papC、sfa/foc和kpsMTⅡ 3種毒力基因，屬于ExPEC。對菌株M的 16S rRNA核苷酸序列進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與加拿大野豬源分離株(CP062901)、中國雞源分離株(CP055259)、中國豬源分離株(CP047461)的堿基替換率、序列同源性和遺傳相似性最高；與中國人源分離株(KJ803886)的同源相似性為94.1%，證明菌株M具有成為人畜共患病原菌的可能性。菌株M與中國豬源分離株(KJ477007)、中國森林麋鹿分離株(JF690871)、美國狗源分離株(CP027104)的親緣性相差較遠，不屬于同一遺傳分支，說明菌株M并沒有特定的地方區(qū)域性，其種屬源性并不明顯，雙峰駝中致病菌的來源還需進一步調(diào)查。毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)，此次雙峰駝體內(nèi)分離出的ExPEC基因組和質(zhì)粒中存在與鐵元素攝取相關的irp2-fyuA、colBM、iucA基因，還含有幫助菌株免疫逃逸的基因、增強細菌在血清中生存能力的iss基因、與菌株定殖相關的fimA、fimC基因以及促進溶血的sheA基因。通過動物回歸試驗發(fā)現(xiàn)，菌株M的致病性強，定殖部位多，遷移能力強；死亡小鼠的肺臟、肝臟均有病變，死亡小鼠的肺臟、肝臟、脾臟組織中均可分離出菌株M。研究發(fā)現(xiàn)ExPEC中大多存在幫助菌株定殖、侵襲、免疫逃逸和鐵元素攝取相關的毒力因子[2,14]。陳文靜等[15]分離的65株鴨源ExPEC中，檢出率為100%的毒力基因為ompA、lux、Spfs，檢出率超過72%的毒力基因有iss、tsh、fimC。宋祥軍等[16]分離出30株豬源ExPEC，其中vaT基因檢出率最高，為70.0%，iutA的檢出率為33.33%、kpsMⅡ的檢出率為23.33%。馬增軍等[17]分離出5株豬源ExPEC，發(fā)現(xiàn)攜帶fyuA、ler和iutA基因的菌株致病性較強。 范克偉等[12]在華南虎中分離出1株具有較強致病能力的APEC，小鼠腹腔接種菌株，5 h內(nèi)全部死亡，且小鼠的多種臟器均受到損傷?，F(xiàn)如今，從我國不同動物體內(nèi)分離出的ExPEC均攜帶多種毒力基因，這可能是導致ExPEC強致病性的原因之一。本試驗獲得的分離株具有強毒性和溶血性，對多種臟器造成損害可能是導致雙峰駝死亡的原因。

本株ExPEC的耐藥性強，藥敏試驗結(jié)果證明其對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、多肽類、氨基糖苷類、磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類抗生素耐藥；通過PCR試驗發(fā)現(xiàn)，菌株攜帶TEM、tet(B)、aph(3)-1、aac(3)-1、sul-1、sul-2、qnrB、cmlA、cat-1耐藥基因。近年來ExEPC多重耐藥現(xiàn)象十分普遍，張炳亮等[18]發(fā)現(xiàn)河南豬源ExEPC耐藥基因類型多而復雜，對7種常用抗生素的耐藥率超過70%。李元珍等[19]在病人體內(nèi)分離的85株ExPEC中，對1種或2種藥物耐藥的ExPEC占56.47%(48/85)，多重耐藥菌占43.53%(37/85)。通常因抗生素不合理使用才會引起大腸桿菌的多重耐藥現(xiàn)象，但雙峰駝是半野生養(yǎng)殖動物，養(yǎng)殖時不使用抗生素，本株ExPEC的耐藥基因是如何獲得的有待深入研究。ExPEC感染現(xiàn)在已成為一個嚴重威脅世界公共衛(wèi)生的問題，ExPEC在尿路、腹腔內(nèi)部的感染較常見，在肺部、血管、骨髓等部位的感染較為少見，本研究首次在雙峰駝肝臟內(nèi)分離出ExPEC[20]。劉璨穎等[21]純化豬源ExPEC的外膜蛋白OmpC和OmpF，發(fā)現(xiàn)OmpC免疫原性較強，用其制作的亞單位疫苗可能成為豬源ExPEC的候選疫苗。最新研究發(fā)現(xiàn)一種來自于蛾類體內(nèi)的抗菌肽可以消除UPEC的生物膜[22].發(fā)現(xiàn)鹽酸玫瑰樹堿能與大腸桿菌拓撲異構(gòu)酶Ⅳ結(jié)合，明顯降低ExPEC感染小鼠后的細菌滴度，降低炎癥因子的表達。

本研究從死亡雙峰駝病料中分離獲得了1株致病性強、多重耐藥的ExPEC。追溯雙峰駝的養(yǎng)殖方式發(fā)現(xiàn)，雙峰駝屬于半野生養(yǎng)殖動物，9月份屬于暖季放牧時期，雙峰駝飲水量大，放牧時間長，偶遇惡劣天氣時，雙峰駝飲用野外洼地污水，可能因此導致感染ExPEC。本研究分離的ExPEC來源尚未明確，有待今后進一步的調(diào)查研究。