李建平，吳素芳，李健宇，香 巴 (1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院,吉林 吉林市 13109；.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 13006)

毛色由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的真黑色素(黑色/棕色)和褐黑色素(黃色/紅色)的數(shù)量和比例決定[1]。絨山羊作為一種特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其生產(chǎn)的絨、肉和奶與人們生活息息相關(guān)。羊絨被紡織業(yè)譽(yù)為“纖維寶石”[2]，但絨山羊毛色相對(duì)較少，不能滿足紡織業(yè)及消費(fèi)者的需求，因此，近年來(lái)有關(guān)絨山羊毛色形成機(jī)制的研究逐漸增多，特別是影響黑色素合成的色素基因研究。miRNA是一類內(nèi)源性、非編碼、參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的RNA分子，通過(guò)結(jié)合mRNA的3′UTR或開(kāi)放閱讀框調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、遷移、分化及疾病發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，miR-370可抑制肝癌發(fā)生，是潛在的治療靶點(diǎn)[3]。此外，miR-370還可通過(guò)靶向EGFR調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖和分化，EGFR通常在胃癌中高表達(dá)，因而被作為胃癌的篩查指標(biāo)[4]。miR-370還可通過(guò)與circRNA結(jié)合促進(jìn)胃癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-370與毛囊發(fā)育及雄激素性脫發(fā)有關(guān)，而且在不同毛色皮膚中差異表達(dá)[6]，但其是如何通過(guò)作用色素基因調(diào)控動(dòng)物毛色的仍不清楚。

Wnt家族由19個(gè)高度保守的分泌糖蛋白組成，參與多種細(xì)胞過(guò)程，如增殖、遷移和自我更新[7]。Wnt信號(hào)通路分為經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路和非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路[8]，其中Wnt3a通過(guò)經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路在黑色素細(xì)胞的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)黑色素的合成[9]。研究顯示，缺乏Wnt1和Wnt3a的突變小鼠幾乎完全沒(méi)有黑色素細(xì)胞[10]。體外研究發(fā)現(xiàn)，Wnt1和Wnt3a缺失的神經(jīng)嵴細(xì)胞成為神經(jīng)元而非黑素細(xì)胞[11]，而經(jīng)Wnt3a處理可使其分化成為黑色素細(xì)胞而非神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[12]。ZHAO等[13]發(fā)現(xiàn)microRNA-27a-3p通過(guò)靶向Wnt3a抑制小鼠皮膚黑色素細(xì)胞的黑色素生成。

KITLG是KIT基因的配體，在造血、黑色素生成和配子生成中起重要作用[14]。KITLG/KIT通路在黑色素合成中的作用，不僅包括成黑素細(xì)胞和黑素細(xì)胞的遷移，還能維持出生后皮膚的黑色素生成[15]，在毛囊上皮細(xì)胞中表達(dá)的KITLG對(duì)黑素細(xì)胞的終末分化起重要作用[16]。KIT突變會(huì)導(dǎo)致花斑病的形成，患者在腹側(cè)和/或骶部皮膚表面出現(xiàn)無(wú)色斑癥狀[17]。

本試驗(yàn)選取miR-370為研究對(duì)象，通過(guò)qPCR和免疫組化技術(shù)分析miR-370、Wnt3a和KITLG在不同毛色絨山羊皮膚組織中的表達(dá)、分布及相互關(guān)系，為人工調(diào)控動(dòng)物毛色奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集隨機(jī)選取白色和棕色絨山羊各3只，在肩胛部采集皮膚組織，立即置入液氮保存。

1.2 主要試劑和器材TRIzol裂解液、qPCR試劑盒、木瓜蛋白酶、SP(兔IgG)-POD Kit、Mayer’s蘇木素染液購(gòu)自北京索萊寶生物科技公司；烏賊墨購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所； Wnt3a、KITLG抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)、TG16-W微量離心機(jī)購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；冰凍切片機(jī)CM1950購(gòu)自德國(guó)LEICA公司；電熱恒溫水槽DK-80型購(gòu)自上海一恒科技有限公司。

1.3 不同毛色絨山羊皮膚黑色素含量測(cè)定取絨山羊皮膚組織剪碎，加入木瓜蛋白酶和蒸餾水，55℃水浴加熱16 h，離心后棄去上清，再依次經(jīng)石油醚、無(wú)水乙醇和蒸餾水清洗，烘干得到皮膚樣品。稱取2 mg的烏賊墨，溶解在0.1 mol/L NaOH中，使其終質(zhì)量濃度為200 mg/L，在80℃的水浴中加熱使其溶解。制備黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線：在酶標(biāo)板中加入配制好的烏賊墨，200 μL/孔，使各孔的質(zhì)量濃度分別是0，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200 mg/L，每孔加入200 μL制備好的皮膚樣品，放入酶標(biāo)儀并檢測(cè)波長(zhǎng)500 nm處吸光度值，并根據(jù)測(cè)得的結(jié)果繪制黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的黑色素濃度及皮膚組織黑色素含量。

1.4 不同皮膚組織miR-370和靶基因的表達(dá)TRIzol裂解法提取組織RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與熒光定量分析。反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，總體系為20 μL，反應(yīng)條件：37℃，5 min；42℃，60 min；70℃，5 min。qPCR反應(yīng)體系：10 μL 2×FastStart Essential DNA Green Master，1 μL cDNA，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。qPCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)。miR-370和靶基因分別采用U6和GADPH作為內(nèi)參(引物序列見(jiàn)表1)。

表1 引物信息

1.5 Wnt3a和KITLG在白色和棕色絨山羊皮膚的分布將皮膚組織取出，包埋后切片，展片后用丙酮固定，PBS清洗3次，每次4 min，滴加3% H2O2，室溫避光放置10 min，蒸餾水洗3次，滴加封閉液，室溫30 min后甩去液體，加入Wnt3a(1∶200)和KITLG(1∶200)抗體，對(duì)照組加入PBS，4℃孵育過(guò)夜。用PBS洗滌3次，每次2 min，加入Biotin標(biāo)記的羊抗兔IgG工作液(1∶100)，室溫孵育30 min，PBS洗滌后滴加DAB顯色液，置于顯微鏡下觀察和控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)，滴加蘇木素進(jìn)行輕度復(fù)染，用自來(lái)水沖洗返藍(lán)，常規(guī)脫水、透明、甩干，用中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并進(jìn)行t檢驗(yàn)(P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異)。

2 結(jié)果

2.1 白色和棕色絨山羊皮膚組織中miR-370的表達(dá)為檢測(cè)miR-370與絨山羊毛色形成的相關(guān)性，采用qRT-PCR檢測(cè)了miR-370在白色和棕色絨山羊皮膚組織中的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，棕色絨山羊皮膚組織中miR-370的表達(dá)顯著高于白色絨山羊皮膚組織(P<0.05)。

圖1 白色和棕色絨山羊皮膚組織中miR-370的表達(dá)

2.2 白色和棕色絨山羊皮膚組織中的黑色素含量為檢測(cè)白色和棕色絨山羊皮膚組織中黑色素含量的差異，采用NaOH裂解法測(cè)定了兩種毛色絨山羊皮膚組織中的黑色素含量，結(jié)果如圖2所示，棕色絨山羊皮膚組織的黑色素含量極顯著高于白色絨山羊皮膚組織的黑色素含量(P<0.01)。

圖2 白色和棕色絨山羊皮膚組織中黑色素含量

2.3 Wnt3a和KITLG 在白色和棕色絨山羊皮膚組織中的表達(dá)采用qRT-PCR法檢測(cè)了miR-370的靶基因(Wnt3a和KITLG )在白色和棕色絨山羊皮膚組織中的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示，棕色絨山羊皮膚組織中Wnt3a和KITLG的表達(dá)均顯著高于白色絨山羊皮膚組織。

圖3 Wnt3a、KITLG在白色和棕色絨山羊皮膚中的表達(dá)

2.4 Wnt3a和KITLG在白色和棕色絨山羊皮膚組織中的分布采用免疫組化方法測(cè)定了不同毛色絨山羊皮膚組織中Wnt3a和KITLG的分布，結(jié)果顯示，Wnt3a、KITLG在絨山羊皮膚組織的表皮和內(nèi)、外根鞘均有表達(dá)，在棕色絨山羊皮膚組織的毛乳頭也有表達(dá)(圖4，5)。但不同被毛顏色絨山羊Wnt3a和KITLG表達(dá)水平不同，在白色絨山羊中，Wnt3a和KITLG染色呈弱陽(yáng)性(圖4A，C)，而在棕色絨山羊中，Wnt3a和KITLG染色呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖5A，C)，對(duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性染色(圖4B，5B)。

A，C.分別為Wnt3a、KITLG在白色絨山羊皮膚的表達(dá)；B.對(duì)照組。1，2，3，4分別為基底層、內(nèi)、外根鞘和毛乳頭圖4 Wnt3a和KITLG在白色絨山羊皮膚組織中的分布(10×)

A，C.分別為Wnt3a、KITLG在棕色絨山羊皮膚的表達(dá)；B.對(duì)照組。1，2，3,4分別為基底層、內(nèi)外根鞘和毛乳頭圖5 Wnt3a和KITLG在棕色絨山羊皮膚組織中的分布(10×)

3 討論

黑色素細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生黑色素在皮膚和頭發(fā)色素沉積中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們起源于神經(jīng)嵴的黑素母細(xì)胞，在胚胎發(fā)生過(guò)程中遷移到表皮和毛囊中[18]。黑色素細(xì)胞在黑色素小體中合成黑色素，然后將黑色素顆粒轉(zhuǎn)移到相鄰的角質(zhì)形成細(xì)胞，最終積聚生成有色皮膚或不同顏色的毛發(fā)[19]。本研究通過(guò)酶解法提取皮膚黑色素，以NaOH溶解法測(cè)定黑色素含量[20]，發(fā)現(xiàn)棕色絨山羊皮膚的黑色素含量顯著高于白色絨山羊皮膚黑色素含量，這一結(jié)果與HU等[21]發(fā)現(xiàn)黑色獺兔皮膚黑色素含量多，而白色獺兔皮膚黑色素含量少的結(jié)果一致，表明深色皮膚中黑色素含量較多。

研究人員通過(guò)檢測(cè)黑素細(xì)胞靶向的Dct-LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)Wnt3a蛋白在毛囊發(fā)育的生長(zhǎng)期，在表皮、隆起處、內(nèi)根鞘前體細(xì)胞和毛球細(xì)胞(包括黑素細(xì)胞和黑色素干細(xì)胞)高表達(dá)；在退行期，Wnt3a的表達(dá)逐漸下降，僅表達(dá)在隆起處；在休止期，毛囊內(nèi)未見(jiàn)Wnt3a蛋白表達(dá)；當(dāng)毛囊發(fā)育進(jìn)入下一個(gè)生長(zhǎng)期時(shí)，Wnt3a蛋白再次在毛球和黑素細(xì)胞中表達(dá)[9]。研究人員通過(guò)免疫組化檢測(cè)了Wnt3a在羊駝皮膚組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Wnt3a廣泛表達(dá)于毛球、根鞘和表皮，且高表達(dá)于棕色羊駝皮膚[22]。本研究也發(fā)現(xiàn)Wnt3a在絨山羊皮膚組織的表皮、毛乳頭和內(nèi)、外根鞘表達(dá)，且在棕色絨山羊皮膚組織中高表達(dá)，表明Wnt3a參與動(dòng)物毛發(fā)顏色的形成。

據(jù)報(bào)道，KITLG在黑素細(xì)胞的終末分化中起關(guān)鍵作用，為頭發(fā)色素沉積所必需[14]。KITLG及其受體KIT的變異會(huì)導(dǎo)致色素沉積的改變。在人類，KITLG基因的編碼序列變異已被證明可導(dǎo)致家族進(jìn)行性色素沉積，伴有或不伴有色素沉積，以及2型阿斯瓦爾登堡綜合征(伴有色素異常)。在對(duì)過(guò)表達(dá)miR-137的轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制KITLG/KIT信號(hào)通路中KIT和TRP-2的表達(dá)可抑制小鼠黑色素細(xì)胞的黑色素合成[23]。研究發(fā)現(xiàn)在絨山羊和水貂中，淺色動(dòng)物的KITLG表達(dá)低于深色動(dòng)物[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)KITLG表達(dá)于表皮、內(nèi)、外根鞘和毛乳頭，且在棕色絨山羊皮膚中表達(dá)量較高，表明KITLG在毛色形成中發(fā)揮重要作用。

綜上，本研究通過(guò)分析miRNA-370和靶基因在絨山羊皮膚的表達(dá)及分布，發(fā)現(xiàn)Wnt3a、KITLG在絨山羊皮膚組織的表皮和內(nèi)、外根鞘及棕色皮膚組織的毛乳頭有表達(dá)；miR-370在棕色絨山羊皮膚中的表達(dá)量及黑色素含量均高于白色絨山羊，表明miR-370可能通過(guò)正調(diào)控靶基因Wnt3a、KITLG從而作用于絨山羊毛色的形成。本研究為闡明絨山羊毛色形成機(jī)制奠定了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。