仇汝龍，范志宇，胡 波，宋艷華，魏后軍，陳萌萌，朱偉峰，薛家賓，王 芳 (江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

兔呼吸道疾病由細(xì)菌、支原體和病毒等因素引發(fā)，在兔疾病中發(fā)生率僅次于兔腸道疾病[1-2]。隨著我國(guó)家兔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，中國(guó)已經(jīng)成為世界家兔養(yǎng)殖和消費(fèi)的大國(guó)，兔養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；图s化造成疾病的快速傳播，其中呼吸道疾病的發(fā)病率也急劇增加[3]。根據(jù)家兔呼吸道病流行病學(xué)調(diào)查[4]，細(xì)菌是引發(fā)兔呼吸道疾病的主要病因，其中多殺性巴氏桿菌是家兔呼吸道疾病的主要致病菌，普遍存在于群居的家兔，常感染成年兔引起兔鼻炎、肺炎及敗血癥等疾病，且發(fā)病率和致死率隨兔日齡而增長(zhǎng)[5]。在患有呼吸道疾病的兔中常常會(huì)檢出支氣管敗血波氏桿菌，因此該菌被認(rèn)為是共生病原或者是多殺性巴氏桿菌致病的誘因。然而與多殺性巴氏桿菌不同的是，支氣管敗血波氏桿菌經(jīng)常感染幼兔并導(dǎo)致其發(fā)病[6-7]；銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌也被認(rèn)為是常導(dǎo)致兔呼吸道病的致病菌[8]，其臨床癥狀與多殺性巴氏桿菌相似，患病兔在臨床上主要表現(xiàn)為精神不振、呼吸困難和食欲消退等癥狀；肺部癥狀主要有肺出血、化膿等[9]。4種呼吸道致病菌引發(fā)的疾病的臨床癥狀與肺部病理變化相似，且常常為混合感染，不利于臨床鑒別和診斷。另外，銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌也是引發(fā)人下呼吸道感染的主要致病菌。國(guó)內(nèi)外報(bào)道顯示，銅綠假單胞菌的感染率常年居下呼吸道感染的首位[10]。因此，建立可快速、有效地鑒定常見(jiàn)家兔呼吸道致病菌的診斷方法迫在眉睫。

本研究建立的4種常見(jiàn)家兔呼吸道疾病致病菌多重PCR方法，可以對(duì)銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌進(jìn)行快速鑒定，對(duì)于疾病診斷和細(xì)菌分離鑒定具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與臨床樣本兔源多殺性巴氏桿菌C51-17株(保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)：CCTCC M 2018401)、銅綠假單胞菌JS17株、支氣管敗血波氏桿菌JS06株、肺炎克雷伯氏菌SD18株(由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存)、腸炎沙門菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、兔出血癥病毒、金黃色葡萄球菌均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供。臨床樣本來(lái)自山東、四川、江蘇、浙江、福建、河南等地區(qū)的規(guī)模化兔場(chǎng)采集的37份肺臟和21份鼻拭子。

1.2 主要試劑與儀器TaqPro HS DNA聚合酶購(gòu)自諾唯贊生物科技股份有限公司；DL2000 DNA Marker和瓊脂糖等購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；核酸蛋白測(cè)定儀NanoDrop購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司；Eppendorf Mastercycler PCR儀購(gòu)自美國(guó)艾本德中國(guó)有限公司；冷凍研磨儀MB-48LD購(gòu)自浙江美壁儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)Centrifuge 5804R購(gòu)自美國(guó)艾本德中國(guó)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成參考GenBank中已發(fā)布的多殺性巴氏桿菌KMT1基因(GenBank登錄號(hào):CP028927.1)、支氣管敗血波氏桿菌flaA基因(GenBank登錄號(hào):CP022962.2)、銅綠假單胞菌gyrA基因(GenBank登錄號(hào)：NC002516.2)和肺炎克雷伯氏菌rcsA基因序列[11](GenBank登錄號(hào)：NC_016845.1)，利用Primer3.0軟件設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物[12]，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，引物序列及及相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 多重PCR引物序列及相關(guān)信息

1.4 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化將銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌的DNA分別稀釋至100 μg/L，等量混勻作為核酸模板。多重PCR反應(yīng)優(yōu)化包括退火溫度的優(yōu)化(55.1，55.6，56.3，57.5，58.8，60.0，61.2，62.5℃)以及多重引物濃度優(yōu)化(由25 μmol/L倍比稀釋為8個(gè)濃度梯度)。PCR反應(yīng)體系：5×Taq Pro Buffer(Mg2+Plus) 5 μL ，Taq Pro HS DNA聚合酶0.25 μL，4對(duì)上、下游引物(最佳濃度)共4 μL，混合模板DNA 1 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性2 min；95℃ 變性 30 s，55～60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

1.5 多重PCR特異性試驗(yàn)制備多殺性巴氏桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和支氣管敗血波氏桿菌DNA的混合和單一模板，另外分別提取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和沙門菌的DNA及兔出血癥病毒RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，以ddH2O為空白對(duì)照，進(jìn)行特異性檢測(cè)。

1.6 多重PCR敏感性試驗(yàn)將銅綠假單胞菌、多殺性巴氏桿菌、肺炎克雷伯氏菌和支氣管敗血波氏桿菌的DNA調(diào)整至100 μg/L，等量混合至每種細(xì)菌DNA的質(zhì)量濃度為25 μg/L，以10倍梯度進(jìn)行稀釋，稀釋至第8個(gè)稀釋度，檢測(cè)該多重PCR對(duì)4種細(xì)菌病原的敏感性。

1.7 人工感染及兔肺臟病原菌的多重PCR檢測(cè)將25只4月齡試驗(yàn)兔隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只，采用肺部注射的方式進(jìn)行人工感染，注射劑量為1 mL，攻毒劑量分別為多殺性巴氏桿菌 20 CFU、支氣管敗血波氏桿菌 1×109CFU、肺炎克雷伯菌 1×102CFU、銅綠假單胞菌 1×108CFU。由于多殺性巴氏桿菌感染發(fā)病較快，所以接種后24 h，對(duì)5只接種多殺性巴氏桿菌的試驗(yàn)兔實(shí)施安樂(lè)死并取肺臟。攻毒后48 h，取剩余試驗(yàn)兔肺臟，進(jìn)行勻漿和離心，收取上清為目的樣品。分別以4種病原菌感染肺臟的樣品等比例混合作為混合樣品和未感染兔肺臟樣品為模板，按照試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌DNA并進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.8 臨床樣品的檢測(cè)利用已建立的4種家兔呼吸道致病菌多重PCR方法，對(duì)從山東、四川等地區(qū)的規(guī)?；脠?chǎng)采集的37份具有明顯病變的肺組織和21份具有明顯鼻炎癥狀兔的鼻試子進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)與單一PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證該多重PCR方法的可靠性。單一PCR檢測(cè)參照TOWNSEND等[13]建立的多殺性巴氏桿菌特異性PCR方法，HOZBOR等[14]建立的支氣管敗血波氏桿菌特異性PCR方法，張偉等[15]建立的銅綠假單胞菌PCR檢測(cè)方法，王貴升等[16]建立的肺炎克雷伯氏菌PCR檢測(cè)方法。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR反應(yīng)的建立及條件優(yōu)化以銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌的DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，試驗(yàn)溫度分別為55.1，55.6，56.3，57.5，58.8，60.0，61.2，62.5℃；混合引物濃度由25 μmol/L倍比稀釋至第6稀釋度。結(jié)果表明，退火溫度為57.5℃時(shí)擴(kuò)增效果最佳(圖1)，最佳的引物終濃度為125 nmol/L(圖2)。經(jīng)優(yōu)化后，多重PCR反應(yīng)體系：5×PCR Buffer(Mg2+Plus)5 μL，引物(每種引物濃度為6.25 μmol/L，各0.5 μL)4 μL，模板DNA 2 μL，Taq Pro HS DNA聚合酶 0.5 μL，ddH2O 13.5 μL。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，57.5℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

M.DL2000 DNA Marker；1～8. 55.1～62.5℃圖1 PCR退火溫度的優(yōu)化

M.DL2000 DNA Marker;1～8.500.00～3.90 nmol/L圖2 PCR引物濃度的優(yōu)化

2.2 特異性試驗(yàn)使用本試驗(yàn)建立的4重PCR方法對(duì)兔源銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌樣品的目的基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，條帶大小分別為797，558，321，122 bp，而對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、魏氏梭菌和沙門菌、兔病毒性出血癥病毒cDNA和超純水均無(wú)特異性條帶(圖3)，表明該方法具有較好的特異性。

M.DL2000 DNA Marker；1.4種細(xì)菌混合模板；2.銅綠假單胞菌；3.肺炎克雷伯氏菌；4.多殺性巴氏桿菌；5.支氣管敗血波氏桿菌；6.金黃色葡萄球菌；7.大腸桿菌；8.產(chǎn)氣莢膜梭菌；9.沙門菌；10.兔出血癥病毒cDNA；11.陰性對(duì)照?qǐng)D3 PCR特異性試驗(yàn)

2.3 敏感性試驗(yàn)敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的多重PCR方法對(duì)銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌DNA的最低檢出質(zhì)量濃度分別為2.5×10-1，2.5×100，2.5×10-2，2.5×10-2μg/L(圖4)。

M.DL2000 DNA Marker；1～7. 2.5×101～2.5×10-5 μg/L圖4 PCR敏感性試驗(yàn)

2.4 人工感染及兔肺臟多重PCR檢測(cè)通過(guò)肺部注射方式人工感染20只試驗(yàn)兔，于接菌后24，48 h采集兔肺臟，分別取4種致病菌感染組的一份兔肺臟樣本等比例混合，最后獲得5份包含4種致病菌的混合樣本，對(duì)照組混合成為1份樣本，對(duì)6份樣本進(jìn)行多重PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，5份混合細(xì)菌樣本均檢測(cè)為陽(yáng)性，對(duì)照組則為陰性(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker；P.陽(yáng)性對(duì)照；N.陰性對(duì)照；1～5. 4種細(xì)菌混合兔肺臟樣本；6.對(duì)照組兔肺臟樣本圖5 多重PCR檢測(cè)人工感染兔肺臟

2.5 臨床樣品的檢測(cè)應(yīng)用建立的多重PCR方法對(duì)兔37份肺組織和21份鼻拭子進(jìn)行檢測(cè)(表2)。比較多重PCR與單一PCR的檢測(cè)結(jié)果，可見(jiàn)兩種方法的陽(yáng)性檢出率無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明該多重PCR方法具有可靠性。

表2 臨床樣本PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

隨著家兔養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，中國(guó)已成為世界第一家兔養(yǎng)殖、出口及消費(fèi)大國(guó)。家兔養(yǎng)殖的發(fā)展也正向規(guī)模化、集約化、機(jī)械化和程序化邁進(jìn)，然而養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大導(dǎo)致疾病的快速傳播。兔呼吸道疾病對(duì)兔養(yǎng)殖業(yè)的危害僅次于兔腸道疾病，是引發(fā)兔發(fā)病和死亡的主要疾病之一。兔呼吸道疾病的誘因主要有生物因素和環(huán)境因素[17]，其中生物因素主要是致病性細(xì)菌，特別是多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌，它們也是人獸共患致病菌，對(duì)兔場(chǎng)人員的健康造成威脅。多殺性巴氏桿菌是兔呼吸道疾病的主要致病菌，支氣管敗血波氏桿菌也經(jīng)常在患病兔呼吸道檢出，它們引發(fā)感染的臨床癥狀相似，病理變化也難以準(zhǔn)確區(qū)分。肺炎克雷伯氏菌和銅綠假單胞菌均會(huì)引起兔肺炎，肺炎克雷伯氏菌還會(huì)引發(fā)敗血癥等癥狀，并且它們還會(huì)和多殺性巴氏桿菌及支氣管敗血波氏桿菌混合感染兔呼吸道，導(dǎo)致難以通過(guò)臨床癥狀及病理變化準(zhǔn)確區(qū)分。盡管鄧釗賓等[18]分別建立了針對(duì)兔出血癥病毒及細(xì)菌的4重PCR，但是尚未有針對(duì)銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌4種呼吸道疾病致病菌的多重PCR檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)根據(jù)銅綠假單胞菌的gyrA基因、肺炎克雷伯氏菌的rcsA基因、多殺性巴氏桿菌的KTM1基因和支氣管敗血波氏桿菌的flaA基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)多對(duì)引物，經(jīng)多次驗(yàn)證后篩選出4對(duì)可同時(shí)特異性的擴(kuò)增出相應(yīng)目的片段的引物，作為建立多重PCR方法的引物。通過(guò)對(duì)退火溫度和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的PCR反應(yīng)條件。敏感性試驗(yàn)結(jié)果證明，本試驗(yàn)建立的針對(duì)4種致病菌的多重PCR方法的最低模板質(zhì)量濃度為0.025～2.5 μg/L，低于已報(bào)道的多重PCR方法可檢測(cè)的最低模板質(zhì)量濃度，如夏穎等[19]建立的方法的最低模板質(zhì)量濃度為1 μg/L，說(shuō)明該方法具有較高的敏感性，達(dá)到對(duì)臨床樣本檢測(cè)的濃度要求[20]。該多重PCR方法可特異的擴(kuò)增4種致病菌的相應(yīng)靶基因片段，對(duì)其他5種常見(jiàn)的家兔傳染病病原均無(wú)擴(kuò)增條帶，證明本方法有較強(qiáng)的特異性。臨床肺組織和鼻拭子樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌的檢出率較高；同時(shí)也存在綠膿桿菌、肺炎克雷伯氏菌的感染，與王孝友等[21]和任克良等[22]報(bào)道相似。該方法與單一PCR進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異；該方法1次反應(yīng)僅耗時(shí)2.5 h，比已報(bào)道的多重PCR時(shí)間縮短1/2。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的檢測(cè)4種呼吸道疾病致病菌的多重PCR方法具有良好的特異性和靈敏性且反應(yīng)時(shí)間短，可用于家兔呼吸道病的快速鑒別診斷，可為4種家兔呼吸道傳染病的流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)手段。