張成東，任戰(zhàn)軍，楊雪嬌

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝mtDNACytb基因和D-loop序列的遺傳多樣性

張成東，任戰(zhàn)軍，楊雪嬌

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 研究蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝的遺傳多樣性，以全面揭示中國雙峰駝的起源進(jìn)化，為科學(xué)保護(hù)和利用我國的雙峰駝遺傳資源奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?采集15峰蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝(10峰雄駝和5峰雌駝)的血樣，提取其DNA，采用PCR方法擴(kuò)增線粒體DNA(mtDNA)細(xì)胞色素b (Cytb)基因的全序列及D-loop的671 bp序列，進(jìn)行遺傳多樣性分析，并結(jié)合GenBank中已有的雙峰駝的mtDNACytb基因序列和D-loop序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。【結(jié)果】 蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝mtDNACytb基因中存在10個變異位點，共形成了7種單倍型，單倍型多樣度為0.857±0.065，核苷酸多樣度為0.001 94±0.002 70，平均核苷酸差異數(shù)為2.210；在D-loop的671 bp序列中，存在6個變異位點，共定義了6種單倍型，單倍型多樣度為0.714±0.116，核苷酸多樣度為0.002 53±0.002 75，平均核苷酸差異數(shù)為 1.695?；贑ytb基因和D-loop序列進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析均顯示，蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝與野生雙峰駝歸于2個不同的母系世系，野生雙峰駝不是蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝的直接祖先?！窘Y(jié)論】 蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝mtDNACytb基因和D-loop序列遺傳多態(tài)性均比較豐富；蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝與野生雙峰駝歸于2個不同的母系世系，野生雙峰駝不是蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝的直接祖先；家養(yǎng)雙峰駝內(nèi)部存在著一定的遺傳分化。

蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝；mtDNACytb基因；mtDNA D-loop序列

家養(yǎng)雙峰駝隸屬哺乳動物偶蹄目(Artiodactyla)，駱駝科(Camelidae)，駱駝屬(Camelus)，雙峰駝(Camelusbactrianus)種。我國家養(yǎng)雙峰駝主要分布于內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、青海、寧夏5個省區(qū)的荒漠和半荒漠地區(qū)，是沙漠和荒漠地區(qū)人民生活不可缺少的畜力之一。由于主產(chǎn)區(qū)相距較遠(yuǎn)，駱駝品種間血液交流較少，加之受現(xiàn)代交通、農(nóng)業(yè)發(fā)展和駝產(chǎn)品開發(fā)的影響，駱駝存欄量急速下降，導(dǎo)致品種遺傳資源急劇衰竭。因此，揭示各產(chǎn)區(qū)家養(yǎng)雙峰駝群體的遺傳多樣性和血緣來源，理清起源進(jìn)化關(guān)系，對駱駝群體遺傳資源的保護(hù)和開發(fā)利用有重要意義。

在家養(yǎng)動物的起源進(jìn)化研究中，最基本的科學(xué)問題是野生祖先的來源、起源地及馴化時間[1]。Stanley等[2]首次對駱駝屬物種的線粒體DNA(mtDNA)細(xì)胞色素b(Cytb)基因全序列進(jìn)行了分析，得出的Camelini-Lamini的分化時間與化石記錄一致。這引發(fā)了人們用分子學(xué)研究方法對家養(yǎng)雙峰駝野生祖先來源的不斷探索。Wang等[3]認(rèn)為，駱駝與偶蹄目動物的分化時間為5 500～6 000萬年前。Cui等[4]認(rèn)為，雙峰駝和單峰駝在從北美洲往亞洲遷徙之前已經(jīng)分化。Han等[5]利用EcoRⅠ、PvuⅡ、ScaⅠ內(nèi)切酶對我國雙峰駝資源進(jìn)行了限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析，發(fā)現(xiàn)野生雙峰駝和家養(yǎng)雙峰駝線粒體基因的酶切條帶存在差異，這從一個側(cè)面為野生雙峰駝是不同于家養(yǎng)雙峰駝的物種提供了分子學(xué)證據(jù)。而吉日木圖[6]研究認(rèn)為，現(xiàn)存的野生雙峰駝具有遠(yuǎn)古血統(tǒng)和系譜，是家養(yǎng)雙峰駝的祖先，其在進(jìn)化上的分歧時間為600萬年。此后，高宏巍等[7]用基因組DNA微衛(wèi)星標(biāo)記分析認(rèn)為，野生雙峰駝既不是家養(yǎng)雙峰駝的祖先，也不是從家養(yǎng)雙峰駝野化而來的。張勇等[8]分析了2峰阿爾金山野生雙峰駝和已有的雙峰駝的mtDNACytb基因序列，表明現(xiàn)有的雙峰駝可分為2個種群：新疆種群和甘肅種群(二者尚未達(dá)到種間水平)，二者可能是由2個不同的原始雙峰駝祖先種群進(jìn)化而來的(阿爾金山野生雙峰駝屬于新疆種群)。程佳等[9]分析了家養(yǎng)雙峰駝和野生雙峰駝mtDNACytb的部分基因序列，結(jié)果表明家養(yǎng)雙峰駝起源于同一母系，與野生雙峰駝非同一母系起源，認(rèn)為我國家養(yǎng)雙峰駝的祖先與現(xiàn)存的野生雙峰駝并非同一個亞種。Ji等[10]對 3 峰野生雙峰駝和 18 峰家養(yǎng)雙峰駝的mtDNACytb基因序列進(jìn)行了分析，認(rèn)為現(xiàn)存的野生和家養(yǎng)駱駝有各自獨立的母系起源，而且2個亞種之間的分化可能發(fā)生在 70 萬年前。以上研究表明，家養(yǎng)雙峰駝的野生祖先來源存在一定分歧，而且其起源地及馴化時間等問題也未得到解決，有待進(jìn)一步研究。

我國駱駝分布在面積約1.1×107km2的干旱荒漠草原上，占我國國土總面積的11.4%，地跨北緯37°～50°、東經(jīng)76°～124°。依據(jù)駱駝生存的地理環(huán)境差異及其表型差異，可將其劃分為新疆南疆駝、北疆駝、東疆駝，甘肅河西駝，青海駝，內(nèi)蒙古阿拉善駝和蘇尼特駝等地方品種。近年來，對家養(yǎng)雙峰駝各地方品種間的遺傳差異性研究已有一些報道，權(quán)潔霞等[11]利用ApaⅠ、AvaⅠ等18種限制性內(nèi)切酶對阿拉善沙漠駝、阿拉善戈壁駝和新疆駝3個類群87峰個體的mtDNA進(jìn)行了限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析，結(jié)果表明我國的家駝mtDNA內(nèi)存在較豐富的遺傳多樣性，mtDNA在這3個類群之間沒有明顯的遺傳分化，遺傳變異主要來自群體內(nèi)的差異。高宏巍等[7]首次用雙峰駝基因組DNA 16個微衛(wèi)星標(biāo)記，對中國6個地區(qū)和蒙古國7個地區(qū)(含5峰野駱駝)的雙峰駝進(jìn)行了研究，結(jié)果表明中國和蒙古國家養(yǎng)雙峰駝群體間遺傳分歧并不顯著。王樂等[12]、何曉紅等[13]采用微衛(wèi)星標(biāo)記對中國不同地區(qū)的駱駝進(jìn)行遺傳多樣性分析，將中國駱駝劃分為2個支系(阿拉善駝、河西駝、東疆駝聚為一個支系，北疆駝和南疆駝聚為另一個支系)。程佳[14]、何曉紅[15]對中國家養(yǎng)雙峰駝mtDNA D-loop區(qū)序列的分析表明，中國家養(yǎng)雙峰駝的遺傳多樣性較為豐富，家養(yǎng)雙峰駝存在一次不完全的群體擴(kuò)張。以上研究結(jié)果表明，中國家養(yǎng)雙峰駝各種群間存在一定的遺傳分化，但因樣本含量和研究方法的不同，各種群間的遺傳分化結(jié)果存在差異，需要擴(kuò)大樣本量和采用多種研究方法進(jìn)行深入研究。

綜上可知，分析mtDNACytb基因和D-loop序列都是研究駱駝母系起源進(jìn)化的有效手段，但是聯(lián)合使用這2個基因片段進(jìn)行研究的文獻(xiàn)較少。為了更全面地揭示蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝的遺傳多樣性水平及其系統(tǒng)地位，本研究擬聯(lián)合使用mtDNACytb基因和D-loop序列，來研究蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝的遺傳多樣性及其起源進(jìn)化問題，以期為科學(xué)保護(hù)我國的雙峰駝遺傳資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特右旗，共采集15峰家養(yǎng)雙峰駝(10峰雄駝和5峰雌駝)頸靜脈血樣10 mL/峰，用ACD抗凝劑抗凝，冰凍帶回實驗室，-80 ℃保存。

1.2 引物設(shè)計與合成

Cytb基因引物使用項目組設(shè)計的引物[9]，D-loop序列引物使用文獻(xiàn)[14]所用的引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其相關(guān)信息見表1。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA的提取 駱駝基因組總DNA用血液基因組柱式小量提取試劑盒(來自康威世紀(jì)生物科技有限公司)提取，用EpochTM微孔板分光光度計進(jìn)行核酸定量，并用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量濃度和純度，質(zhì)量濃度統(tǒng)一稀釋為50 ng/μL，-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 mtDNACytb基因和D-loop序列的PCR擴(kuò)增 各目的基因片段擴(kuò)增體系均為50 μL，其中2×TaqMaster Mix(含染料) 25 μL、上游和下游引物各2 μL、DNA模板2.5 μL、ddH2O 18.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火(溫度依引物而定)40 s，72 ℃ 40 s，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化和雙向測序。

1.4 測序結(jié)果處理及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

參照GenBank中的基因序列，用DNAMAN軟件對測得的Cytb基因片段進(jìn)行拼接，用Chromas Application 2.3.0.0軟件對所測序列峰值進(jìn)行校正，校對后用MEGA 5.10篩選出不同序列間的變異位點、簡約信息位點，確定單倍型。用DNAsp 計算單倍型多樣度(Hd) 和核苷酸多樣度(Pi)，統(tǒng)計Cytb基因同義密碼子的相對使用度。用MEGA 5.10 計算不同單倍型間的遺傳距離，構(gòu)建NJ分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 駱駝基因組DNA的提取

由圖1可見，提取的雙峰駝基因組DNA濃度和純度均較高，提取效果較好，可以用于后續(xù)的基因擴(kuò)增操作。

2.2 基于mtDNA Cyt b基因的蘇尼特雙峰駝的遺傳多樣性

2.2.1 mtDNACytb基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 由圖2可知，Cytb基因的引物能擴(kuò)增出特異性目的條帶，擴(kuò)增長度為1 140 bp，涵蓋了Cytb基因1 140 bp全長序列，可以用于進(jìn)行后續(xù)的測序工作。

2.2.2 mtDNACytb基因的堿基組成及變異 測序得到的15條蘇尼特家駝mtDNACytb基因序列，經(jīng)過序列峰值校正并與GenBank所檢索到的家養(yǎng)雙峰駝的mtDNA全序列(GenBank序列號：AP003423.1)同源比對后，剪切得到了1 140 bp 的Cytb基因全序列。本研究發(fā)現(xiàn)，蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝mtDNACytb基因共有10個變異位點，形成了7種單倍型(H1，H2，H3，H4，H5，H6，H7；表2)，變異位點占分析位點總數(shù)的0.88%，分別位于Cytb基因的261，472，714，723，819，862，911，960，1 000和1 020 bp處，包括8個轉(zhuǎn)換和2個顛換，無插入/缺失突變；有6個簡約信息位點。8個轉(zhuǎn)換位點中，T-C轉(zhuǎn)換位點有7個，共發(fā)生13次轉(zhuǎn)換；A-G轉(zhuǎn)換位點1個，共發(fā)生2次轉(zhuǎn)換。2個顛換位點中，A-C顛換位點1個，共發(fā)生1次顛換：A-T顛換位點1個，共發(fā)生2次顛換。轉(zhuǎn)換/顛換(R，由DNAsp軟件計算得來)為4.82。由表2可知，Cytb基因472，819，1 000 bp處為非同義突變，分別導(dǎo)致了Cytb第158個氨基酸由蘇氨酸(T)轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?P)、第304個氨基酸由異亮氨酸(I)轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(T)、第334個氨基酸由蘇氨酸(T)轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?A)。表明蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝Cytb基因符合中性進(jìn)化。

圖1 蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝基因組DNA的提取
M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；S1M～S5M.5峰雌駝;S1G～S10G.10峰雄駝。圖2,4同
Fig.1 DNA of Sunite domestic bactrian camel
D.DNA Marker;S1M-S5M.5 femal camels;S1G-S10G.10 male camels.The same for Fig.2 and Fig. 4

圖2 蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝Cytb基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.2 Amplification ofCytbgene of Sunite domestic bactrian camel

堿基組成分析結(jié)果(表3)表明，T、C、A、G的平均含量分別為27.8%，28.2%，29.0%和15.0%。A+T的平均含量(56.8%)高于C+G的平均含量(43.2%)。在Cytb基因中，堿基的使用在密碼子的3個位點存在差異，在密碼子第1位點4種堿基除A堿基(28.9%)含量略高外,其余堿基使用較為均衡；密碼子第2位點和第3位點堿基的使用有明顯的偏倚性，密碼子的第2位點T堿基平均使用頻率高達(dá)41.8%，G堿基平均使用頻率為13.9%；密碼子的第3位點A堿基平均使用頻率為38.6%，A+C的平均使用頻率高達(dá)73.2%，G堿基平均使用頻率僅為8.4%。由表4可知，15峰蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝mtDNACytb基因中，不同密碼子的相對使用度(RSCU值)不同，RSCU>1的密碼子除CGT(R)外均以A或C結(jié)尾，說明NNA和NNC型密碼子是Cytb基因偏愛的密碼子，而以T和G結(jié)尾的密碼子RSCU值多小于1，說明以T或G結(jié)尾的密碼子出現(xiàn)的頻率較低，是Cytb基因非偏愛的密碼子。

表3 蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝mtDNACytb基因的堿基組成
Table 3 Base composition in mtDNACytbgene of Sunite domestic bactrain camel

注：A-1表示密碼子1位為A堿基。其他情況依此類推。

Note:“A-1” represents that the first site of a codon is A.The similar for other cases.

在7種單倍型中，H1為優(yōu)勢單倍型，單倍型頻率為33.33%(表2)，單倍型多樣度為0.857±0.065，核苷酸多樣度為0.001 94±0.002 70，平均核苷酸差異數(shù)為2.210。表明蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝群體的mtDNACytb基因遺傳多樣性比較豐富。變異位點的Tajima’s D值(由MEGA 5.10軟件計算得到)為-1.071 66，P>0.10，差異不顯著，說明蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝mtDNACytb基因符合中性進(jìn)化。

2.2.3 mtDNACytb基因不同單倍型間的遺傳距離 由表5可知，蘇尼特雙峰駝Cytb基因不同單倍型間的遺傳距離為0.001～0.005，平均遺傳距離為0.002。單倍型H7與其他單倍型的遺傳距離較遠(yuǎn)，為0.004～0.005，平均為0.004，遠(yuǎn)大于種內(nèi)平均遺傳距離0.002。野生雙峰駝與蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝的遺傳距離為0.026～0.028，平均遺傳距離為0.027。H2單倍型與野生雙峰駝的遺傳距離較近，為0.026；H3和H5單倍型與野生雙峰駝的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.028。單峰駝與雙峰駝的種間遺傳距離為0.105～0.116，平均遺傳距離為0.108；羊駝與駱駝屬的遺傳距離為0.171～0.183，平均遺傳距離為0.175，單峰駝與羊駝的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.183。

注：FE、DR、LP分別為野生雙峰駝、單峰駝、羊駝；對角線下方為遺傳距離，對角線上方為標(biāo)準(zhǔn)誤。表9同。

Note:FE,DR,and LP represent wild bactrain camel,dromedary camel and lama,respectively.Below the diagonal are genetic distance while above the diagonal are standard error.The same for Table 9.

2.2.4 mt DNACytb基因分子系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 根據(jù)表6中Cytb基因序列，用MEGA 5.10軟件，以單峰駝和羊駝為外群，基于Kimura 2-parameter Model，采用NJ法構(gòu)建蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。由圖3可以看出，家養(yǎng)雙峰駝與野生雙峰駝聚為不同類群，形成一個獨立的支系，說明野生雙峰駝不是家養(yǎng)雙峰駝的祖先。

注：括號中的數(shù)據(jù)為序列的GenBank登錄號。表10同。

Note:The numbers in brackets represent the GenBank numbers of sequences.The same for Table 10.

2.3 基于mtDNA D-loop序列的蘇尼特雙峰駝的遺傳多樣性

2.3.1 D-loop序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果 由圖4可見，PCR擴(kuò)增出約1 300 bp的特異性目的條帶，涵蓋了D-loop序列的全長序列，擴(kuò)增效果較好，擴(kuò)增產(chǎn)物可以用于膠回收以及后續(xù)的測序工作。

2.3.2 D-loop序列的測定 家養(yǎng)雙峰駝的D-loop序列全長1 225～1 247 bp，由于D-loop序列中存在連續(xù)的Poly G和Poly C結(jié)構(gòu)，造成堿基讀取困難，經(jīng)過序列峰值校正并與GenBank所檢索到的家養(yǎng)雙峰駝的mtDNA全序列(GenBank序列號：AP003423.1)同源比對、剪切后，本試驗只獲得了671 bp的可靠序列。對所測的15條序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝D-loop部分序列存在6個變異位點，形成了6種單倍型(H1，H2，H3，H4，H5，H6；表7)，占分析位點總數(shù)的0.89%，變異位點分別位于所研究序列的第54，112，161，614，663和666位點，包括5個轉(zhuǎn)換，1個顛換；有4個簡約信息位點。A-G轉(zhuǎn)換占變異位點的50%，T-C占33.33%。所研究序列的核酸組成分析結(jié)果(表8)顯示，T、C、A、G堿基的平均含量分別為26.7%，26.8%，27.9%和18.6%，其中A+T的平均含量(54.6%)高于C+G的平均含量(45.4%)。

6種單倍型中，H1單倍型為優(yōu)勢單倍型，單倍型頻率為33.33%(表7)，單倍型多樣度為0.714±0.116，核苷酸多樣度為0.002 53±0.002 75，平均核苷酸差異數(shù)為1.695。變異位點的Tajima’s D值為-0.284 63，P>0.10，差異不顯著，說明蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝D-loop序列符合中性進(jìn)化。

2.3.3 D-loop序列不同單倍型間的遺傳距離 由表9可知，蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝D-loop序列不同單倍型間的遺傳距離為0.002～0.006，平均遺傳距離為0.004。單倍型H6與單倍型H1、H2、H3和H4的遺傳距離較遠(yuǎn)，為0.005～0.006，平均為0.006，大于種內(nèi)平均遺傳距離0.004。野生雙峰駝與蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝的遺傳距離為0.022～0.025，平均遺傳距離為0.024。單峰駝與雙峰駝的種間遺傳距離為0.045～0.054，平均遺傳距離為0.051；羊駝與駱駝屬的遺傳距離為0.077～0.095，平均遺傳距離為 0.092，單峰駝與羊駝的遺傳距離最近，為0.077。

2.3.4 mtDNA D-loop序列分子系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 用表10中的D-loop序列，以單峰駝和羊駝為外群，用MEGA 5.10軟件，基于Kimura 2-parameter Model+G模型，采用NJ法構(gòu)建蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5 )。由圖5可以看出，家養(yǎng)雙峰駝與野生雙峰駝聚為不同支系，說明野生雙峰駝不是家養(yǎng)雙峰駝的祖先；不同地區(qū)的家養(yǎng)雙峰駝存在基因交流，但也有分化的趨勢。

3 討 論

3.1 基于mtDNA Cyt b基因?qū)μK尼特家養(yǎng)雙峰駝的遺傳多態(tài)性研究

由mtDNACytb基因序列分析可知，蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝遺傳多樣性比較豐富。由mtDNACytb基因系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，家養(yǎng)雙峰駝基本屬于一個母系世系，而與野生雙峰駝明顯屬于不同的母系世系。在家養(yǎng)雙峰駝世系內(nèi)，S8G、S10G、Normal 1和Mongolia聚為一類，并且遺傳距離計算顯示S8G和S10G與Normal 1、Mongolia遺傳距離均為0.001(數(shù)據(jù)未展示)；阿拉善家養(yǎng)雙峰駝(Alashan 2和Alashan 3)與其他雙峰駝遺傳距離較遠(yuǎn)，Alashan 3與Mongolia的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.009，與S8G和S10G的遺傳距離為0.008；雙峰駝Alashan 1、Wuwei 29、Wuwei 32及新疆博樂地區(qū)的Xinjiang 1、Xinjiang 2、Xinjiang 3與蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝的遺傳距離均較近，說明蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝與中國其他駱駝產(chǎn)區(qū)家養(yǎng)雙峰駝以及蒙古家養(yǎng)雙峰駝均存在基因交流。

蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝mtDNACytb基因不同單倍型間的遺傳距離為0.001～0.005，平均遺傳距離為0.002，單峰駝與雙峰駝的種間遺傳距離為0.105～0.116，平均遺傳距離為0.108，這與張勇等[8]的研究結(jié)果一致。野生雙峰駝與蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝的遺傳距離為0.026～0.028，平均遺傳距離為0.027，與Ji等[10]的研究結(jié)果基本一致，遠(yuǎn)大于家養(yǎng)雙峰駝不同類群之間的遺傳距離，但是小于單峰駝與雙峰駝的種間遺傳距離，這說明野生雙峰駝在mtDNACytb基因上與家養(yǎng)雙峰駝有明顯的差異，但未達(dá)到種間差異水平。

3.2 基于D-loop序列對蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝的遺傳多態(tài)性研究

由mtDNA D-loop序列NJ系統(tǒng)發(fā)育分析可知，家養(yǎng)雙峰駝屬于一個世系，而野生雙峰駝明顯屬于另一個獨立的世系，與mtDNACytb基因的分析結(jié)果一致。家養(yǎng)雙峰駝的母系世系可以分為3個類群：Xinjiang 24、Xinjiang 25、Xinjiang 45、Xinjiang 54聚為一類，稱之為新疆類群(群內(nèi)平均遺傳距離為0)；S5G、S6G、Qinghai 16、Qinghai 6、Hexi 24、Xinjiang 10、Xinjiang 11、S8G、S10G聚為一類，稱之為蒙古類群(因為依據(jù)mtDNACytb基因系統(tǒng)進(jìn)化分析，S5G、S6G、S8G、S10G與蒙古Red、Brown、Normal、Mongolia駱駝遺傳距離較近，而與其他駱駝遺傳距離較遠(yuǎn)，故稱之為蒙古類群，群內(nèi)平均遺傳距離為0.002)；其余家養(yǎng)雙峰駝聚為一類(群內(nèi)平均遺傳距離為0.001)。3個類群間的遺傳距離分析顯示，新疆類群與蒙古類群的平均遺傳距離為 0.008，與其余家養(yǎng)雙峰駝類群的平均遺傳距離為0.005，蒙古類群與其余家養(yǎng)雙峰駝類群的平均遺傳距離為0.004，各類群間的平均遺傳距離均遠(yuǎn)大于各類群內(nèi)的平均遺傳距離，說明家養(yǎng)雙峰駝世系內(nèi)在mtDNA D-loop區(qū)存在一定水平的分化。

依據(jù)mtDNA D-loop序列，蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝平均遺傳距離為0.004，蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝與野生雙峰駝平均遺傳距離為0.024，單峰駝與雙峰駝的種間平均遺傳距離為0.051，羊駝與駱駝屬的平均遺傳距離為0.092。

蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝mtDNACytb基因和D-loop序列的遺傳多態(tài)性均比較豐富?；趍tDNACytb基因和D-loop序列的遺傳距離，蘇尼特家養(yǎng)雙峰駝各單倍型間遺傳距離較近，遠(yuǎn)小于與野生雙峰駝間的遺傳距離。基于mtDNACytb基因和D-loop序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示：家養(yǎng)雙峰駝與野生雙峰駝分別歸為2個不同的母系世系，野生雙峰駝不是家養(yǎng)雙峰駝的直接祖先。但是，不同地區(qū)，以及同一地區(qū)間的家養(yǎng)雙峰駝存在一定的遺傳分化，這些分化對研究家養(yǎng)雙峰駝是多母系還是單母系起源有著很高的價值，因此還需要加大品種數(shù)量，增大樣本量，進(jìn)行更系統(tǒng)的研究。

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Genetic diversity of mtDNACytbgene and D-loop sequence of Sunite domestic bactrian camel

ZHANG Cheng-dong,REN Zhan-jun,YANG Xue-jiao

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The paper studied the genetic diversity of Sunite domestic bactrian camel to reveal the origin and evolution of bactrian camel in China and improve the protection and utilization of bactrian camel genetic resources.【Method】 The mtDNAcytbgene and D-loop of 15 Sunite domestic bactrian camels (10 male and 5 female) were sequenced and whole length mitochondrial DNA (mtDNA) cytochrome b (Cytb) gene and D-loop 671 bp sequence were obtained using PCR.Then genetic diversity and phylogenetic analysis were conducted based on obtained sequences and known sequences from GenBank.【Result】 There were 10 mutation sites and 7 different haplotypes inCytbgene of Sunite domestic bactrian camels,and their haplotype diversity,nucleotide diversity and average number of nucleotide differences were 0.857±0.065,0.001 94±0.002 70,and 2.210,respectively.In the 671 bp D-loop sequences,there were 6 mutation sites and 6 different haplotypes,and their haplotype diversity,nucleotide diversity and average number of nucleotide differences were 0.714±0.116,0.002 53±0.002 75,and 1.695,respectively.Neighbor joining (NJ) tree of mtDNACytbgene and D-loop sequence showed that Sunite domestic bactrian camel and wild bactrian camel belonged to two different lineages and wild bactrian camel was not the origin of domestic bactrian camel.【Conclusion】 Genetic diversity in mtDNACytbgene and D-loop of Sunite domestic bactrian camel were rich.Sunite domestic bactrian camel and wild bactrian camel belonged to two different lineages,and wild bactrian camel was not the origin of domestic bactrian camel.There was genetic differentiation in domestic bactrian camels.

Sunite domestic bactrian camel;mtDNACytbgene;mtDNA D-loop sequence

2013-10-20

國家自然科學(xué)基金項目(2010K01-16)

張成東(1985-)，男，河南泌陽人，在讀碩士，主要從事動物遺傳資源研究。E-mail：897823725@qq.com

任戰(zhàn)軍(1966-)，男，陜西淳化人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事經(jīng)濟(jì)動物研究。E-mail：renzhanjun@nwsuaf.edu.cn

時間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.029

S824.2

A

1671-9387(2015)03-0032-11

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.029.html