高亞桃，李 妍，劉立元，王 猛，郭姚蕊，劉勝麗，馬亞賓，蔣桂娥，劉志勇，秦建華*，趙月蘭* (.河北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河北 保定 0700;.河北省畜牧良種工作站，河北 石家莊 05006；.河北省唐山市動物疫病防控中心，河北 唐山06400)

近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，犢牛腹瀉引起的傳染病在我國廣泛流行。多種病原可引起犢牛腹瀉，導致犢牛發(fā)生細菌性、寄生蟲性和病毒性腹瀉等[1]。由病毒引起的犢牛腹瀉較為嚴重，引起犢牛消化道疾病的主要病毒有牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛輪狀病毒(bovine rotavirus,BRV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)等[2-3]。 BVDV是引起牛病毒性腹瀉/黏膜病的主要病原，各個年齡段的牛均易感，尤其是3～5周齡犢牛最易感，該病毒主要感染黃牛和奶牛，病情嚴重時可導致患病牛死亡[4-5]。BRV是引起新生犢牛腹瀉的重要病原，又稱為“犢牛腹瀉病毒”[6-7]，15日齡內犢牛對該病毒最易感，感染BRV的犢牛主要表現(xiàn)為精神沉郁、排水樣稀糞，多可引起繼發(fā)感染，發(fā)病急、死亡率高[8]。IBRV是引起牛腸炎型腹瀉的重要病原之一，可引起牛的急性、熱性、接觸性傳染病[9]，感染該病毒的牛主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，患病牛有時出現(xiàn)帶血性腹瀉，新生犢?？杀憩F(xiàn)為全身性疾病。BVDV、BRV和IBRV這3種病毒均可導致牛腹瀉、呼吸障礙、流產(chǎn)及犢牛免疫力低下等[10-11]，是引起犢牛腹瀉的重要病原，嚴重危害犢牛健康，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前對于這3種病毒的檢測主要依賴于病毒的分離鑒定、ELISA檢測方法、PCR檢測方法以及熒光定量PCR檢測方法等[12]，其中PCR檢測方法較簡單、快速、準確性高、特異性強。目前，對于這3種病毒同時進行檢測的多重PCR檢測方法還未見報道。為了能快速、同時檢測出BVDV、BRV和IBRV 3種病毒，本研究建立了一種多重PCR檢測方法，為犢牛腹瀉病的診斷和流行病學的調查提供一種有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 毒株和病料BVDV、BRV、IBRV、牛冠狀病毒(bovine coronavirus，BCoV)、牛細小病毒(bovine parvovirus，BPV)毒株和牛隱孢子蟲蟲種，均由河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院預防獸醫(yī)學實驗室分離、鑒定和保存。臨床檢測樣品為從河北省7個地區(qū)的15個養(yǎng)殖場采集的50份腹瀉犢牛糞便。

1.2 主要試劑DNA/RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒和質粒小提試劑盒購自上海匯易生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DL2000 DNA Marker購自天地人和生物科技有限公司；DH5α感受態(tài)細胞和pUC57載體購自吉林省庫美生物科技有限公司。

1.3 主要儀器PCR擴增儀和NanoDrop 2000 超微量分光光度計購自賽默飛世爾科技公司；電泳儀購自北京六一儀器廠；化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國ProteinSimple公司；離心機購自上海昆士蘭生物科技發(fā)展有限公司。

1.4 引物設計與合成根據(jù)GenBank中登錄的BVDV的5′-UTR序列、BRV的VP6基因和IBRV的gB基因，利用Primer Premier 5.0軟件設計3對特異性引物，由吉林省庫美生物科技有限公司合成，引物序列及相關信息見表1。

表1 引物序列及相關信息

1.5 病毒DNA/RNA的提取將保存在-80℃的病毒取出，反復凍融3次后，利用上海匯易生物科技有限公司的OMEGA E.Z.N.A Viral DNA/RNA Kit提取病毒DNA/RNA，將提取的IBRV的DNA保存在-20℃，BVDV和BRV的RNA保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 反轉錄cDNA的合成將1.5中提取的BVDV和BRV的RNA，利用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的HiScript?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉錄，反轉錄產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 PCR擴增以提取的BVDV和BRV的cDNA以及IBRV的DNA為模板，分別用相應引物進行單一PCR擴增，用無菌去離子水設立陰性對照。反應體系：2×Phanta Max Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA/cDNA模板1 μL，總反應體系25 μL。反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 15 s，72℃ 15 s，共35個循環(huán)；72℃ 7 min。擴增反應結束后，取5 μL PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒回收特異性條帶，回收產(chǎn)物送吉林省庫美生物科技有限公司進行測序。

1.8 多重PCR退火溫度的優(yōu)化以1.7中PCR反應的退火溫度為基準，每上下遞減1℃作為退火溫度，同時用無菌去離子水設立陰性對照。反應體系：2×Phanta Max Master Mix 12.5 μL，3種病毒的DNA/cDNA模板各1 μL，3對引物上下游各1 μL，ddH2O 3.5 μL。反應程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，54，55，56，57和58℃ 15 s，72℃ 15 s，共35個循環(huán)；72℃ 7 min。擴增反應結束后，取5 μL反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，篩選出最佳退火溫度。

1.9 多重PCR特異性試驗利用優(yōu)化的PCR反應體系，以牛隱孢子蟲、BPV和IBRV的DNA，BVDV、BRV和BCoV的cDNA為模板，用表1中的3對引物，按1.8篩選出的最佳退火溫度進行擴增。PCR結束后取5 μL產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒回收特異性擴增條帶。

1.10 多重PCR靈敏性試驗將1.9中得到的3種病毒特異性片段的膠回收產(chǎn)物送吉林省庫美生物科技有限公司進行測序鑒定，將序列正確的產(chǎn)物分別克隆至pUC57載體，獲得陽性對照質粒pUC57-UTR、pUC57-VP6和pUC57-gB。用NanoDrop 2000超微量分光分度計測定質粒濃度，根據(jù)公式計算質粒拷貝數(shù)。將3種病毒的陽性對照質粒10倍倍比稀釋至1×101copies/μL，以不同質粒拷貝數(shù)的陽性對照質粒為模板，按照優(yōu)化好的反應條件和反應體系進行PCR擴增。PCR反應結束后，取5 μL PCR反應產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，檢測所建立的多重PCR方法的靈敏性。

1.11 多重PCR重復性試驗利用已建立的多重PCR檢測方法，以構建的陽性對照質粒為模板進行PCR擴增，以相同反應條件和反應體系，在不同時間重復擴增3次，檢測該方法的重復性。

1.12 臨床樣品的檢測利用建立的多重PCR檢測方法，對從河北省部分地區(qū)15個養(yǎng)牛場采集的50份糞便樣品進行檢測。同時與單一PCR檢測方法進行比較，并計算兩種方法的符合率，符合率=(真陽性數(shù)+真陰性數(shù))/被檢總數(shù)。

2 結果

2.1 3種病毒PCR擴增結果以BVDV和BRV的cDNA和IBRV的DNA為模板，分別用相應的引物進行PCR擴增。擴增結果如圖1所示，擴增出的目的片段分別為189，144，109 bp，與預期大小相符。PCR產(chǎn)物測序后與GenBank中登錄的序列進行比對，結果顯示BVDV擴增產(chǎn)物序列與BVDV(HB-BDZ)5′-UTR部分序列的同源性為96.8%～97.9%，其中與MN513409的同源性最高，為97.9%(圖2)；BRV擴增產(chǎn)物序列與BRV(HB-DZZ) VP6部分基因的同源性為96.5%～100.0%，其中與MN047454的同源性最高，為100%(圖3)；IBRV擴增產(chǎn)物序列與IBRV(HB-XTZ)gB部分基因同源性為98.2%～100.0%，其中與MK654723、MF-287966、MG497777和KU992439的同源性最高，為100.0%(圖4)。

M.DL2000 DNA Marker；1.BVDV 5′-UTR序列；2.BRV VP6基因；3.IBRV gB基因；4.陰性對照圖1 3種病毒PCR擴增結果

圖2 BVDV 5′-UTR序列同源性比較結果

圖3 BRV VP6基因同源性比較結果

圖4 IBRV gB基因同源性比較結果

2.2 多重PCR退火溫度優(yōu)化結果分別以54，55，56，57，58℃為退火溫度，對多重PCR退火溫度進行優(yōu)化，結果如圖5所示，當退火溫度為56℃時，3種病毒的擴增條帶最亮，因此，將56℃ 15 s作為多重PCR檢測方法的最佳退火溫度和時間。最終確定多重PCR檢測方法的最佳反應條件：3種病毒的DNA/cDNA模板各1 μL，3對引物上下游各1 μL，2×Phanta Max Master Mix反應液12.5 μL，ddH2O 3.5 μL，總體系25 μL。最佳反應程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 15 s，72℃ 15 s，共35個循環(huán)；72℃ 延伸7 min。

2.3 多重PCR特異性試驗結果分別以3種病毒的DNA/cDNA混合物、BVDV、BRV和BCoV的cDNA及IBRV、BPV、牛隱孢子蟲的DNA和水為模板，用3對引物進行擴增，檢測已建立的多重PCR反應體系中引物的特異性。結果如圖6所示，以3種病毒DNA/cDNA混合物、BVDV和BRV的cDNA以及IBRV的DNA為模板，均可擴增出相應目的片段，而以BCoV的cDNA和BPV、牛隱孢子蟲的DNA為模板均未擴增出條帶，表明該檢測方法具有良好的特異性。

M.DL2000 DNA Marker；1.3種病毒DNA/cDNA混合物；2.BVDV 5′-UTR序列；3.BRV VP6基因；4.IBRV gB基因；5.BCoV；6.BPV；7.牛隱孢子蟲；8.陰性對照圖6 多重PCR特異性試驗結果

2.4 多重PCR靈敏性試驗結果利用NanoDrop 2000超微量分光分度計測定3種陽性對照質粒濃度，根據(jù)公式計算確定pUC57-UTR的拷貝數(shù)為1.44×1011copies/μL，pUC57-VP6的拷貝數(shù)為1.38×1011copies/μL，pUC57-gB的拷貝數(shù)為1.2×1011copies/μL。將3種陽性對照質粒按照10倍倍比進行稀釋，以不同質粒拷貝數(shù)梯度的陽性對照質粒為模板，按照已建立好的多重PCR檢測方法進行擴增，檢測該方法的靈敏性。結果如圖7所示，該方法的檢出限分別為BVDV 1.44×105copies/μL，BRV 1.38×105copies/μL和IBRV 1.2×105copies/uL，表明該方法具有良好的靈敏性。

M.DL2000 DNA Marker；1～10.模板量為1×10-2～1×10-11；11.陰性對照圖7 多重PCR靈敏性試驗結果

2.5 多重PCR重復性試驗結果利用已建立的多重PCR檢測方法對同一模板進行擴增，結果如圖8所示，3次不同時間的重復試驗結果一致，表明該方法具有良好的重復性。

A～C.3次不同時間的重復試驗。M.DL2000 DNA Marker；1. 3種病毒DNA/cDNA混合物；2.BVDV 5′-UTR序列；3.BRV VP6基因；4.IBRV gB基因；5.陰性對照圖8 多重PCR重復性試驗結果

2.6 臨床樣品的檢測結果利用常規(guī)PCR檢測方法和本試驗建立的多重PCR檢測方法分別對50份臨床樣品進行檢測。結果顯示，單一PCR檢測方法對BVDV、BRV和IBRV的檢出陽性率分別為41.4%(27/50)，40%(20/50),34%(17/50)；多重PCR方法對BVDV、BRV和IBRV的檢出陽性率分別為64%(32/50)，56%(28/50),46%(23/50)。其中BVDV和BRV混合感染的檢出率為 18%(9/50)，BVDV和IBRV混合感染的檢出率為14%(7/50)，BRV和IBRV混合感染的檢出率為22%(11/50)，BVDV、BRV和IBRV 3種病毒混合感染的檢出率為4%(2/50)。2種方法的總符合率分別為BVDV 90%，BRV 84%和IBRV 88%。結果表明，本研究所建立的多重PCR檢測方法能快速檢測出BVDV、BRV和IBRV 3種病原。

3 討論

牛病毒性腹瀉主要是由多種病毒引起的一種接觸性傳染性疾病，其中BVDV和BRV是引起犢牛腹瀉的主要病原。IBRV臨床上也可引起腸炎，犢牛有時甚至出現(xiàn)血便，嚴重危害犢牛健康[13-14]。臨床上，這3種病毒常呈混合感染，臨床癥狀難以區(qū)分，患病?？山K身帶毒，且可引起其他病毒或細菌的繼發(fā)感染，導致患病牛生產(chǎn)性能下降或死亡，嚴重危害牛群健康，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[15]。目前，對于這3種病原引起的犢牛腹瀉，尚沒有特效藥物，因此，盡快檢出病原，淘汰、隔離患病?；驇Ф九Ｊ强刂圃摬鞑サ挠行侄蝃16]。目前對于這3種病毒的檢測還主要依賴于病毒分離鑒定、PCR技術和ELISA等方法，PCR檢測技術由于具有操作簡便、特異性高和靈敏性強的特點，在臨床檢測時常常被采用[17-22]。

本研究根據(jù)3種病毒高度保守的基因序列如BVDV的5′-UTR序列、BRV的VP6基因和IBRV的gB基因，經(jīng)過對反應條件和退火溫度的優(yōu)化，建立了一種多重PCR檢測方法。該方法對BCoV、BPV、牛隱孢子蟲無交叉反應，具有良好的特異性；對BVDV最低的檢測拷貝數(shù)是1.44×105copies/μL，對BRV最低的檢測拷貝數(shù)是1.38×105copies/μL，對IBRV最低的檢測拷貝數(shù)是1.2×105copies/μL，具有良好的靈敏性。利用已建立的多重PCR檢測方法和單一PCR檢測方法對從河北省15個地區(qū)采集的50份臨床樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法的總符合率BVDV為90%，BRV為84%，IBRV為88%，且結果表明在秋冬季節(jié)，臨床上犢牛以感染BVDV引起腹瀉的概率最高。本研究建立的多重PCR檢測方法特異性好、靈敏度高，可以應用到臨床上對BVDV、BRV和IBRV的檢測，為檢測引起犢牛腹瀉的重要病原提供一種有效的方法。