李浩毅， 徐高倩， 劉振輝

(中國海洋大學海洋生命學院， 海洋生物多樣性與進化研究所， 山東 青島 266003)

文昌魚(Amphioxus 或Lancelet)屬于脊索動物門頭索動物亞門(Chordate，Cephalocordate)，其在終生成長過程中均具有背神經管、脊索和咽鰓裂[1]。在進化上，文昌魚是無脊椎動物進化到脊椎動物過程中的一個重要過渡類群，是研究脊椎動物起源與演化的理想的模式生物[2]。

文昌魚為雌雄異體動物，文昌魚的性腺成熟后卵巢呈淡黃色，精巢呈乳白色。除此之外，雌雄個體無外形上的差異[3]。陳大元等[4]觀察到青島文昌魚(B.belcheri)精子中部有多個線粒體存在，且出現(xiàn)了終環(huán)和隱窩等高等脊椎動物精子才存在的結構。而在文昌魚卵子皮層以內的細胞質中含有許多核糖體和線粒體，宋裕昌等曾發(fā)現(xiàn)文昌魚卵黃顆粒內存在一種由9根直徑為500～700 μm的小管呈環(huán)形排列而成的類似于“微管”的結構[5-8]。與文昌魚生殖有關的生理活動如性腺的發(fā)育、成熟，以及其排卵、釋精等過程受溫度、光照強度、海水鹽度以及性激素等多種因素的影響[9-10]。張致一等在文昌魚發(fā)育成熟的性腺中，檢測到雌激素和雄激素，這一結果證明性腺發(fā)育至成熟的過程中有性類固醇激素的參與。方永強等發(fā)現(xiàn)文昌魚生長發(fā)育從小生長期至大生長中期的過程中，17β-雌二醇、睪酮和孕酮水平呈上升趨勢，大生長中期之后開始下降，表明在文昌魚卵黃生成和精子發(fā)生的過程中，性類固醇激素參與了調控[11-14]。另外，有通過對文昌魚染色體的核型與帶型分析發(fā)現(xiàn)，青島文昌魚的染色體有36條，其中第2對染色體可能是性染色體[15]。Shi等[16]則通過性染色體連鎖基因nodal突變體繁育后代的性別比例分析顯示，佛羅里達文昌魚的性染色體屬于ZW型。

雖然研究文昌魚領域的學者們從不同方面報道了文昌魚精子和卵子的發(fā)生、胚胎發(fā)育以及器官的形成[17-27]，但關于文昌魚的性腺發(fā)育和性別分化的分子調控機制等科學問題還知之甚少，甚至連不同性別的文昌魚在基因表達上有哪些差異也不清楚。本文通過轉錄組測序的手段，探討了雌雄文昌魚基因的差異表達情況，發(fā)現(xiàn)雌雄差異表達的基因主要富集在神經活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)和細胞粘附分子(Cell adhesion molecules)通路中，為從基因水平上研究文昌魚雌雄性別的差異乃至性別分化的分子機制提供了基礎信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料樣品采集

青島文昌魚(Branchiostomajaponicum，曾用名B.belcheritsingtauense)取材于山東省青島市嶗山區(qū)沙子口附近海區(qū)。6月份采集的文昌魚處于性腺成熟期，可肉眼觀察到雌性文昌魚體內黃色顆粒狀卵巢和雄性文昌魚體內乳白色顆粒狀精巢。根據(jù)文昌魚性腺特征將雌雄文昌魚分開喂養(yǎng)，并做好標記，將細沙用滅菌海水淘洗多次以除去細沙中殘存的雜質，將細沙鋪至收納箱中至一定厚度，再倒入過濾的海水，加入充氧泵，分別放入雌雄文昌魚，并標記如下：排卵前雌魚(F1組)、釋精前雄魚(M1組)、排卵后雌魚(F2組)、釋精后雄魚(M2組)。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 每個處理組分別取3只青島文昌魚全魚樣本，將其置于DEPC處理后的1×PBS 緩沖液中清洗3遍，在液氮中研磨全魚，研磨至粉末狀后，用Invitrogen公司的TRIzol?Reagent試劑盒提取樣品總RNA。每組將3個 RNA 樣品等濃度混合后用于文庫構建。提取的 RNA 純度均滿足OD值(260/280)在1.8～2.2之間，且含量大于3.5 μg，濃度大于200 ng/μL。

1.2.2 RNA測序和質量控制 RNA樣品送到安諾優(yōu)達公司(中國北京)完成測序。待RNA樣品質檢合格后進行制備測序文庫。測序得到的某些原始下機序列，會含有測序接頭序列以及低質量序列。為了保證信息分析數(shù)據(jù)的質量，作者對原始序列進行過濾，去除接頭污染的Reads(Reads中接頭污染的堿基數(shù)大于5 bp；去除低質量的Reads(Reads中質量值Q ≤ 19的堿基占總堿基的50%)；去除含N比例大于5%的Reads；對于雙端測序，一端測序不符合上述要求，則去掉兩端Reads。得到質量較高的Clean Reads，再進行后續(xù)分析，后續(xù)分析都基于Clean Reads。

1.2.3 差異表達基因GO和KEGG富集分析 由于雌雄文昌魚差異表達基因眾多，本文設置了較高的基因差異表達的標準，將基因顯著差異表達的參數(shù)設置為|log2FoldChange|≥5和q<0.05。轉錄組序列通過計算RPKM(Reads Per Kilobase Millon Mapped Reads)值來確定基因的表達量[28]。RPKM計算公式為：

式中：RPKM(A)為基因A的表達量；R為唯一比對到基因A的Reads數(shù)；N為唯一比對到基因的總Reads數(shù)；L為基因A的長度。

此外，利用Gene Ontology(GO)[29]、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)[30]等數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行功能注釋。利用DAVID在GO數(shù)據(jù)庫中, 通過計算差異表達基因參與生物學過程、細胞組分、分子功能的超幾何分布，進行功能分類注釋和富集分析。同時，用KEGG數(shù)據(jù)庫獲得Unigenes的代謝通路注釋信息。以上分析均P<0.05作為統(tǒng)計學顯著性的閾值。

2 結果

2.1 測序結果的組裝

對于4個組別F1、F2、M1、M2的測序結果進行分析。測序組裝后的所有Reads 數(shù)分別為64 379 874、61 564 104、63 850 758、60 502 630。去掉低質量序列(當總堿基的50%的Reads是質量值Q≤19的堿基時)和接頭污染后(Reads中接頭污染的堿基數(shù)大于5 bp)的Reads數(shù)為63 179 798、60 446 482、62 606 300和59 280 314。所有組別的組裝錯誤率均小于等于0.04%，Q30均大于94%(見表 1)，說明測序與組裝質量較好。

表1 測序組裝結果統(tǒng)計

2.2 組間差異表達基因分析

對各組間差異表達的基因進行聚類分析，文昌魚排卵與釋精前組(F1組和M1組)聚為一類，文昌魚排卵與釋精后組(F2組和M2組)聚為一類，文昌魚排卵與釋精前后的基因表達差異明顯(見圖 1)。

(根據(jù)差異表達基因在每個樣品里的表達量，取以2為底的對數(shù)后，計算歐氏距離，再利用系統(tǒng)聚類法(Hierarchical Cluster)，最終得到樣品的整體聚類結果。在圖中，表達量的變化用顏色的變化表示，藍色表示表達較低，黃色表示表達量較高。According to the expression level of differentially expressed genes in each sample, the logarithm base 2 is taken to calculate the Euclidean distance, and then the Hierarchical Cluster method is used to obtain the overall clustering result of the sample. In the figure, the change of expression level is represented by the change of color, with blue indicating the low expression level and yellow indicating the high expression level.)

分別對排卵和釋精前的F1組與M1組、排卵和釋精后的F2組與M2組的轉錄組測序結果中的顯著差異表達基因進行分析, 發(fā)現(xiàn)F1組與M1組有13 434個顯著差異表達基因，其中上調基因5 737個，下調基因7 697個；F2組與M2組有5 957個顯著差異表達基因，其中上調基因2 512個，下調基因3 445個。通過火山圖將差異表達基因可視化(見圖 2)。

(橫坐標代表同樣品組中的基因表達倍數(shù)變化，縱坐標代表基因表達量的變化顯著程度，不同顏色表示不同的分類(上調、下調和不變)。The abscissa is the fold change of gene expression in different sample groups, and the ordinate is the statistically significant degree of gene expression change. Different colors indicate different classifications (up-regulated, down-regulated and unchanged).)

2.3 GO功能分析

對差異表達的基因進行GO(Gene Ontology) 富集分析，分別對F1、M1 組和F2、M2中差異表達基因的前66個GO term進行列舉，并對富集到GO中的term進行顯著性分析，發(fā)現(xiàn)F1與M1 組有295個GO term 差異富集，其中9個GO term極顯著差異富集，而F2與M2組有376個GO term 差異富集，其中3個GO term極顯著差異富集。

在F1與M1 組中的差異表達基因，在生物過程方面，大部分富集在生物粘附、生物調節(jié)等過程，如DNA的復制，細胞粘附；在分子成分方面，集中富集在細胞器、細胞膜及分子復合物等組分；在分子功能方面，主要富集在細胞過程、代謝過程，如跨膜轉運、鈣離子結合、白細胞的跨內皮遷移等。F2與M2 組的差異表達基因，生物過程部分主要以單一生物過程、對刺激的反應、細胞表面受體信號通路等功能為主；細胞組分中主要以細胞膜、細胞器等組成成分以及細胞外區(qū)為主；分子功能主以轉移酶活性、RNA結合、金屬離子結合為主(見圖 3)。

(①細胞過程；②單一生物體過程；③代謝過程；④生物調節(jié)；⑤發(fā)育過程；⑥刺激應答；⑦多細胞生物過程；⑧細胞組分組成或生物合成；⑨定位；⑩生物粘附；生殖過程；運動；多生物過程；免疫系統(tǒng)過程；生長；信號；行為；生物階段；生物間歇過程；生殖；參與化學突觸傳遞的突觸前過程;細胞聚集；解毒作用；細胞殺傷；細胞成分；膜成分；細胞器；細胞膜；細胞器成分；大分子復合體；細胞外區(qū)域成分；細胞外區(qū)域；細胞連接；突觸成分；細胞膜內腔；超分子復合體；突觸；其它生物成分；病毒體成分；類核；病毒體；線粒體相關粘附復合體；病毒包埋體；細胞；合胞體；其它生物；結合；催化；分子傳遞；運輸；信號傳遞；結構分子；細胞核結合轉錄因子；分子功能調節(jié)因子；電子傳遞；轉錄因子活性，蛋白結合；抗氧化劑；翻譯因子；化學排斥物；化學引誘物；形態(tài)發(fā)生；金屬伴侶蛋白；丙氨酸酰基載體蛋白；營養(yǎng)儲存；蛋白標簽。橫坐標為GO的三個大類及其具體的子類，左側縱坐標為差異基因在該子類中所占的比例，右縱坐標為該子類富集到的基因數(shù)。不同的顏色代表不同的組別。The abscissa is the three major classes of GO and their specific subclasses. The left ordinate is the proportion of different genes in this subclass, and the right ordinate is the number of genes enriched in this subclass. Different colors represent different groups. )

2.4 KEGG聚類分析

對于差異表達的基因進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，得到眾多差異富集的通路。F1與M1 組的差異表達基因在33個KEGG通路中較為富集，其中有7個極顯著差異富集通路，分別為神經活性配體-受體相互作用、細胞粘附分子、造血細胞系、肥大型心肌病、細胞外基質相互作用、PI3K-Akt信號通路、金黃色葡萄球菌感染；而F2與M2 組的差異表達基因在32個KEGG通路中顯著富集，其中有3個極顯著差異富集通路，包括神經活性配體-受體相互作用、細胞粘附分子、病毒性心肌炎(見圖 4)。

(①病毒性心肌炎；②弓形蟲??；③金黃色葡萄球菌感染；④小細胞肺癌；⑤沙門氏菌感染；⑥核糖體；⑦類風濕性關節(jié)炎；⑧肌動蛋白骨架調節(jié)；⑨癌癥的蛋白聚糖；⑩PI3k-Akt信號通路；吞噬體；百日咳；氮代謝；尼古丁成癮；神經活性配體-受體相互作用；瘧疾；白細胞跨內皮遷移；利什曼??；軍團??；肥大心肌??；低氧誘導因子通路;造血細胞系；谷氨酸突觸；氨基丁酸突觸；細胞外基質的相互作用；DNA復制；擴張型心肌病；補體系統(tǒng)；細胞黏附分子；上皮細胞細菌入侵；軸突導向；右室心肌??；抗原加工與遞呈；b: F2、M2組的差異表達基因 KEGG 通路。①病毒性心肌炎；②弓形蟲病；③金黃色葡萄球菌感染；④小細胞肺癌；⑤沙門氏菌感染；⑥唾液分泌；⑦類風濕性關節(jié)炎；⑧肌動蛋白骨架調節(jié)；⑨癌癥的蛋白聚糖；⑩PI3k-Akt信號通路；吞噬體；百日咳；癌癥通路；破骨細胞分化；神經活性配體-受體相互作用；瘧疾；亞油酸代謝；白細胞跨內皮遷移；利什曼?。环蚀笮募〔。坏脱跽T導因子通路;造血細胞系；糖鞘脂生物合成神經節(jié)；細胞外基質相互作用；擴張型心肌病；細胞粘附分子；鈣信號通路；上皮細胞細菌感染；軸突導向；右室心肌病；花生四烯酸代謝；黏附連接。縱坐標為通路名稱，橫坐標為富集因子，圓圈顏色代表 q value 值，顏色越紅代表顯著富集性越可靠，圓圈越大代表富集的基因數(shù)目越多。The ordinate is the name of the pathways， the abscissa is the enrichment factors.The circle color represents q value.The color is redder， the significant enrichment is more reliable.The circle is larger means the number of genes are greater.)

此外，作者也分析了排卵前后(F1組與F2組)和釋精前后(M1組與M2組)的顯著差異表達基因，結果表明排卵前后的文昌魚(F1組與F2組)有11 288個顯著差異表達的基因，釋精前后的文昌魚(M1組與M2組)有8 476個顯著差異表達的基因。對這些差異表達基因進行KEGG通路聚類分析，發(fā)現(xiàn)文昌魚排卵前后(F1組與F2組)，差異表達的基因極顯著地富集到4個KEGG通路中，分別為神經活性配體-受體相互作用、DNA復制(DNA replication)、核糖體合成和細胞粘附分子。而文昌魚釋精前后(M1組與M2組)，差異表達的基因極顯著地富集到3個KEGG通路中，包括細胞粘附分子、金黃色葡萄球菌感染和神經活性配體-受體相互作用。

3 討論

性別決定和分化是由許多不同基因控制的復雜過程，盡管人們對果蠅、小鼠等模式動物的性別分化基因有較深入的了解, 但由于不同的物種在性別分化機制上存在很大的不同，如今還很缺乏對從低等動物到人類性別分化和發(fā)育機制的進化規(guī)律的認識。文昌魚作為從無脊椎動物到脊椎動物進化的一個過渡類群, 在研究性別分化和發(fā)育的分子機制方面有其獨特的優(yōu)勢。然而目前關于文昌魚的性腺發(fā)育和性別分化的分子調控機制等科學問題還知之甚少，甚至連不同性別的文昌魚在基因表達上有哪些差異也不清楚。為此, 作者對雌雄文昌魚進行了轉錄組測序，鑒定雌雄文昌魚差異表達基因，為進一步研究文昌魚的性別分化和性腺發(fā)育的分子機制及其進化奠定基礎。

通過分析轉錄組測序數(shù)據(jù)，作者獲知不同性別的文昌魚至少有5 957個顯著差異表達的基因。通過對幾個在其它物種中已有報道的基因進行查驗，驗證了轉錄組測序結果的正確性。比如，促性腺激素釋放激素基因(Gnrh)可刺激促黃體生成素的產生，進而促進排卵和精子的釋放[31]，其在雌性文昌魚中要比在雄性文昌魚中的表達高，這與斑馬魚中Gnrh3的表達模式相一致[32]。再如，鋅指蛋白Glp-1(GATA-like protein 1)是卵子發(fā)育命運的重要細胞決定因子，其在雌性小鼠中的表達顯著高于在雄性中的表達[33]。本研究的轉錄組數(shù)據(jù)也顯示該基因在雌性文昌魚中的表達顯著高于其在雄性文昌魚中的表達。

本研究利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫分別對成熟期雌雄文昌魚的差異表達基因進行聚類后分析發(fā)現(xiàn)，這些在文昌魚不同性別中差異表達的基因，還與魚的生長發(fā)育、免疫應答和新陳代謝等生命活動密切相關。排卵和釋精前，雌雄文昌魚的差異表達基因主要聚類在細胞和代謝過程，其中神經活性配體-受體相互作用富集的差異基因數(shù)最多，細胞粘附分子、細胞外基質相互作用、PI3K-Akt信號通路富集的差異基因數(shù)較多；而排卵和釋精后，雌雄文昌魚的差異表達基因主要集中在代謝和組織系統(tǒng)過程，包括白細胞遷移、軸突導向、吞噬體、神經活性配體-受體相互作用、細胞粘附分子等通路上，其中神經活性配體-受體相互作用和細胞粘附分子富集的差異基因數(shù)最多。

KEGG通路分析顯示，無論排卵和釋精前還是排卵和釋精后，雌雄文昌魚的差異表達基因極富集的共同信號途徑是神經活性配體-受體相互作用和細胞粘附分子信號通路。在魚類、小鼠等脊椎動物中，有一類性分化關鍵基因AMH等屬于TGF-β細胞因子超家族，其也是通過配體-受體相互作用發(fā)揮作用的，說明性別分化的分子機制在進化上存在保守性[34-35]。再如，在斑馬魚中，Gnrh3可通過MAPK途徑調控PGCs(原始生殖細胞)的增殖，在早期性別分化中承擔重要功能[36]，這整個過程離不開一系列配體-受體的相互作用。另一在雌性中高表達的絨毛膜促性腺激素受體(LHCGR)基因的純合子錯義突變會導致空卵泡綜合征和XY性發(fā)育障礙。研究表明，LHCGR啟動子區(qū)域的去甲基化是調節(jié)卵泡發(fā)育過程中細胞類型特異性分化的關鍵機制[37-38]。

對文昌魚雌雄差異表達的相關基因進一步分析發(fā)現(xiàn)，與血管內皮生成相關的基因如F11R、JAM2、CDH5等，無論排卵和釋精前還是排卵和釋精后，雌性都比雄性文昌魚呈顯著的高表達(見圖 5a)；而與白細胞免疫相關的基因如ITGB1、SELP、SELE等，以及與神經系統(tǒng)的神經突觸相關的基因如CDH2、NCAM、L1CAM、PTPRF、SDC1等，排卵和釋精前，其在雌性要比雄性文昌魚中表達高，而排卵和釋精后，其在雌性要比雄性文昌魚中表達低(見圖 5b)。其中，F(xiàn)11R、CDH2等基因主要參與細胞粘附過程，并未見它們在性別分化過程中發(fā)揮作用的報道，而本研究結果暗示其在文昌魚性別分化及決定過程中可能有一定的作用。

(①免疫系統(tǒng)；②抗原遞呈細胞(直流巨噬細胞)；③T細胞；④肽；⑤T細胞受體信號通路；⑥毒性T細胞；⑦靶細胞；⑧輔助T細胞；⑨B細胞；⑩上皮細胞；緊密連接；白細胞跨內皮遷移；白血球；血小板；補體系統(tǒng)；神經系統(tǒng)；神經元(突觸前)；神經元(突觸后)；神經元(生長錐)；神經元(軸突)；施萬細胞；節(jié)點；副節(jié)點；近節(jié)點；施萬細胞(髓磷脂)；周期線；少突細胞(髓磷脂)；其它系統(tǒng)；黏附連接；精細胞；足細胞；纖毛體；色素上皮；無色素上皮；成肌細胞；凱尼海撒實驗室；細胞粘附分子。a: F1與M1組間差異表達基因富集到的通路圖注釋示例。b : F2與M2組間差異表達基因富集到的通路圖注釋示例。紅色表示注釋到該KO的基因為上調基因，綠色表示注釋到該KO的基因為下調基因。a :Examples of annotated pathway diagrams in which differentially expressed genes between F1 and M1 groups are enriched. b : Examples of annotated pathway diagrams in which differentially expressed genes between F2 and M2 groups are enriched. The red indicates that the gene annotated to the KO is up-regulated, and the green indicates that the gene annotated to the KO is down-regulated.)

本研究通過轉錄組分析獲得的雌雄文昌魚差異表達的基因，為從基因水平上研究文昌魚雌雄性別的差異乃至性別分化的分子機制提供了基礎信息。