李詠梅， 李騰飛， 田相利,2??， 羅 凱， 王龍斌， 張盛坤， 魏 聰， 劉 楊

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))， 山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266237)

益生菌是指在一定濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)宿主健康的活體微生物制劑[4]，作為抗生素的替代品，近幾年，益生菌被廣泛用于促進(jìn)水生動(dòng)物的生產(chǎn)性能及預(yù)防和治療疾病，已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的研究和應(yīng)用焦點(diǎn)[5]。研究表明，益生菌不僅可以通過(guò)與致病菌競(jìng)爭(zhēng)生存環(huán)境等來(lái)抑制致病菌的生長(zhǎng)，從而提高水產(chǎn)動(dòng)物的存活率[6]，還能夠調(diào)控水質(zhì)，降低水體中的氨氮等有害物質(zhì)的濃度[7]。其中，芽孢桿菌經(jīng)常被用作水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的有益微生物。例如，Zhou等[8]發(fā)現(xiàn)水體潑灑凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)SC8168，在一定濃度下能顯著提高凡納濱對(duì)蝦幼蝦的存活率和消化酶活性。此外，當(dāng)用于水體潑灑時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌B16也有效促進(jìn)了羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)的生長(zhǎng)[9]?，F(xiàn)有研究表明，芽孢桿菌作為益生菌，單獨(dú)或與其他益生菌聯(lián)合使用可有效提高魚(yú)類生長(zhǎng)速度和飼料利用率。Gobi等[10]和Aly等[11]報(bào)道了地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)Dahb1和短小雙歧桿菌(B.pumilus)顯著促進(jìn)了低眼巨鯰(Pangasiushypophthalmus)和羅非魚(yú)(O.niloticus)的生長(zhǎng)。Zokaeifar等[12]則發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)L10和G1可以通過(guò)增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦的免疫反應(yīng)來(lái)提高其生長(zhǎng)性能和抗病性。

研究表明，養(yǎng)殖水體添加適量的碳源，會(huì)提高水體中的碳氮比，促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)繁殖，并可通過(guò)異養(yǎng)菌的同化作用去除水中氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮[13]。聚羥基丁酸戊酸酯(Poly hydroxybutyrate-co-valerate，PHBV)是微生物在非平衡狀態(tài)下(如缺乏氮、磷)在細(xì)胞內(nèi)合成的一種熱塑性聚酯，具有生物可降解性、生物相容性、壓電性、光學(xué)活性等許多優(yōu)良特性[14]。因其具有較好的生物降解性，同時(shí)能夠以固體材料形式存在，使其在異養(yǎng)反硝化中的應(yīng)用成為可能[15]。PHBV作為碳源在污水處理系統(tǒng)中的固相反硝化過(guò)程的應(yīng)用已經(jīng)取得了較好的效果[16]。同時(shí)，PHBV具有緩釋碳的特點(diǎn)，放入水體后，可以持續(xù)提供碳源且易于控制。不過(guò)，迄今為止，盡管PHBV等固體碳源在工業(yè)污水處理應(yīng)用廣泛，但作為碳源在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用還少見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所用凡納濱對(duì)蝦幼蝦購(gòu)自青島正大農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。實(shí)驗(yàn)之前，使對(duì)蝦在實(shí)驗(yàn)條件下適應(yīng)和馴化2周。馴化過(guò)程中，水溫控制在(25±0.5) ℃，鹽度控制在29.0±1.0，日換水1次，每次換水量為10%，連續(xù)充氣。每天定時(shí)投喂凡納濱對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料3次(7：00、12：00和18：00)。馴化結(jié)束后，挑選質(zhì)量、大小相似的健康凡納濱對(duì)蝦用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)所用菌株均來(lái)自中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保種中心，為3株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株，包括枯草芽孢桿菌H1及其與短小芽孢桿菌BP-171和鹽單胞菌DN3[25-27]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各處理組均使用鮮活菌液，活菌量為1×109cfu·mL-1。PHBV材料形狀為圓柱形，高為4 mm，內(nèi)徑為1 mm，白色，購(gòu)自豪圣工程有限公司。由于PHBV 材料只能在微生物膜的作用下分解并釋放DOC[14-15,28]，所以在使用前，PHBV材料在海水中活化10 d，使其能夠自然掛膜，活化過(guò)程中進(jìn)行充分曝氣。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在18個(gè)容積為500 L白色聚乙烯養(yǎng)殖水槽中進(jìn)行。設(shè)置了6個(gè)不同處理組，其中，D1處理組僅添加PHBV，D2處理組僅添加枯草芽孢桿菌H1，而D3、D4和D5則在添加PHBV的基礎(chǔ)上，分別添加枯草芽孢桿菌H1(D3)、枯草芽孢桿菌H1+鹽單胞菌DN3組合(1∶1，D4)以及枯草芽孢桿菌H1+鹽單胞菌DN3+短小芽孢桿菌BP-171組合(1∶1∶1，D5)。同時(shí)，以不添加PHBV和益生菌處理組作為對(duì)照(DZ)。每個(gè)處理組分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)放養(yǎng)120尾規(guī)格相似的對(duì)蝦，對(duì)蝦平均體質(zhì)量為(2.26±0.02) g。

PHBV材料置于內(nèi)徑為10 cm，高35 cm的PVC塑料管中，PVC管內(nèi)設(shè)置氣石進(jìn)行充氣，不僅可通過(guò)充氣充分?jǐn)噭?dòng)顆粒，還可通過(guò)充氣產(chǎn)生的水流將緩釋的碳源持續(xù)釋放到水體中。PHBV材料裝填完成后，用合適的紗網(wǎng)將塑料管兩端覆蓋，防止材料露出，并將整個(gè)裝置置于相應(yīng)的處理組養(yǎng)殖設(shè)施內(nèi)。

整個(gè)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司16號(hào)車(chē)間進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為9周。

1.3 日常管理

1.3.1 活菌的培養(yǎng) 將保藏的菌種接種于2216E液體培養(yǎng)基，在160 r/min、(28.0±1.0) ℃的條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期待用。經(jīng)檢測(cè)，此期每毫升菌液中含活菌1×109cfu。

1.3.2 養(yǎng)殖管理 實(shí)驗(yàn)期間，每日按照對(duì)蝦總質(zhì)量的5%投喂凡納濱對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料3次(7：00、12：00和18：00)，并根據(jù)剩余餌料狀況、對(duì)蝦的體長(zhǎng)和天氣變化等情況，適度調(diào)整投餌量。每隔7 d向不同處理組均勻潑灑培養(yǎng)至適量濃度的菌液(活菌濃度約為1×109cfu·mL-1)。菌液由實(shí)驗(yàn)室自行制備，潑灑后使各處理組水體中的益生菌濃度約達(dá)到1×104cfu·mL-1。

圖1 固體碳源PHBV緩釋裝置示意圖Fig. 1 Diagram of PHBV slow release device for solid carbon source

1.4 樣品采集及測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 分別在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)對(duì)各個(gè)處理組對(duì)蝦進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重，并計(jì)算凡納濱對(duì)蝦特定成活率、飼料效率和特定生長(zhǎng)率。各類生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算公式如下：

成活率(Survival rate，SR)=Nt/N0×100% ；

飼料效率(Feed conversion ratio，F(xiàn)ER)=

(Wt-W0)/Wf×100%；

特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate，SGR)=

(lnWt- lnW0)/t×100%。

式中：Nt為終末尾數(shù)；N0為初始尾數(shù)；Wf為每個(gè)網(wǎng)箱所投飼料總質(zhì)量(g)；Wt和W0分別為對(duì)蝦的初體質(zhì)量和末體質(zhì)量(g)，均為濕質(zhì)量；t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d)。

1.4.2 非特異性免疫酶活性的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)養(yǎng)殖桶中隨機(jī)抽取15尾對(duì)蝦進(jìn)行血清采集。用1 mL無(wú)菌注射器從凡納濱對(duì)蝦腹部血竇中緩慢抽取血淋巴置于1.5 mL無(wú)菌離心管中。經(jīng)4 ℃靜置過(guò)夜，5 000 r/min-1離心15 min取上清液，于-80 ℃冰箱中保存。

對(duì)蝦血清中超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、總一氧化氮合酶(TNOS)和過(guò)氧化物酶(POD)活性，以南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相關(guān)試劑盒進(jìn)行具體測(cè)定，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.3 水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定 每周采集500 mL水樣，當(dāng)天送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定。使用全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀(Clever Chem 380G，德國(guó)DeChem-Tech. GmbH公司)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定氨氮、硝酸氮、亞硝酸氮、總氮、可溶性活性磷酸鹽和總磷的數(shù)據(jù)。同時(shí)，取1 mL水樣用無(wú)菌生理鹽水以10的倍數(shù)進(jìn)行逐級(jí)稀釋，最終取稀釋倍數(shù)為105～109水樣在2216E培養(yǎng)基上均勻涂布，28.0 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，確定水體中總菌數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)的方式表示，數(shù)據(jù)使用SPSS 24.0分析軟件中的單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05則表示為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 添加益生菌和PHBV對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水質(zhì)的影響

2.1.1 實(shí)驗(yàn)期間水質(zhì)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)期間，水溫在24和26 ℃之間波動(dòng)，水中溶解氧一直高于7 mg·L-1。各處理組溶氧及pH與對(duì)照相比未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)期間各水質(zhì)參數(shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差Table 1 Each water quality parameter during the experiment(Mean±SD)

2.1.3 活性磷酸鹽和總磷的變化 DZ組和D2組活性磷酸鹽(SRP)濃度顯著高于其他處理組(P<0.05)，各處理組的活性磷酸鹽濃度在0～42 d均呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，42～56 d時(shí)期上升速率提高，在56 d之后可溶性活性磷酸鹽均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始28 d后，對(duì)照組的活性磷酸鹽濃度基本高于其他處理組。

各處理組中總磷(TP)的濃度變化趨勢(shì)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，均在42～56 d之間達(dá)到峰值，然后開(kāi)始下降，與活性磷酸鹽變化趨勢(shì)基本一致，但實(shí)驗(yàn)前期(0～21 d)對(duì)照組的總磷濃度顯著高于其他處理組(P<0.05)，中后期與其他處理組差別不大。實(shí)驗(yàn)期間，各處理組與對(duì)照相比，總磷平均濃度未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)。

圖3 活性磷酸鹽(A)和總磷(B)在不同處理組中的濃度變化Fig. 3 Fluctuations of active phosphorus SPR(A) and TP(B)

2.2 添加益生菌和PHBV對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響

不同處理對(duì)蝦生長(zhǎng)情況如表2所示。可以看出，添加益生菌和PHBV可不同程度提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)速度。其中，各處理組對(duì)蝦末體質(zhì)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，各處理組對(duì)蝦的總質(zhì)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而D3、D4和D5組對(duì)蝦總質(zhì)量則顯著高于對(duì)照組和D1(P<0.05)。除D1組外，其他處理組的對(duì)蝦成活率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各處理組對(duì)蝦特定生長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但對(duì)蝦飼料效率未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)。

表2 凡納濱對(duì)蝦的總質(zhì)量、成活率、特定生長(zhǎng)率和飼料效率Table 2 Gross weight, survival rate, specific growth rate, feed efficiency ratio of L. vannamei

2.3 添加益生菌和PHBV對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫的影響

圖4所示分別為不同處理組和對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦血清中超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、總一氧化氮合酶(TNOS)和過(guò)氧化物酶(POD)等非特異性免疫酶活性。由圖4可知，在養(yǎng)殖過(guò)程中各處理組對(duì)蝦血清ACP和LZM活性顯著高于對(duì)照組(見(jiàn)圖4A，圖4C，P<0.05)。其中，以D5組的ACP活性最高，D2、D3和D5組LZM活性顯著高于D1和DZ組(P<0.05)。D1組AKP活性與對(duì)照組相比差異不顯著，其他處理組均顯著高于對(duì)照組(見(jiàn)圖4B，P<0.05)，其中D4組的AKP活性最高。D1和D5組超氧化物歧化酶(SOD)活性與對(duì)照差異不顯著，其他處理組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(見(jiàn)圖4D)。各處理組TNOS酶活性與對(duì)照組相比未見(jiàn)顯著差異(見(jiàn)圖4E，P>0.05)，除D4組外，各處理組過(guò)氧化物酶(POD)活性均顯著高于對(duì)照組(見(jiàn)圖4F，P<0.05)。

(圖中不同字母的表示相互之間差異顯著(P<0.05)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n=3。 The data with different letters mean significant differences between groups(P < 0.05). The data were expressed as mean ± SE, n=3.)

3 討論

3.1 添加益生菌和PHBV對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中氮和磷的影響

集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的主要水質(zhì)問(wèn)題之一是由殘餌和糞便導(dǎo)致的水體中氮的大量積累問(wèn)題，而部分氮的形態(tài)如氨氮及亞硝酸氮等，則直接對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物具有直接的毒性作用[29]。研究表明，適宜的益生菌可以有效降低水體中氨氮等有害物質(zhì)的濃度，從而改善水產(chǎn)動(dòng)物的生存環(huán)境[30]。近年來(lái)，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化生物脫氮技術(shù)已成為研究熱點(diǎn)，但相關(guān)應(yīng)用方面的研究主要集中在實(shí)驗(yàn)室小試階段，中試以上規(guī)模的報(bào)道較少，且多以生物強(qiáng)化的手段為主，即將好氧反硝化菌(群)以菌劑的形式外源投加于生物反應(yīng)器中，以期提高反應(yīng)器的脫氮效能[31]。本研究所使用的菌株枯草芽孢桿菌H1、短小芽孢桿菌BP-171和鹽單胞菌DN3均分離自水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境，在實(shí)驗(yàn)室研究中表現(xiàn)出了優(yōu)異的脫氮性能[25-27]。在本研究中，添加枯草芽孢桿菌H1或同時(shí)添加PHBV和益生菌的各處理水體總氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮和總氮的平均濃度均顯著低于對(duì)照組。在研究期間，各處理組水體不同形態(tài)氮濃度動(dòng)態(tài)變化有所差異?？傮w上看，各處理組氮濃度與對(duì)照相比，主要差異體現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)的中、后期。添加益生菌和碳源各處理組的總氨氮和硝酸氮濃度均顯著降低。其中，以單獨(dú)加枯草芽孢桿菌H1的處理組(D2)效果最佳；而同時(shí)添加碳源和3種益生菌處理組(D5)水體中亞硝酸氮濃度最低?？梢钥闯觯M管在養(yǎng)殖期間各處理組的降氮效果有所差異，但除了單獨(dú)添加PHBV對(duì)亞硝酸氮去除作用不明顯外，添加益生菌和碳源及其不同組合均可以有效地降低對(duì)蝦養(yǎng)殖水體不同形態(tài)的氮濃度。但與單獨(dú)添加枯草芽孢桿菌H1相比，3株菌等比例組合處理僅在亞硝酸氮處理能力上表現(xiàn)出了一定優(yōu)勢(shì)，如何進(jìn)一步優(yōu)化3株菌組合比例需要進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。目前，關(guān)于異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體應(yīng)用的報(bào)道還很少見(jiàn)。從本研究看，盡管3株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌體現(xiàn)出了較好的降氮效果，但在實(shí)際養(yǎng)殖條件下的降氮效果與實(shí)驗(yàn)室研究[25-27]相比還存在一定的差異，這可能與實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境條件的復(fù)雜性有關(guān)。因此，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌在對(duì)蝦養(yǎng)殖中的實(shí)際應(yīng)用技術(shù)值得進(jìn)一步深入研究。

一般來(lái)講，異養(yǎng)菌的菌體成分需要必需氨基酸、糖類等有機(jī)物才能夠合成，因此其生長(zhǎng)需要在適宜的C/N中完成[32]。因此，理論上添加碳源可以促進(jìn)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中異養(yǎng)菌的生長(zhǎng)，通過(guò)異養(yǎng)菌的同化作用，將水體中的無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為自身的生物量[33]。因此，在本研究中，添加PHBV處理組可能主要是通過(guò)異養(yǎng)菌同化作用降低水體氮濃度。而異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌與PHBV的組合，則通過(guò)細(xì)菌的同化作用、硝化作用與反硝化作用共同加強(qiáng)了水體中氮的轉(zhuǎn)化過(guò)程，降低了水體氮濃度。

在養(yǎng)殖系統(tǒng)中，磷的輸入主要來(lái)自飼料和肥料，為沉積性循環(huán)元素，其利用率有待提高[34]。本研究中磷的主要輸入為投餌，主要的利用途徑為細(xì)菌和藻類，當(dāng)然，部分磷也可以通過(guò)食物鏈被對(duì)蝦利用?？傮w上看，添加益生菌和PHBV對(duì)各處理水體總磷濃度影響不大，但同時(shí)添加益生菌和PHBV可有效降低水體活性磷濃度，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

3.2 不同益生菌組合和PHBV對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響

研究表明，補(bǔ)充投喂益生菌可以通過(guò)補(bǔ)充消化酶、提高飼料效率、預(yù)防腸道菌群紊亂[35]，進(jìn)而促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)速度。例如，Rahiman 等[36]將NL110 桿菌和NE17 弧菌用于羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)，對(duì)蝦生長(zhǎng)率、存活率及免疫水平均得到顯著提高。劉翠玲等[37]將枯草芽孢桿菌添加至鯉(Cyprinuscarpio)飼料中進(jìn)行投喂，發(fā)現(xiàn)可提高鯉的特定生長(zhǎng)率。本研究中，通過(guò)水體添加方式，將益生菌和碳源應(yīng)用到對(duì)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)，各處理凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)和產(chǎn)量均顯著提高，但對(duì)飼料效率影響不大。這一作用可能與益生菌和碳源對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)的改善直接相關(guān)。通過(guò)添加碳源提高養(yǎng)殖水體C/N，可促進(jìn)與優(yōu)化異養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)，也可起到改善水質(zhì)的作用[38]。例如，添加PHBV材料使養(yǎng)殖水體中更易形成生物絮團(tuán)，降低養(yǎng)殖水體中氮的濃度，從而提高凡納濱對(duì)蝦的成活率和產(chǎn)量[38]。Li等[39]也發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖水體中添加PHBV和PBS作為碳源，可以顯著促進(jìn)羅非魚(yú)生長(zhǎng)。Ray等[40]的研究則表明，生物絮團(tuán)系統(tǒng)通過(guò)降低養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮和氨氮的濃度，可提高凡納濱對(duì)蝦的成活率。

3.3 添加益生菌和PHBV對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫指標(biāo)的影響

與脊椎動(dòng)物不同，無(wú)脊椎動(dòng)物高度依賴非特異性免疫，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈Λ@得性免疫系統(tǒng)[41]。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(POD)是甲殼動(dòng)物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠有效清除自由基、活性氧，防止生物分子方面的損傷，起到免疫抗病作用[42]。水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物易受到所生活環(huán)境菌群的影響，進(jìn)而對(duì)機(jī)體免疫等生理過(guò)程產(chǎn)生影響。本研究中，添加益生菌處理組對(duì)蝦血清SOD和POD總體顯著高于對(duì)照組，這與Liu等[43]和李軍亮等[44]的結(jié)果相似。溶菌酶屬于對(duì)蝦體內(nèi)的第一道防線，主要作用是溶解革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[45]。本研究中添加益生菌處理對(duì)蝦血清溶菌酶活性均顯著高于對(duì)照組，這與Kewcharoen等[46]的結(jié)果相似。酸性磷酸酶和堿性磷酸酶，與生物體內(nèi)物質(zhì)攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)直接相關(guān)，也是機(jī)體免疫抗病不可缺少的重要免疫酶[47]。本研究中，添加益生菌和PHBV均可顯著提高對(duì)蝦血清中酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性，且提高幅度隨添加益生菌種類增多而增加，這表明復(fù)合益生菌的效果可能比單一益生菌更顯著。這一結(jié)果與胡毅等[48]在凡納濱對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)復(fù)合芽孢桿菌比單一芽孢桿菌有更好的添加效果相似。推測(cè)這可能是由于不同細(xì)菌在腸道微生物區(qū)系中占有不同的生態(tài)位，因而添加復(fù)合益生菌組比添加單一益生菌有更好的免疫及生長(zhǎng)效果[49]。總一氧化氮合酶在機(jī)體免疫物質(zhì)誘導(dǎo)下會(huì)釋放出大量的NO，這些被釋放的NO可參與到后續(xù)免疫反應(yīng)中，從而對(duì)病原生物產(chǎn)生殺滅作用[50]。本研究中添加益生菌和PHBV對(duì)蝦血清總一氧化氮合酶與對(duì)照組未見(jiàn)顯著差異，這與常杰等[51]的結(jié)果有所不同，這可能由于對(duì)蝦未受到弧菌等病原菌的感染，所以體內(nèi)沒(méi)有誘導(dǎo)出總一氧化氮合酶表達(dá)的免疫物質(zhì)，使得總一氧化氮合酶的活性未出現(xiàn)差異。另外，碳源的添加可提高水體中的碳氮比，利用水體中的糞便、殘餌形成生物絮團(tuán)，這種生物絮團(tuán)也可以被凡納濱對(duì)蝦攝食[52]，生物絮團(tuán)中富含維生素和多糖類等多種有益物質(zhì)[53]，這些物質(zhì)被凡納濱對(duì)蝦攝取之后，也有助于對(duì)蝦免疫力的提高。例如，Mansour等[54]發(fā)現(xiàn)生物絮團(tuán)增加了羅非魚(yú)(O.niloticus)SOD和POD活性，與本研究結(jié)果相似。

4 結(jié)語(yǔ)

水體中添加PHBV和異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株枯草芽孢桿菌H1、短小芽孢桿菌BP-171以及鹽單胞菌DN3的不同組合均可有效改善水質(zhì)，提高了對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，并在一定程度上增強(qiáng)了對(duì)蝦非特異免疫能力?？傮w比較而言，添加益生菌各處理優(yōu)于僅添加PHBV處理，同時(shí)添加益生菌與PHBV對(duì)水體氮去除能力與僅添加枯草芽孢桿菌H1差異不大，但益生菌與PHBV的組合有助于提高對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能。