王欣桐， 王宣剛， 孫敏敏， 孔祥福， 劉金相，2， 王志剛， 于海洋??

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003)(2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266237)

牙鲆是一種廣泛分布于亞洲沿海地區(qū)的海水增養(yǎng)殖魚類，近年來(lái)牙鲆高密度集約化的養(yǎng)殖方式加速了細(xì)菌、病毒等病原體的傳播速度，限制了牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。遲緩愛德華氏菌是一種革蘭氏陰性腸道致病菌，能侵染人和包括牙鲆在內(nèi)的多種硬骨魚，被侵染的牙鲆常表現(xiàn)出腹腔積水、內(nèi)臟充血和體表出血等癥狀，對(duì)牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴(yán)重的威脅[1]。牙鲆作為低等脊椎動(dòng)物，其免疫機(jī)制以先天性免疫為主，因此在基因?qū)用鎸?duì)牙鲆的免疫系統(tǒng)及免疫反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行細(xì)致深入的研究，可以針對(duì)不同病原體研制出有效的對(duì)策，避免因使用抗生素等藥物引起生物耐藥性及藥物殘留等問(wèn)題，可對(duì)細(xì)菌侵染造成的牙鲆疾病進(jìn)行防控、減少養(yǎng)殖中經(jīng)濟(jì)的損失。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族是一類脂質(zhì)激酶，也是一種具有脂質(zhì)底物特異性的新型細(xì)胞內(nèi)傳感器，能在正常和病理?xiàng)l件下協(xié)調(diào)和介導(dǎo)多種細(xì)胞行為，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、存活和骨架重排等基本細(xì)胞功能中具有關(guān)鍵作用[2-4]，并在抗凋亡中扮演重要角色[5]。此外PI3K還在抵抗外界病原體入侵[6]、維持免疫細(xì)胞正常功能中發(fā)揮作用[7-8]，通過(guò)多種方式參與生物體的先天性和適應(yīng)性免疫[9]，當(dāng)PI3K通路受損時(shí)會(huì)導(dǎo)致免疫缺陷[10-11]。

根據(jù)結(jié)構(gòu)特征、體外脂質(zhì)底物特異性、激活機(jī)制和功能，可將PI3K家族各成員分為I～I(xiàn)II三種類別，其中I類PI3K是由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)催化亞基組成的異二聚體，此類P13K可進(jìn)一步分為IA類和IB類，IA類由受體酪氨酸激酶所激活，包括p110α(PIK3CA)、p110β(PIK3CB)和p110δ(PIK3CD)；IB類則由G蛋白偶聯(lián)受體激活，包括p85α(PIK3R1)、p85β(PIK3R2)和p55γ(PIK3R3)[12-16]。研究表明，PIK3R3可以通過(guò)iSH2結(jié)構(gòu)域與p110催化亞基結(jié)合，在調(diào)控細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用；在多種腫瘤細(xì)胞中PIK3R3的表達(dá)量顯著上調(diào)，提示該基因與腫瘤相關(guān)過(guò)程有密切聯(lián)系；體外敲除PIK3R3后誘導(dǎo)了人類卵巢細(xì)胞的凋亡，表明其具有一定的抗凋亡作用；使用無(wú)乳鏈球菌刺激尼羅羅非魚后其多個(gè)組織中PIK3R3b的表達(dá)量顯著上調(diào)，暗示該基因在尼羅羅非魚抵抗外界病原體入侵中可能發(fā)揮一定作用[2, 17-19]。使用遲緩愛德華氏菌侵染后，RNA-Seq與qRT-PCR均表明在牙鲆的鰓、腎臟和血液中，PI3K家族多個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，其中腎臟中PIK3R3-like在遲緩愛德華氏菌刺激后的8和48 h時(shí)的表達(dá)量與0 h相比均有顯著上調(diào)，提示PIK3R3-like在牙鲆抵抗遲緩愛德華氏菌侵染中可能發(fā)揮作用[20-22]。本研究中的克隆鑒定了牙鲆的PIK3R3-like基因，發(fā)現(xiàn)該基因存在一長(zhǎng)一短兩個(gè)可變剪接，分別命名為PoPIK3R3-like-Ⅰ和PoPIK3R3-like-Ⅱ，并對(duì)PoPIK3R3-like的結(jié)構(gòu)域、同源性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了PoPIK3R3-like其在牙鲆各組織的分布情況，以及遲緩愛德華氏菌侵染后牙鲆細(xì)胞中其表達(dá)量變化。最后利用原核表達(dá)的方法得到了牙鲆PoPIK3R3-like-Ⅰ的重組蛋白，并進(jìn)行了純化，所得純化蛋白可用于后續(xù)基因功能的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 牙鲆 本實(shí)驗(yàn)中所用的一齡牙鲆(體重550～1 100 g)購(gòu)買自青島南山市場(chǎng)，購(gòu)回后所有牙鲆均養(yǎng)殖于溫度控制在18～20 ℃的海水中，每天飼喂商業(yè)飼料直至實(shí)驗(yàn)前取用。

1.1.2 遲緩愛德華氏菌 遲緩愛德華氏菌由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所贈(zèng)予，28 ℃下培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中。

1.1.3 牙鲆鰓細(xì)胞系(FG9307) 牙鲆鰓細(xì)胞系由中國(guó)海洋大學(xué)細(xì)胞工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予，使用含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基在24 ℃環(huán)境下培養(yǎng)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 TRIzol、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4連接酶體系、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，膠回收試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，RNA純化試劑盒購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司，PCR試劑、p-EASY連接體系、DH5α及BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，SYBR qPCR SuperMix定量試劑購(gòu)自Novoprotein公司，魚類單核細(xì)胞分離試劑盒購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。

1.2 PoPIK3R3-like基因序列分析

本研究通過(guò)對(duì)多物種PIK3R3及PIK3R3-like基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，比較了牙鲆PIK3R3和PIK3R3-like的關(guān)系。通過(guò)比對(duì)將PoPIK3R3-like-Ⅰ、PoPIK3R3-like-Ⅱ的核酸序列與對(duì)應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行序列分析，并對(duì)不同硬骨魚中PIK3R3-like基因編碼的氨基酸序列及多物種中該基因的系統(tǒng)進(jìn)化對(duì)進(jìn)行了分析。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得其它魚類PIK3R3-like的氨基酸序列，使用DNAMAN軟件對(duì)核酸與對(duì)應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)牙鲆及其它魚類PIK3R3-like的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，分析不同魚類中該基因序列的一致性(見表1)。將PoPIK3R3-like-Ⅰ與各物種PIK3R3-like基因的氨基酸序列通過(guò)Clustal W方法進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA 7.0工具中的NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap值為1 000(見表2)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用PIK3R3-like蛋白登錄號(hào)

表2 實(shí)驗(yàn)所用PIK3R3蛋白登錄號(hào)

1.3 牙鲆各組織及細(xì)胞RNA的提取及cDNA的合成

實(shí)驗(yàn)前用麻醉劑將牙鲆麻醉以減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的痛苦。待牙鲆麻醉后將其轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用酒精擦拭魚身進(jìn)行消毒，隨后用滅菌的眼科剪從牙鲆的泄殖孔將其腹腔剪開，小心地取出心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、鰓、肌肉、腸，共取3條雌魚3條雄魚，取出的組織用滅菌的去離子水清洗后切成小塊，迅速投入液氮中速凍，隨后保存在-80 ℃超低溫冰箱中直至取用。

組織RNA的提取采用TRIzol法，將組織從-80 ℃超低溫冰箱中取出后投入含有TRIzol的離心管中，用手持電動(dòng)勻漿器將組織磨碎，后續(xù)按照說(shuō)明書上的步驟對(duì)RNA進(jìn)行提取。使用RNA純化試劑盒去除RNA中殘留的DNA和蛋白質(zhì)。使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒將純化后的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并保存在-20 ℃條件下。

使用TRIzol對(duì)處理后的牙鲆鰓細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行消化后，按照說(shuō)明書的步驟對(duì)細(xì)胞中的RNA進(jìn)行提取，使用gDNA Eraser試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及cDNA的合成。

1.4 牙鲆PIK3R3-like基因核心片段的獲取

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的牙鲆全基因組進(jìn)行本地blast得到牙鲆PIK3R3-like基因序列，使用IDT網(wǎng)站(https://sg.idtdna.com/pages)在線設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：Fw: 5’- CAAAGACAACAGCAGCAGCC -3’，Rv: 5’- CAGTCGTTCTCGCAGGATACAG -3’。以牙鲆各組織混合cDNA為模板，使用北京全式金生物公司生產(chǎn)的TransStart?FastPfu DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為5×TransStart?FastPfu buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L) 2 μL，模板1 μL，正、反向引物各0.5 μL，TransStart?FastPfu DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 15.5 μL，共計(jì)25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，切膠回收后與pEASY?-Blunt Simple載體連接，連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)，選取陽(yáng)性克隆菌株送往華大基因測(cè)序。通過(guò)BLAST比對(duì)確定擴(kuò)增得到的是牙鲆PIK3R3-like基因。

1.5 PoPIK3R3-like基因的表達(dá)分析

由于PIK3R3-like的兩種剪接型僅在結(jié)構(gòu)域位置有少許區(qū)別，3’ UTR及5’ UTR區(qū)域無(wú)差異，難以設(shè)計(jì)引物將二者區(qū)分開，因此作者設(shè)計(jì)引物檢測(cè)了二者表達(dá)量之和。使用IDT網(wǎng)站(https://sg.idtdna.com/pages)在線設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)PoPIK3R3-like的 qRT-PCR 引物，序列為PoPIK3R3-like-Fw1: 5’-CTGCACCTTTGTTTGACTTC-3’；PoPIK3R3-like-Rv1: 5’-GTTCACATCACCGTCTACTC-3’。以牙鲆各組織或細(xì)胞的cDNA為模板，以牙鲆β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)PoPIK3R3-like的表達(dá)模式。

Real-time PCR反應(yīng)程序設(shè)定為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)以增加實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度。待反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCt法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的Ct值計(jì)算目的基因的表達(dá)量，最終結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SE)表示。使用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析以判斷顯著性差異，p< 0.05為差異顯著(*標(biāo)示)，p< 0.01為差異極顯著(**標(biāo)示)。

1.6 遲緩愛德華氏菌刺激牙鲆鰓細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的牙鲆鰓細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞覆蓋度達(dá)到80%左右時(shí)棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞兩遍后加入不含青-鏈霉素的培養(yǎng)基，以免對(duì)后續(xù)加入的細(xì)菌造成影響，隨后加入感染復(fù)數(shù)(MOI)為10，即細(xì)胞數(shù)量10倍的遲緩愛德華氏菌對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，在刺激后的0、4、8、12和24 h時(shí)收集細(xì)胞，保存在TRIzol中用于RNA的提取。需要注意的是在刺激4 h后需棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞洗去未侵入到細(xì)胞中的細(xì)菌，再加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以免細(xì)菌在培養(yǎng)基中過(guò)度繁殖對(duì)細(xì)胞造成不利影響。

牙鲆單核-巨噬細(xì)胞利用魚類單核細(xì)胞分離試劑盒(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)按照說(shuō)明書中的步驟從牙鲆的頭腎中分離得到，同樣使用感染復(fù)數(shù)為10的遲緩愛德華氏菌對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，在刺激后的0和2 h收集細(xì)胞，保存在TRIzol中用于RNA的提取。

1.7 牙鲆PIK3R3-like基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

在PoPIK3R3-like-Ⅰ的ORF兩端設(shè)計(jì)分別帶有帶有EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)的引物，引物序列為PoPIK3R3-like-Fw2: 5’-CCGGAATTCATGGTTTATCCTCCCGAAG-3’；PoPIK3R3-like-Rv2: 5’-CCGCTCGAGTTACATTTCTGGAGCTGCAG-3’，下劃線所示為酶切位點(diǎn)位置。將PCR產(chǎn)物連接到pET-32a(+)質(zhì)粒中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽(yáng)性菌株進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序正確的菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取，用于下一步蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.8 重組PoPIK3R3-like-Ⅰ蛋白的表達(dá)、純化和復(fù)性

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達(dá)菌株中，從陽(yáng)性菌株中挑取單菌落，37 ℃ 180 r/min條件下使用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD值達(dá)到0.6左右時(shí)向菌液中加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，用于誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，隨后在37 ℃ 180 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)8 h。分別取1 mL未誘導(dǎo)及誘導(dǎo)后的菌液，離心后棄去培養(yǎng)基，用去離子水將菌體重懸，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液后99 ℃加熱10 min使蛋白變性，隨后通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)結(jié)果。

對(duì)菌體進(jìn)行超聲破碎后檢測(cè)得知蛋白表達(dá)在包涵體中，對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌、溶解后，使用鎳柱對(duì)包涵體進(jìn)行純化，隨后用不同濃度的咪唑?qū)⒔Y(jié)合在鎳柱上的蛋白洗脫下來(lái)，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)各濃度咪唑洗脫下來(lái)的蛋白單一性，選擇純度較高的一組進(jìn)行下一步蛋白的復(fù)性。

按照說(shuō)明書中的要求剪下合適長(zhǎng)度的透析袋并進(jìn)行預(yù)處理，將需復(fù)性的蛋白裝入透析袋中，兩端密封后在4 ℃條件下分別在透析液Ⅰ～Ⅶ(成分參照周納宇等的實(shí)驗(yàn)步驟[23])中透析12 h。透析結(jié)束后取出透析袋，在其表面均勻撒上PEG20000對(duì)蛋白進(jìn)行濃縮，隨后離心收集上清，樣品保存在-80 ℃超低溫冰箱中。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒按照說(shuō)明書中的步驟對(duì)濃縮后的蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 PoPIK3R3-like基因的序列分析

通過(guò)查找本研究實(shí)驗(yàn)室牙鲆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析，作者得到一段牙鲆PIK3R3基因的亞型——PIK3R3-like的基因序列(見圖1)，序列比對(duì)顯示牙鲆中存在兩種剪接型，將可變剪接長(zhǎng)鏈和短鏈分別命名為PoPIK3R3-like-Ⅰ和PoPIK3R3-like-Ⅱ，通過(guò)BLASTP比對(duì)發(fā)現(xiàn)PoPIK3R3-like基因的兩種剪接型序列與多種硬骨魚的PIK3R3-like基因均具有較高同源性，其中與黃尾鰤的相似度最高，達(dá)到94.3%(見圖2)，同時(shí)PoPIK3R3-like-Ⅰ比其它PoPIK3R3-like基因均多出一個(gè)21nt的插入，編碼7個(gè)氨基酸。

(使用MEGA 7.0軟件中的NJ法對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行構(gòu)建，采用Clustal W的方法進(jìn)行多序列比對(duì)，節(jié)點(diǎn)處的數(shù)值表示經(jīng)過(guò)1 000次重復(fù)檢驗(yàn)后的Bootstrap支持率(%)。The phylogenetic tree was drawn by MEGA 7.0 neighbor-joining method based on multiple sequence alignment by Clustal W. The reliability of each node was estimated by bootstrapping with 1 000 replications. The numbers shown at each node indicate the bootstrap values (%).)

(Paralichthys olivaceus Ⅰ:牙鲆 Ⅰ(PoPIK3R3-like-Ⅰ); Paralichthys olivaceus Ⅱ:牙鲆 Ⅱ(PoPIK3R3-like-Ⅱ); Cynoglossus semilaevis:半滑舌鰨; Lates calcarifer: 尖吻鱸; Amphiprion ocellaris: 眼斑雙鋸魚; Nothobranchius furzeri: 非洲齒鯉。不同的顏色表示不同序列中該位置處氨基酸的保守程度。Different colors indicate the degree of conservation of amino acids at this position.)

利用Editseq分析得到PoPIK3R3-like-Ⅰ的最長(zhǎng)開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)1 425 bp，編碼474個(gè)氨基酸(見圖3)。SignalP v4.0在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其蛋白不存在信號(hào)肽。通過(guò)SMART預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PIK3R3-like-Ⅰ蛋白含有3個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域，包括1個(gè)nSH2結(jié)構(gòu)域，由第47～130位氨基酸構(gòu)成；1個(gè)iSH2結(jié)構(gòu)域，由第146～320位氨基酸構(gòu)成；1個(gè)cSH2結(jié)構(gòu)域，由第344～426位氨基酸構(gòu)成(見圖4)。

(陰影部分表示三個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域，其中陰影區(qū)域1(47～130位氨基酸)對(duì)應(yīng)nSH2結(jié)構(gòu)域，陰影區(qū)域2(146～130位氨基酸)對(duì)應(yīng)iSH2結(jié)構(gòu)域，陰影區(qū)域區(qū)域3(344～426位氨基酸)對(duì)應(yīng)cSH2結(jié)構(gòu)域。Shadow part represents three SH2 domains，in which shadow part 1 (47～130 amino acids) corresponds to nSH2 domain, shadow part 2 (146～130 amino acids) corresponds to iSH2 domain, and shadow part 3 (344～426 amino acids) corresponds to cSH2 domain.)

圖4 PoPIK3R3-like-Ⅰ的結(jié)構(gòu)域

2.2 PoPIK3R3-like基因的組織表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)牙鲆各組織中PoPIK3R3-like的分布情況。如圖5，PoPIK3R3-like在牙鲆的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、鰓、肌肉和腸中均有表達(dá)，但具有一定的分布特異性，其中在腦和鰓中表達(dá)量最高。

2.3 遲緩愛德華氏菌刺激牙鲆鰓細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞后PIK3R3-like的表達(dá)量變化

本研究使用遲緩愛德華氏菌刺激牙鲆的鰓細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞后，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了處理后細(xì)胞中PoPIK3R3-like基因的表達(dá)量變化。如圖6，使用遲緩愛德華氏菌刺激牙鲆鰓細(xì)胞后，PoPIK3R3-like的表達(dá)量首先上調(diào)，在8 h時(shí)達(dá)到最大值，與0 h時(shí)具有顯著差異，隨后逐漸下降，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。如圖7，使用遲緩愛德華氏菌刺激牙鲆單核-巨噬細(xì)胞2 h后PoPIK3R3-like的表達(dá)量上調(diào)，并且與對(duì)照組相比具有顯著差異。

(圖中*代表差異顯著(*p<0.05, **p<0.01)。*is represented the significant difference (*p<0.05, **p<0.01) in this picture.)

(圖中*代表差異顯著(*p<0.05, **p<0.01)。 * is represented the significant difference (*p<0.05, **p<0.01) in this picture.)

2.4 PoPIK3R3-like的誘導(dǎo)表達(dá)

作者通過(guò)原核表達(dá)的方式得到了PoPIK3R3-like-Ⅰ的重組蛋白，并進(jìn)行了純化和復(fù)性，SDS-PAGE檢測(cè)顯示誘導(dǎo)組與對(duì)照組相對(duì)有一條明顯增粗的條帶，分子量大小與預(yù)測(cè)(72 kDa)一致，表明誘導(dǎo)出了相應(yīng)蛋白。超聲破碎后對(duì)上清和包涵體進(jìn)行檢測(cè)顯示重組蛋白表達(dá)在包涵體中。對(duì)包涵體進(jìn)行純化后蛋白條帶比較單一且主帶清晰(見圖8)。

(泳道M：Marker；泳道1：誘導(dǎo)前表達(dá)菌株的蛋白；泳道2：誘導(dǎo)后表達(dá)菌株的蛋白；泳道3：誘導(dǎo)后表達(dá)菌株上清中的蛋白；泳道4：誘導(dǎo)后表達(dá)菌株包涵體中的蛋白；泳道5：純化后的重組蛋白。Lane M: Marker; Lane 1: Extracts from expressing strains before IPTG induction; Lane 2: Extracts from IPTG induced expressing strains; Lane 3: Eupernate of the extracts from expressing strains before IPTG induction; Lane 4: Inclusion bodies of the extracts from expressing strains before IPTG induction; Lane 5: purified rPoPIK3R3-like-Ⅰ.)

2.5 PoPIK3R3-like重組蛋白的濃度測(cè)定

利用每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及其對(duì)應(yīng)的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖9)，將PoPIK3R3-like-Ⅰ重組蛋白測(cè)得的吸光值2.278 5帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，經(jīng)計(jì)算知蛋白濃度為4.033 5 μg/μL。

圖9 BCA法蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

PI3K家族被公認(rèn)在細(xì)胞凋亡、腫瘤遷移等一系列過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，此外有研究表明PI3K家族參與先天性免疫和適應(yīng)性免疫[9]，在抵抗病原體入侵[6]、維持免疫細(xì)胞的功能[8]中具有重要意義，其部分成員在白細(xì)胞中高度表達(dá)，對(duì)于活化免疫細(xì)胞并將其招募到炎癥部位、殺傷病原體和呈遞抗原發(fā)揮不可替代的作用[24]。PI3K家族也參與了一些免疫相關(guān)的信號(hào)通路，已有研究證明，PI3K家族是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，它們充當(dāng)中間信號(hào)分子，在PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用[25-26]，PI3K通過(guò)產(chǎn)生第二信使將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而激活多種效應(yīng)激酶途徑，包括BTK，AKT，PKC，NF-κB，JNK/SAPK途徑，最終導(dǎo)致正常細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)[27-28]。另外，阻斷PI3K家族中的PIK3R3可以通過(guò)NF-kB途徑調(diào)節(jié)緊密連接蛋白以減輕炎癥的嚴(yán)重程度[29]，PIK3R3還可通過(guò)p53/p21信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制細(xì)胞衰老[30]。有研究表明，牙鲆作為低等脊椎動(dòng)物，先天性免疫在其抵抗病原體入侵中扮演重要角色，已有研究者證明牙鲆注射遲緩愛德華氏菌后牙鲆多個(gè)器官中PI3K家族成員表達(dá)量發(fā)生顯著變化，提示PI3K家族在牙鲆抵抗遲緩愛德華氏菌入侵過(guò)程中可能發(fā)揮一定作用[20-22]。本研究得到了牙鲆PI3K家族的成員之一——PIK3R3-like的ORF序列，通過(guò)對(duì)牙鲆與其它物種的PIK3R3及PIK3R3-like進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)物種的PIK3R3-like與PIK3R3分別聚為一支，同時(shí)兩基因間同源性較高，提示PIK3R3-like可能是PIK3R3的一個(gè)亞型，可能由硬骨魚類的全基因組復(fù)制出現(xiàn)。根據(jù)Li等[20,22]和Liu[21]等對(duì)于牙鲆注射遲緩愛德華氏菌后牙鲆多個(gè)器官中PI3K家族成員轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的研究，作者發(fā)現(xiàn)在牙鲆中PIK3R3-like在遲緩愛德華氏菌感染后表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上升，而PIK3R3表達(dá)量變化不明顯，提示在牙鲆中PIK3R3-like可能在免疫反應(yīng)方面其重要性強(qiáng)于PIK3R3，當(dāng)然作者尚需要兩個(gè)基因進(jìn)一步的比較免疫學(xué)研究。

序列分析同時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因不含信號(hào)肽，推測(cè)其可能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用；對(duì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其共含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是nSH2結(jié)構(gòu)域、iSH2結(jié)構(gòu)域和cSH2結(jié)構(gòu)域，與其它硬骨魚進(jìn)行多序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)PoPIK3R3-like的這三個(gè)結(jié)構(gòu)域與其它硬骨魚相比比較保守，但PoPIK3R3-like在擴(kuò)增中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可變剪接區(qū)域，其編碼了一個(gè)在iSH2結(jié)構(gòu)域比其它硬骨魚多出了7個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)錄本以及一個(gè)氨基酸數(shù)量相同的轉(zhuǎn)錄本，提示在牙鲆中該可變剪接可能對(duì)PoPIK3R3-like基因的功能有影響，并與其它硬骨魚類可能有所差異；系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示PoPIK3R3-like-Ⅰ與其它硬骨魚類的PIK3R3-like聚為一支，與兩棲類、鳥類及哺乳類進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，符合常見PI3K家族基因普遍的進(jìn)化關(guān)系。

熒光定量PCR結(jié)果顯示PoPIK3R3-like-Ⅰ基因在牙鲆的各組織中均有表達(dá)，但具有一定的分布特異性，在腦和鰓中表達(dá)量較高，在其它組織中表達(dá)量相對(duì)較低。對(duì)呼吸機(jī)相關(guān)肺炎(VAP)患者的研究發(fā)現(xiàn)其外周血中PIK3R3基因的表達(dá)量與健康人相比發(fā)生顯著性上調(diào)[31]；使用鰻弧菌侵染尼羅羅非魚后其多個(gè)免疫器官中PIK3R3b基因的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，表明PIK3R3基因可能在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[19]。類似的，作者使用牙鲆重要的病原菌——遲緩愛德華氏菌在體外對(duì)牙鲆的鰓細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞進(jìn)行感染，qRT-PCR結(jié)果顯示在鰓細(xì)胞中PoPIK3R3-like的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且表達(dá)量與對(duì)照組具有顯著差異；遲緩愛德華氏菌刺激單核-巨噬細(xì)胞2 h后細(xì)胞中PoPIK3R3-like表達(dá)量明顯上升且同樣與對(duì)照組具有顯著差異。眾所周知，鰓是硬骨魚類重要的免疫器官，含有多種免疫因子和免疫組織，其在牙鲆的先天性免疫中扮演重要角色，單核-巨噬細(xì)胞可以通過(guò)補(bǔ)體、免疫球蛋白、膜受體等多種機(jī)制識(shí)別并殺死入侵病原體，控制機(jī)體的免疫應(yīng)答，是牙鲆抵抗外界病原體的關(guān)鍵組分，該結(jié)果表明PoPIK3R3-like在牙鲆抵抗遲緩愛德華氏菌感染中可能發(fā)揮重要作用，其抗感染的分子機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

作者通過(guò)原核表達(dá)的方式在大腸桿菌中得到了PoPIK3R3-like-Ⅰ的重組蛋白，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的條件有很多，37 ℃誘導(dǎo)的優(yōu)點(diǎn)是蛋白合成速度較快，獲得的蛋白量較大，缺點(diǎn)是過(guò)快的合成速度易使蛋白形成包涵體，失去其天然活性，需后期復(fù)性；另一種常見的誘導(dǎo)條件是在較低的溫度下誘導(dǎo)，如16或20 ℃，低溫誘導(dǎo)的優(yōu)點(diǎn)是蛋白易以可溶的形式表達(dá)在上清中，形成的蛋白是有活性的，無(wú)需復(fù)性，缺點(diǎn)是蛋白合成速度較慢，獲得的蛋白量較小，需延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間。不同蛋白適宜的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度有所差異，經(jīng)過(guò)摸索作者確定了rPoPIK3R3-like-Ⅰ的誘導(dǎo)條件，使用0.5 mmol/L濃度的IPTG在37 ℃下誘導(dǎo)6 h。SDS-PAGE檢測(cè)顯示誘導(dǎo)得到的蛋白表達(dá)在包涵體中，考慮是由于原核表達(dá)系統(tǒng)中缺乏幫助蛋白折疊的分子伴侶等物質(zhì)，使來(lái)源于真核生物的外源蛋白難以正確折疊，因此不具有天然活性，需進(jìn)行復(fù)性。但包涵體復(fù)性往往對(duì)于蛋白的生物學(xué)活性具有一定影響，可能影響對(duì)于蛋白功能的檢測(cè)，后期可通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度、更換表達(dá)載體和表達(dá)菌株以期其在上清中表達(dá)，并可檢測(cè)蛋白的完整生物學(xué)活性，探究其在牙鲆細(xì)菌感染中的具體生物學(xué)功能。

綜上所述，作者通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)生信分析得到了牙鲆PIK3R3-like基因的編碼區(qū)序列，獲得了具有七個(gè)氨基酸差異的一對(duì)可變剪接轉(zhuǎn)錄本，并對(duì)其可變剪切長(zhǎng)鏈的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)域及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析，體外免疫刺激表明該基因在牙鲆抵抗外界病原體入侵中發(fā)揮一定作用，最后通過(guò)原核表達(dá)得到了rPoPIK3R3-like-Ⅰ蛋白，為下一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。