徐海琪，黃心悅，張麗君

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，沈陽 110001）

含有E3泛素蛋白連接酶2的WW結構域（recombinant WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2，WWP2）是編碼Nedd4家族成員中一種重要的E3連接酶［1-3］。WWP2參與包括膜蛋白轉運、蛋白質(zhì)降解、信號轉導以及轉錄凋亡等多種細胞過程，并與腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關［4］。急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是血液系統(tǒng)的一種異質(zhì)性惡性腫瘤，預后較差，其病因和發(fā)病機制目前尚不明確。本研究擬觀察WWP2對ALL細胞系生物學行為的可能的影響，旨在探討該基因對ALL發(fā)生發(fā)展的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

ALL細胞系Jurkat來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液研究室。RPMI-1640及PBS購自美國Gibco公司；polybrene、兩性霉素B及嘌呤霉素購自日本Sigma公司；Higene購自中國普利萊公司；質(zhì)粒購自中國吉凱公司；多柔比星（doxorubicin，dox）購自美國輝瑞制藥有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學公司；細胞凋亡試劑盒及組織活性氧購自中國碧云天生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃孵箱中培養(yǎng)Jurkat細胞。細胞傳代3次后行臺盼藍染色，應用細胞計數(shù)儀計數(shù)細胞，存活率≥97%即可進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞轉染：用PBS清洗細胞，接種至6孔板中（密度60%～70%），更換含polybrene（6 μg/mL）的培養(yǎng)基。分別加入60 μL含WWP2shRNA及空載的病毒液孵育，48 h后再滴加60 μL，48 h后更換培養(yǎng)瓶，補5～10 mL培養(yǎng)液，觀察細胞生長情況。轉染結束后，向培養(yǎng)基中加入10 μg/mL嘌呤霉素進行陽性篩選。將1 mL 0.9% NaCl、24 μL轉染試劑、HA質(zhì)粒15 μL、WWP2質(zhì)粒20 μL混勻后，室溫靜置20 min，加入細胞培養(yǎng)基中，36～48 h后觀察細胞形態(tài)，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 CCK-8實驗：將轉染后Jurkat細胞（3.0×105/mL）接種于96孔板中，100 μL/孔。設置空白孔，設置不同濃度（0、0.05、0.1、0.2、0.4 μmol/mL）dox藥物處理組，每組4個復孔，孵育6 h，加入CCK-8試劑10 μL/孔，繼續(xù)孵育1 h后，用酶標儀檢測樣品450 nm處OD值。

1.2.4 流式細胞術：將經(jīng)過0.2 μmol/mL dox處理的細胞重懸于500 μL binding buffer中，分別加入細胞3 μL FITC和1 μL PI染料，混勻，同時設置3管FITC-/PI-、FITC+/PI-、FITC-/PI+，避光靜置10～15 min，應用流式細胞儀檢測。

1.2.5 活性氧檢測：用無血清RPMI-1640稀釋（1∶1 000）活性氧熒光探針（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）至終濃度10 μmol/L。收集細胞，與DCFH-DA充分接觸，于37 ℃孵育30 min，每隔3～5 min顛倒混勻1次，用RPMI-1640洗滌細胞3次，充分去除未進入細胞的DCFH-DA。利用甩片機將細胞甩至載玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0和Graphpad prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。采用秩和檢驗的非參數(shù)檢驗方式分析，兩變量相關程度采用雙變量相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 WWP2表達水平與細胞增殖活性

分別用0、0.05、0.1、0.2、0.4 μmol/mL的dox刺激細胞48 h，通過CCK-8實驗探討WWP2對Jurkat細胞增殖活性的影響。結果表明，與未敲減的對照組相比，敲減WWP2后，細胞增殖活性明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而過表達WWP2后，細胞增殖活性則明顯升高（P＜0.01），見圖1。當dox濃度為0.2 μmol/mL時，細胞增殖活性約為50%，因此選擇該藥物濃度進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度dox刺激下各組細胞增殖能力的比較Fig.1 Comparison of cells proliferation under different concentrations of dox between different groups

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

流式細胞術結果顯示，加入dox后，敲減WWP2組細胞凋亡率較對照組明顯增高（P＜0.01），而過表達WWP2基因組細胞凋亡率較對照組明顯降低（P＜0.01），見圖2。提示W(wǎng)WP2基因可能作為癌基因抑制Jurkat細胞的凋亡。未經(jīng)dox處理的各組細胞凋亡率無顯著差異，WWP2低表達的細胞對dox更敏感，而WWP2表達水平較高的細胞對dox不敏感，因此，推測dox對細胞的損傷作用可能部分受WWP2基因調(diào)控。

圖2 流式細胞技術檢測各組Jurkat細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis analysis of Jurkat cells by flow cytometry

2.3 細胞中活性氧檢測結果

熒光顯微鏡下可見，與對照組相比，加入0.2 μmol/mL dox后，敲減WWP2組細胞更亮，細胞數(shù)相對更少（圖3A），而過表達WWP2組細胞更暗，細胞數(shù)相對更多（圖3B）。間接證明，敲減WWP2的Jurkat細胞產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)增多，而過表達WWP2的Jurkat細胞產(chǎn)生活性氧物質(zhì)減少；dox對敲減WWP2的Jurkat細胞抑制作用明顯增強，對過表達WWP2的細胞抑制作用則減弱。

3 討論

WWP2基因位于染色體16q21.1，可在人類心臟、腦、肝臟、胰腺、肺及腎臟等器官表達。WWP2參與多種細胞過程，并與腫瘤相關底物結合，與腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關［4］。FUKUMOTO等［5］發(fā)現(xiàn)，在人口腔鱗狀細胞癌細胞系中WWP2mRNA表達上調(diào)，蛋白表達顯著增加；敲除WWP2基因可抑制細胞增殖能力，但對遷移能力則無顯著影響。研究［6-10］表明，WWP2在多種實體腫瘤中表達水平上調(diào)，發(fā)揮癌基因的作用。有學者研究了WWP2與淋巴瘤的關系，發(fā)現(xiàn)該基因可作為生物標志物鑒別反應性濾泡增生和濾泡性淋巴瘤。文獻［11-12］報道，日本蟾蜍毒治療對多發(fā)性骨髓瘤誘導的骨溶解具有抑制作用。

ALL是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以未成熟的淋巴樣細胞分化和增殖受損為主，發(fā)生于骨髓、外周血或某些髓外組織中［13］。ALL多發(fā)病于2～5歲或50歲后［14］。近年來，兒童ALL治愈率明顯提高，而成人ALL預后遠不如小兒［15］，長期無病生存率僅為35%～45%［16-17］。ALL預后較差，治愈率僅為20%～40%［18］。WWP2在多種實體腫瘤中均發(fā)揮癌基因的作用［7-10］，而它在血液系統(tǒng)，尤其是ALL中的作用機制尚未明確。本研究首次探討了WWP2在ALL中的作用，通過細胞增殖實驗、流式細胞術以及活性氧染色等方法觀察了WWP2基因對ALL細胞系Jurkat的生物學行為的影響。結果顯示，敲減WWP2基因使Jurkat細胞增殖活性降低，細胞凋亡增多，產(chǎn)生活性氧減少，而過表達WWP2產(chǎn)生的作用則相反。本研究還發(fā)現(xiàn)，WWP2基因敲減的細胞對dox更加敏感，而WWP2過表達的細胞對dox的敏感性則明顯降低。這意味著對WWP2低表達的患者應用dox藥物治療可能產(chǎn)生良好的效果，但WWP2高表達的患者則應考慮選擇其他合適的藥物進行治療。因此，臨床上可以對所有ALL初治患者進行WWP2表達水平檢測，其結果將會為ALL疾病的治療及預后提供依據(jù)。另外，WWP2也許可作為指導ALL患者的治療及預后的靶基因，為相關靶向藥物研究及復發(fā)難治患者的治療提供新的思路。

綜上所述，本研究首次證明了WWP2基因可能是ALL新的潛在癌基因，有望為疾病診斷、治療和預測預后提供新的靶點。此外，對WWP2低表達的患者，dox是一種很有效的藥物，而對WWP2高表達的患者應慎重選擇其他合適的化療藥物。