聶涵，周曉煦，趙越，田文

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，沈陽(yáng) 110001；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122）

血管鈣化指鈣鹽病理性地沉積在血管組織中，其普遍存在于衰老、糖尿病和慢性腎病的病理過(guò)程。血管鈣化被認(rèn)為是一個(gè)復(fù)雜并受高度調(diào)控的主動(dòng)過(guò)程［1］，血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，即從收縮表型轉(zhuǎn)分化為類成骨細(xì)胞表型，收縮表型特異性基因下調(diào)（例如平滑肌α-肌動(dòng)蛋白），同時(shí)骨形成標(biāo)志物上調(diào)，包括Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（runt-related transcription factor 2，Runx2）和堿性磷酸酶［2］。絕經(jīng)前女性血管鈣化發(fā)病率極低，絕經(jīng)后雌激素替代治療能顯著減少血管鈣化的發(fā)生［3］。雌激素通過(guò)雌激素受體（estrogen receptor，ER）依賴的方式抑制人血管平滑肌細(xì)胞中的骨形成信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而減輕血管鈣化［4］。

泛素特異性蛋白酶22（ubiquitin specific peptidase 22，USP22）可使組蛋白去泛素化，從而增強(qiáng)其穩(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄增加。前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，USP22是核受體轉(zhuǎn)錄激活的重要輔調(diào)節(jié)因子。提示USP22可能作為ER的輔調(diào)節(jié)因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并參與血管鈣化的相關(guān)過(guò)程。本研究將人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（human aortic smooth muscle cells，HASMCs）鈣化模型作為載體，證實(shí)USP22與ERα之間的相互作用，并探討其對(duì)血管鈣化進(jìn)程的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HASMCs購(gòu)自湖南湘雅細(xì)胞庫(kù)。高糖DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培養(yǎng)基粉末（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（德國(guó)SeraPro公司）；β-磷酸甘油粉末、茜素紅染液；雌二醇（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；LipofectamineTM3000 Transfection reagent、jetPRIME transfection reagent（美國(guó)Polyplus公司）；質(zhì)粒提取及純化試劑盒（美國(guó)OMEGA bio-tek公司）；雙熒光素酶基因檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司，Dual-Luciferase Reporter Assay System，E1960）；蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司）；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（中國(guó)凱基生物）。抗體：Runx2（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），USP22（美國(guó)Proteintech公司），β-actin、抗鼠二抗、抗兔二抗（美國(guó)Santa Cruz公司），ERα（美國(guó)Abclone公司）。

1.2 方法

1.2.1 鈣含量比色試驗(yàn)：將HASMCs接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，24 h后更換誘導(dǎo)鈣化DMEM培養(yǎng)基（含5 nmol磷酸甘油），分別培養(yǎng)0、3、5和7 d，每隔2 d更換1次培養(yǎng)基。加入0.6 mol/L鹽酸2 mL，于37 ℃孵育24 h。吸取上清，并用鈣含量比色檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鈣離子濃度。脫鈣后的細(xì)胞用2 mL PBS沖洗3次，加入1 mL 0.1 mol/L NaOH，1 g/L SDS裂解細(xì)胞30 min，提取上清液，12 000 r/min離心30 min，再提取上清液，并用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白含量。鈣離子濃度/蛋白含量即標(biāo)準(zhǔn)化后的細(xì)胞鈣含量，以此表示細(xì)胞鈣化程度。

1.2.2 茜素紅染色：將HASMCs接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，24 h后更換誘導(dǎo)鈣化DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)0、3、5和7 d，每隔2 d更換1次培養(yǎng)基。4% 多聚甲醛固定15 min，PBS清洗細(xì)胞1～2次。2% 茜素紅染料染色5 min，PBS洗掉多余的染料。

1.2.3 Western blotting：樣品蛋白濃度用BCA法測(cè)定，之后加入6×loading buffer 混勻，100 ℃煮沸5 min。以20 μg樣品蛋白/孔上樣，進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，之后用 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，參照抗體說(shuō)明書(shū)要求配置一抗并孵育。TBST洗滌3次，10 min，二抗稀釋比例為1 ∶5 000，室溫孵育2 h，TBST 洗滌 3×10 min。滴加ECL工作液，曝光及掃描。以β-actin 為內(nèi)參，Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.2.4 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）：從蛋白上清液中取40 μL作為input組，余下蛋白上清進(jìn)行co-IP（IP組）。將適量的protein A/G agarose beads（瓊脂糖珠）加至上清液中，進(jìn)行preclear，10 r/min，4 ℃，離心1.5 h，棄去beads，將上清轉(zhuǎn)移至新 EP 管中。IP組：IgG組加入0.1 μL IgG，正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組加入適量的IP抗體（與IgG是相同種屬），10 r/min，4 ℃，離心12～16 h。IP組加入適量新Protein A/G agarose beads，10 r/min，4 ℃，離心4 h，使beads與抗體、抗原形成復(fù)合物，棄去上清，每管加入1 mL TNE 溶液，10 r/min，4 ℃，離心15 min，接著1 500 r/min，4 ℃，離心 3 min，棄掉上清，重復(fù)上述步驟3次，最后一次離心完將上清棄凈，留取沉淀，即beads-抗原-抗體復(fù)合物。將input組和IP組配成樣品，并進(jìn)行Western blotting。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)：將HASMCs接種于24孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至密度80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用jetPRIME transfection reagent（Polyplus），每孔加入質(zhì)粒（ERα 0.05 μg，ERE-luci 0.25 μg，PRL 5 ng，PC/USP22 0.25 μg），4 h后更換為DMEM培養(yǎng)基，并加入雌激素，終濃度為10-7。24 h后再次加入雌激素，2 h后棄去培養(yǎng)基，并用PBS清洗2次，之后每孔加入80 μL lysis buffer（5× lysis buffer用PBS稀釋為1×），水平搖床20 min。每孔吸取30 μL 蛋白裂解液，先后加入15 μL luci buffer，15 μL stop buffer，并用雙報(bào)告檢測(cè)儀測(cè)量熒光度值，記錄數(shù)據(jù)。每個(gè)分組均設(shè)置3個(gè)副孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示。多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。所有的P值均為雙側(cè)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HASMCs鈣化模型建立及檢測(cè)

將HASMCs接種24 h之后，更換誘導(dǎo)鈣化的DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)0、3、5和7 d，每隔2 d換1次培養(yǎng)基。隨著鈣化培養(yǎng)基處理時(shí)間的延長(zhǎng)，茜素紅染色逐漸加深（圖1A），HASMCs鈣化程度加重；鈣含量比色試驗(yàn)結(jié)果顯示鈣離子含量也逐漸增多，培養(yǎng)0、3、5和7 d的HASMCs鈣離子濃度/蛋白含量分別為0.01±0.001、0.03±0.003、0.06±0.001和0.13±0.020。（P＜0.05，圖1B），在Western blotting中，鈣化的標(biāo)志蛋白R(shí)unx2的表達(dá)量上升，同時(shí)USP22的蛋白表達(dá)量也逐漸增加（圖1C）。上述結(jié)果表明高磷條件成功誘導(dǎo)HASMCs鈣化，并且在鈣化過(guò)程中，USP22的表達(dá)量有所增加。

圖1 高磷誘導(dǎo)HASMCs鈣化的檢測(cè)Fig.1 Determination of calcification induced by high P in HASMCs

2.2 USP22對(duì)ERα的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及相互作用

co-IP試驗(yàn)證實(shí)USP22確實(shí)在蛋白水平與ERα之間存在相互作用（圖2）。由雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果可知，無(wú)論雌激素是否存在，USP22均可以抑制ERα的轉(zhuǎn)錄活性，對(duì)照組、雌激素處理組、USP22過(guò)表達(dá)組及USP22過(guò)表達(dá)+雌激素刺激組的HASMCs的熒光素酶相對(duì)活性分別為0.26±0.02、0.50±0.02、0.12±0.01和0.24±0.01（圖3）。結(jié)果顯示，USP22可以通過(guò)與ERα結(jié)合的方式進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

圖2 co-IP技術(shù)檢測(cè)USP22與ERα之間的相互作用Fig.2 co-immunoprecipitation was used to detect the interaction between USP22 and ERα

圖3 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測(cè)USP22對(duì)于ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響Fig.3 Effect of USP22 on the transcriptional activity of ERα was determined by dual-luciferase assay

2.3 USP22對(duì)人動(dòng)脈平滑肌血管鈣化的影響

應(yīng)用flag標(biāo)簽質(zhì)粒與siRNA分別過(guò)表達(dá)/沉默USP22，并用Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率和。當(dāng)USP22過(guò)表達(dá)時(shí)，HASMCs鈣離子含量增多，對(duì)照組、雌激素刺激組、USP22過(guò)表達(dá)組及USP22過(guò)表達(dá)+雌激素刺激組的HASMCs的鈣相對(duì)量分別為0.05±0.010、0.03±0.005、0.08±0.006和0.06±0.002；并且Runx2的蛋白表達(dá)量有所增加，對(duì)照組、雌激素刺激組、USP22過(guò)表達(dá)組及USP22過(guò)表達(dá)+雌激素刺激組的HASMCs的Runx2蛋白表達(dá)的相對(duì)量分別為0.18±0.02、0.06±0.01、0.28±0.03和0.15±0.02；當(dāng)USP22沉默時(shí)，鈣離子含量減少，對(duì)照組、雌激素刺激組、USP22沉默組及USP22沉默+雌激素刺激組的HASMCs的鈣相對(duì)量分別為0.08±0.002、0.04±0.001、0.06±0.003和0.02±0.002，并且Runx2的蛋白表達(dá)量也有所降低，對(duì)照組、雌激素刺激組、USP22沉默組及USP22沉默+雌激素刺激組的HASMCs的Runx2蛋白表達(dá)的相對(duì)量分別為0.71±0.02、0.73±0.02、0.51±0.02和0.26±0.03。上述結(jié)果表明，USP22可以促進(jìn)鈣化相關(guān)進(jìn)程。見(jiàn)圖4、5。

圖4 過(guò)表達(dá)USP22對(duì)HASMCs鈣化的影響Fig.4 Effect of USP22 overexpression on calcification of HASMCs

圖5 沉默USP22對(duì)人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣化的影響Fig.5 Effect of knock down of USP22 and E2 treatment on calcification of HASMCs

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)USP22能通過(guò)結(jié)合ERα，抑制ERα的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性并促進(jìn)人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鈣化，為闡明鈣化機(jī)制提供了新的觀點(diǎn)。

絕經(jīng)后心血管疾病發(fā)病率的增加與雌激素水平降低有關(guān)，提示內(nèi)源性雌激素對(duì)血管有益［6］。流行病學(xué)研究［7］發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女主動(dòng)脈鈣化與骨密度降低相關(guān)，提示雌激素和血管鈣化相關(guān)。此外，雌激素能夠抑制血管鈣化，從正常育齡母豬分離出的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞與從切除卵巢的豬分離出的平滑肌細(xì)胞相比更能對(duì)抗鈣化環(huán)境［8］。

研究證明，血清磷酸鹽水平的升高與血管鈣化相關(guān)［9］，并且會(huì)增加心血管事件和死亡的風(fēng)險(xiǎn)［10］。磷酸鹽濃度升高會(huì)通過(guò)一個(gè)復(fù)雜且高度受控的過(guò)程觸發(fā)血管鈣化，該過(guò)程的關(guān)鍵步驟是血管平滑肌細(xì)胞向成骨表型轉(zhuǎn)分化。不同細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的復(fù)雜相互作用精確地控制了磷酸鹽誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞成骨性轉(zhuǎn)分化［11］。本研究選擇用高磷條件刺激平滑肌細(xì)胞來(lái)建立體外鈣化模型，在鈣化的過(guò)程中USP22的蛋白表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，提示USP22可能參與了HASMCs的鈣化過(guò)程。

USP22是去泛素化酶中最大的亞家族，屬于泛素特異性加工蛋白酶。USP22高度保守，在人體組織中廣泛表達(dá)。但關(guān)于USP22在血管鈣化中的作用知之甚少。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)雄激素受體可以作為USP22的非組蛋白底物，本研究探究了USP22與ER之間的關(guān)系。由于平滑肌細(xì)胞中ERα占優(yōu)勢(shì)，因此選擇了ERα來(lái)代表雌激素受體在平滑肌細(xì)胞中的作用。Co-IP試驗(yàn)的結(jié)果顯示，USP22與ERα存在相互作用。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，USP22可以抑制ERα的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性?？紤]到雌激素/ERα對(duì)于血管鈣化的密切關(guān)系，以及USP22對(duì)于ERα的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，本研究試圖觀察USP22表達(dá)量的改變對(duì)血管平滑肌鈣化的影響。通過(guò)轉(zhuǎn)染USP22質(zhì)粒來(lái)過(guò)表達(dá)USP22，或通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA來(lái)沉默USP22，鈣含量比色試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞的鈣化程度相應(yīng)加重（過(guò)表達(dá)USP22）或有所減輕（沉默USP22）。并且，作為鈣化標(biāo)志物的Runx2表達(dá)量在USP22過(guò)表達(dá)時(shí)蛋白含量升高，而當(dāng)USP22被沉默時(shí)，Runx2的蛋白含量減少。均說(shuō)明USP22可以促進(jìn)高磷誘導(dǎo)的人動(dòng)脈平滑肌鈣化過(guò)程。

綜上所述，本研究推測(cè)USP22可能是雌激素/ERα在血管鈣化發(fā)展中的重要調(diào)節(jié)因子，并通過(guò)與ERα結(jié)合的方式抑制其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，進(jìn)而促進(jìn)鈣化相關(guān)進(jìn)程。以往報(bào)道USP22會(huì)導(dǎo)致多種癌癥的不良結(jié)局，USP22靶向抑制劑聯(lián)合雌激素替代治療可能會(huì)減少單獨(dú)使用雌激素替代治療導(dǎo)致腫瘤等不良反應(yīng)。本研究?jī)H為細(xì)胞研究，上述現(xiàn)象及機(jī)制尚需進(jìn)一步在動(dòng)物模型中驗(yàn)證。