秦思文，姜紅

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院兒科，沈陽 110001）

衰老和慢性腎臟疾病都會影響腎臟功能，最終導致腎纖維化。腎纖維化是一種慢性、進行性過程，目前尚無減緩腎纖維化的靶向療法［1］。過氧化物酶2（peroxiredoxin2，Prx2）是哺乳動物細胞中常見的抗氧化酶，主要存在于細胞質(zhì)和細胞膜中，參與凋亡、增殖、分化、炎癥、癌癥和先天免疫缺陷等多種細胞過程［2］。Prx2在肺臟［3］、肝臟［4-5］等實質(zhì)器官纖維化疾病過程中都有特異性表達。然而，腎纖維化組織中Prx2表達情況尚未見報道。本研究擬探討Prx2在腎纖維化大鼠腎組織中的表達情況，旨在為闡明其與腎臟纖維化的關系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

將24只8周齡、體質(zhì)量180～200 g的雄性SD大鼠（購自北京維通利華公司）隨機分為假手術組（n=8）和單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）組（n=16，UUO組）。假手術組大鼠戊巴比妥鈉麻醉后沿腹中線開腹，自中下1/3 交界處至劍突，暴露左側(cè)腎臟及左輸尿管，游離左側(cè)輸尿管而不結扎。UUO組大鼠入路方式同假手術組，暴露左側(cè)腎臟及左輸尿管結扎輸尿管上下兩端，中間剪斷。假手術組術后3 d處死大鼠并獲取腎組織，UUO組分別于術后3、7、14、21 d處死大鼠并獲取腎組織。一部分腎組織4%多聚甲醛固定24 h，制作石蠟切片，另一部分保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2 方法

1.2.1 HE染色：2組術后3 d的石蠟切片（2 μm）染色，按照染色試劑盒（中國索萊寶公司）說明書操作，光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)。

1.2.2 免疫組化染色檢測大鼠腎臟組織中Prx2的表達：2組術后3 d的石蠟切片（4 μm）常規(guī)脫蠟、水化，浸入檸檬酸緩沖液，微波爐加熱，修復抗原冷卻后洗滌，血清封閉；一抗Prx2（英國Abcam公司，1 ∶1 000）4 ℃過夜。二抗37 ℃溫箱30 min，DAB染色后蘇木素輕度復染，常規(guī)脫水、透明、封片、光鏡觀察。陰性對照組用 PBS 代替一抗進行反應。采用Image J軟件對 Prx2結果進行半定量分析，每張切片在光鏡（400 倍）下觀察 20 個不同的腎間質(zhì)區(qū)域，測定光密度并計算平均值。

1.2.3 實時PCR 檢測Prx2、α-SMA和VimentinmRNA的表達：使用Trizol試劑從大鼠腎臟組織中分離提取總RNA。按照試劑盒說明書操作進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，配制20 μL反應體系，取反轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn) 物2 μL，使 用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q3定 量PCR儀，美 國Thermo Fisher 公司）進行PCR反應。引物序列：Prx2，上游引物5’-GACCTACCTGTGGGACGCTCTG-3’，下游引物5’-TCCAGCCAGCAGGACAGACTTC -3’；α-SMA，上游引物5’-AGCCAGTCGCCATCAGGAAC -3’，下游引物5’-CCGGAGCCATTGTCACACAC -3’；Vimentin，上游引物5’-CGTTTCCAAGCCTGACCTCACC-3’，下游引物5’-GCCATCTTTACATTGAGCAGGT-3’；GAPDH，上游引物5’-TGATGCTGGTGCTGAGTAT G-3’，下游引物5’-AGATGATGACCCTTTTGGC-3’。反應條件預變性95 ℃30 s，循環(huán)反應95 ℃10 s，62 ℃30 s；溶解曲線95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，共40次循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計算。

1.2.4 Western blotting檢測Prx2、α-SMA和Vimentin蛋白的表達：提取腎組織蛋白，濃度定量后加入1/4體積上樣緩沖液95 ℃10 min變性，每個上樣孔道20 μL裂解蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）還原分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜浸泡在無蛋白快速封閉液（中國雅酶公司）中，室溫置于搖床15 min，然后4 ℃一抗［Prx2（英國Abcam公司）、α-SMA（美國Affinity公司）、Vimentin（英國Abcam公司）和GAPDH（美國Affinity公司）］孵育過夜。第2天洗膜3次后加入HRP二抗（英國Abcam公司）室溫搖床孵育1 h，去除二抗并洗膜3次后曝光顯影。使用Image J軟件對條帶進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0進行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組大鼠腎組織HE染色結果

結果顯示，假手術組未見腎臟病理改變；UUO組腎間質(zhì)水腫炎性滲出，腎小管擴張，表明大鼠腎纖維化模型構建成功。見圖1。

圖1 2組腎組織HE染色結果 ×400Fig.1 HE staining of the kidney tissue between sham group and UUO group ×400

2.2 2組大鼠免疫組化結果

結果顯示，假手術組（0.31±0.02）腎小管上皮可見Prx2少量表達；而UUO組（0.47±0.01）腎小管上皮Prx2表達明顯升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 2組腎組織Prx2表達的免疫組化學結果 ×400Fig.2 Prx2 expression in renal tissues between sham group and UUO group by immunohistochemical staining ×400

2.3 UUO組大鼠實時PCR檢測結果

結果顯示，UUO組大鼠腎組織Prx2、α-SMA和VimentinmRNA表達水平隨著時間延長明顯增加（F分別為261.412、43.291、1247.781，均P＜0.01）。見表1。

表1 術后3、7、14、21 d大鼠腎組織Prx2、α-SMA和Vimentin mRNA表達比較Tab.1 mRNA expressions of Prx2，α-SMA and Vimentin in renal tissues of UUO rats at the 3rd day，7th day，14th day，and 21st day after surgery

2.4 UUO組大鼠Western blotting檢測結果

結果顯示，UUO組大鼠腎組織Prx2、α-SMA和Vimentin蛋白的表達水平隨著時間延長明顯增加（F分別為538.66、330.167、500.706，均P＜0.01），與實時PCR結果一致。見表2、圖3。

圖3 Western blotting檢測Prx2、α-SMA和Vimentin 蛋白表達Fig.3 Protein expression of Prx2，α-SMA，and Vimentin by Western blotting

表2 UUO組大鼠術后3、7、14、21 d 時Prx2、α-SMA和Vimentin蛋白的表達Tab.2 Protein expression of Prx2，α-SMA and Vimentin in renal tissues of UUO rats at the 3rd day，7th day，14th day，and 21st day after surgery

3 討論

腎纖維化是慢性腎臟疾病的共同特征。腎小球和腎間質(zhì)區(qū)域過多的細胞外基質(zhì)蛋白沉積是腎纖維化的典型標志［6］。氧化應激在腎纖維化的病因?qū)W中起著至關重要的作用。Prx2是抗氧化酶，對氧化反應敏感，可作為氧化應激標志物［7-8］。因此，Prx2對于維持哺乳動物體內(nèi)的氧化還原平衡起重要作用，在氧化應激的發(fā)展過程中，Prx2的表達水平增加［9-10］。另外，過氧化物濃度增加后，過氧化形式Prx2向其寡聚形式（具有分子伴侶活性）轉(zhuǎn)化，發(fā)揮分子伴侶功能，參與調(diào)節(jié)細胞間信號傳導［11-12］；Prx2還與許多轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB、HIF-1α、HIF-2α、STAT3、P53、AP-1、c-MYC等）、血小板衍化生長因子受體和激酶（ASK1、JNK、p38、MAPK等）相互作用，影響細胞的生長、分化和凋亡［13-14］。研究顯示Prx2在多種纖維化疾病（肺纖維化［15］、肝纖維化［16］等）中發(fā)揮作用，因此推測Prx2與腎纖維化的發(fā)生發(fā)展也存在聯(lián)系。

UUO是公認的梗阻性腎病實驗模型，Vimentin和α-SMA是檢測腎纖維化發(fā)生的有效指標。本研究成功建立了UUO大鼠模型，免疫組化結果顯示 Prx2主要表達于腎小管上皮細胞的胞質(zhì)中，間質(zhì)也有少量表達。Western blotting和實時PCR證實了UUO組大鼠腎組織Prx2的表達水平隨著時間延長呈增加趨勢，因此推測Prx2與腎纖維化存在密切聯(lián)系。

綜上所述，Prx2在UUO大鼠腎組織中高表達，并呈現(xiàn)時間依賴性，其表達增高可能與腎纖維化密切相關。Prx2可能參與了腎纖維化發(fā)病機制，今后還需進一步研究論證。