劉哲亮，彭豪，鄔嬌，李旭，吳冠宇，陳躍軍，王林纖，郭慧，李躍進

( 1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院 湖南省腫瘤醫(yī)院胸外科， 湖南長沙 410013；2.湖南大學(xué)數(shù)學(xué)院，湖南長沙 410082； 3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院 湖南省腫瘤醫(yī)院麻醉科， 湖南長沙 410013； 4.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院 湖南省腫瘤醫(yī)院檢驗科，湖南長沙 410013； 5.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院 湖南省腫瘤醫(yī)院病理科，湖南長沙 410013)

肺癌是與癌癥相關(guān)的最常見的致死原因，全世界每年新增確診肺癌人數(shù)約為220萬， 每年新增肺癌死亡人數(shù)約為179萬[1]。 非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)占原發(fā)性肺癌的85%[2]。 盡管化療和分子靶向以及免疫治療的效果已有很大改善，Ⅰ期的NSCLC患者的5年生存率可以達(dá)到80%, 但Ⅱ期和Ⅲ期的NSCLC患者的5年生存率仍為13%～60%[3-5]。因此，當(dāng)務(wù)之急在于揭示NSCLC致癌和進展的分子機制。上調(diào)基因11(up-regulated gene 11, URG11)是一種通過乙型肝炎病毒X蛋白上調(diào)的基因，編碼蛋白質(zhì)分子為70 kDa， 含有5個富含半胱氨酸的條索樣重復(fù)片段和1個C型凝集素結(jié)構(gòu)域[6]。這些結(jié)構(gòu)參與了細(xì)胞粘附、遷移和細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用[7-9]。 以前的研究表明URG11在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。有學(xué)者報道了URG11在胰腺癌標(biāo)本中高表達(dá)，敲除URG11可以減少胰腺癌細(xì)胞侵襲[10]。 另一項研究表明URG11在胃癌中高度表達(dá)，通過小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)敲除URG11可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移潛能[11]。然而，URG11在人NSCLC發(fā)病中的作用尚不清楚。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是癌癥轉(zhuǎn)移的重要事件[12]，它可以增強癌細(xì)胞的侵襲能力[13-15]，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機制。EMT與腫瘤擴散的頻率和肺癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)的高風(fēng)險相關(guān)[16], 其影響了肺癌手術(shù)和藥物治療的效果，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。因此，對EMT分子機制的研究可以為肺癌的治療策略提供參考[17]。然而目前尚未發(fā)現(xiàn)URG11介導(dǎo)NSCLC發(fā)生EMT的相關(guān)報告，也沒有相關(guān)研究涉及URG11在相關(guān)腫瘤中引起EMT的機制。因此，需要進一步研究URG11的靶基因及其誘導(dǎo)NSCLC發(fā)生EMT相關(guān)機制的分子基礎(chǔ)。

筆者等前期研究結(jié)果提示敲除基因URG11能顯著抑制NSCLC的增殖，遷移和侵襲能力[18]?；诠P者等的研究結(jié)果，筆者等推測URG11對NSCLC的促進作用有可能在于其反式激活Wnt信號通路的樞紐蛋白β-Catenin并促使其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致β-Catenin/TCF靶基因表達(dá)上調(diào)，引起上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(即EMT)，最終通過EMT增強癌細(xì)胞侵襲能力。

1 材料和方法

1.1 設(shè)計

體外細(xì)胞學(xué)實驗。

1.2 時間及地點

實驗于2018年10月至2021年4月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 樣品收集

NSCLC組織標(biāo)本和鄰近的非腫瘤標(biāo)本來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院的手術(shù)病例?；颊咝g(shù)前沒有進行局部或全身治療。所有標(biāo)本切除后立即儲存在液氮中備用。所有患者都簽署了參與本研究的知情同意書。該研究由湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3.2 NSCLC細(xì)胞系

人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549購自美國組織培養(yǎng)庫(ATCC，Manassas，VA，USA)。

1.3.3 實驗動物

雌性Balb/C裸鼠(5～6周齡)，體質(zhì)量18～22 g，購自上海新萊克實驗動物有限責(zé)任公司(上海，中國)。飼養(yǎng)在無特定病原體(specefic pathogen free, SPF)級實驗動物房。相關(guān)動物實驗中南大學(xué)經(jīng)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549，用DMEM(Gibco BRL，Life Technologies，Grand Island，NY，USA)培養(yǎng)，其中含有10%胎牛血清(FBS;Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，100 μg/ ml鏈霉素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)和100 IU/ml的青霉素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，培養(yǎng)箱環(huán)境：37℃，5%CO2，95%濕度。

1.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

針對URG11的短發(fā)夾RNA(shRNA)(shURG11：5’ GCACCTACACAGGCAGAATCTCTCGAGAGATTCTGCCTGTGTAGGTGC-3’)由上?；蛩幬锘瘜W(xué)有限公司合成。對A549細(xì)胞通過Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染shURG11，以敲除URG11基因。經(jīng)shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h，敲除URG11后，收集細(xì)胞行后續(xù)實驗。分為實驗組(經(jīng)shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲除URG11)和對照組(未經(jīng)shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲除URG11)。

1.5 主要觀察指標(biāo)

1.5.1 Western blotting測定β-Catenin及其下游基因cyclinD1、c-myc的蛋白表達(dá)

使用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞蛋白質(zhì)[100mM NaCl，50mM Tris-HCl(pH7.5)，1%Triton X-100，1mM EDTA，10mM β-甘油磷酸鹽，2mM鈉釩酸鹽和蛋白酶抑制劑]。具體步驟：收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液，置于4℃，漩渦震蕩器每隔30 min混勻一次，裂解2 h。然后3 000×g，15 min離心，收集上清。繼續(xù)12 000×g，15 min離心收集上清即為全細(xì)胞蛋白裂解液。加入等量2×Sample Buffer，ALB2121加熱器上加熱至100℃4 min, 迅速置于冰中2 min后,離心取上清。BCA法蛋白定量,每孔蛋白總量25μg 上樣至SDS-PAGE 膠,電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。蛋白質(zhì)濃度使用BCA蛋白測定試劑盒(BioTeke，北京，中國)，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF，Millipore，Boston，MA，USA)。在該膜上與一抗抗體孵育URG11，β-catenin，cyclin D1，c-Myc以及GAPDH(1∶2 000;Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)，在4℃下過夜。接下來用過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz, California )按1∶3 000稀釋，并在室溫下孵育1 h。最后，蛋白結(jié)合率采用增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)檢測系統(tǒng)(Amersham，Little Chalfont，UK)測定。

1.5.2 RT-qPCR檢測β-Catenin，cyclinD1和c-myc的mRNA表達(dá)

使用TRIzol試劑(Invitrogen)從細(xì)胞中分離總RNA,紫外分光光度計OD 260 nm定量,采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 (Clontech， Palo Alto， CA， USA) 將3 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用cDNA為模板，加入Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix試劑盒中(Stratagene， Boston, MA, USA)。用ABIPRISM 7500 fast real-time PCR儀反應(yīng)(Applied Biosystems Foster City, CA, USA)。以GAPDH作內(nèi)對照。各引物序列如表1。

在ABI7500循環(huán)儀上進行RT-qPCR，具體方案：在95℃下初始變性30 s， 隨后在95℃下進行35個5 s循環(huán)的變性，在59℃退火30 s，72℃退火30 s。使用GAPDH作為規(guī)范基因表達(dá)的定量和定性控制。熒光定量數(shù)據(jù)分析采用公式：R=2-[△CT sample-△DCT control]。

表1 各引物序列

1.5.3 裸鼠成瘤模型評估URG11基因?qū)SCLC侵襲性生長的影響

裸鼠移植瘤模型的建立方法：取對數(shù)生長期的目標(biāo)細(xì)胞，加適量生理鹽水配制成細(xì)胞懸液，臺酚藍(lán)染色，光鏡下瘤細(xì)胞計數(shù)，活瘤細(xì)胞>90%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107ml，取50μl上述細(xì)胞懸液與50 μL Matrigel膠等體積混合，用75%乙醇消毒實驗Balb/c雄性裸鼠(4～6周齡，身體質(zhì)量16～18 g)共20只，隨機分為兩組。左腋下皮膚消毒，每只小鼠皮下注射0.2 ml上述細(xì)胞混合液(含瘤細(xì)胞1×106)。瘤計算接種后7 d開始用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑(L)和短徑 (W)， 按公式： V=0.52×L×W2計算腫瘤體積。以腫瘤體積為縱坐標(biāo)、測量時間為橫軸標(biāo)繪制腫瘤體積-時間生長曲線。4周后全部處死，取腫瘤組織立即置于冰上，盡快稱重。抑瘤率計算按照公式：抑瘤率=(對照組瘤體稱重-實驗組瘤體稱重)/對照組瘤體稱重×100%，后置于-70℃保存，后續(xù)用常規(guī)免疫組化方法檢測組織/細(xì)胞中β-Catenin的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。兩組間差異通過Student'st檢驗分析。多組間差異通過差異方差分析(ANOVA)。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 敲除URG11顯著抑制Wnt /β-Catenin信號通路在NSCLC細(xì)胞中的激活

筆者等前期研究結(jié)果顯示URG11在NSCLC中異常表達(dá)，敲除URG11能顯著抑制NSCLC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[18]，還有證據(jù)表明Wnt /β-catenin信號通路參與了NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲[19-21]。為了進一步證實抑制NSCLC細(xì)胞生長和遷移的潛在機制，筆者等檢測了URG11對β-Catenin，細(xì)胞周期蛋白D1和c-Myc表達(dá)的影響。 Westernblot和 RT-qPCR結(jié)果顯示，敲除URG11可以顯著下調(diào)β-catenin，c-Myc，和細(xì)胞周期蛋白D1在A549細(xì)胞中的表達(dá)。

2.1.1 Western blot蛋白質(zhì)印跡分析顯示β-Catenin、cyclinD1和c-myc的蛋白水平在敲除URG11的A549細(xì)胞組(實驗組)中的表達(dá)顯著低于未敲除對照組 (DPI值分別為： 0.22±0.06VS 0.77±0.21， 0.61±0.09 VS 1.52±0.23， 0.42±0.07 VS 0.84±0.14，P<0.05)(圖1)。上述各蛋白質(zhì)的光密度值已采用GAPDH作為內(nèi)參。

A.

B.

印跡分析顯示在轉(zhuǎn)染URG11后β-Catenin、c-Myc和cyclin D/D1表達(dá)下降； B.以GAPDH作內(nèi)參， 通過光學(xué)顯微鏡定量

每個蛋白質(zhì)的相對密度； 數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差， 所有實驗均在同一時間重復(fù)進行至少3次； *,與對照組比較P<0.05)

2.1.2 RT-qPCR結(jié)果

RT-qPCR結(jié)果顯示β-Catenin、 cyclin D1和c-myc的mRNA在未敲除URG11對照組中的表達(dá)顯著高于敲除URG11的A549 細(xì)胞實驗組 (分別為3.52倍，2.58倍和2.19倍，P<0.05)。

2.2 敲除URG11顯著減少異種移植腫瘤體在裸鼠體內(nèi)侵襲性生長

2.2.1 裸鼠異種移植腫瘤的免疫組化鑒定β-Catenin分布

異種移植腫瘤動物模型可見新生瘤體原位長于裸鼠左側(cè)腋下(圖2A)。收集飼養(yǎng)第三十五天的裸鼠，處死后用HE染色法對裸鼠新生腫瘤進行鑒定，確認(rèn)新生腫瘤是人源NSCLC(圖2B)，從而確定腫瘤異種移植動物模型的有效性。免疫組化法進一步鑒定β-Catenin在新生腫瘤組織里的分布情況，結(jié)果提示新生移植腫瘤組織的細(xì)胞胞漿里均勻分布有β-Catenin(圖2C)，進一步證實URG11及其下游基因β-Catenin在腫瘤侵襲性生長中的作用。

2.2.2 裸鼠異種移植腫瘤動物模型的動態(tài)觀察

通過裸鼠異種移植腫瘤模型動態(tài)觀察了URG11對腫瘤的體內(nèi)生長作用。裸鼠移植NSCLC細(xì)胞后可以新生腫瘤，從第七天開始即可以看到逐漸長大的瘤體。從第21天開始，實驗組和對照組的新生瘤體生長速度有明顯區(qū)別，實驗組的瘤體生長速度要明顯慢于對照組。與對照組相比，敲除URG11能顯著抑制BALB/c裸鼠體內(nèi)新生腫瘤的重量。第35天新生瘤體重量，實驗組VS對照組：(0.21±0.04)g VS (0.58±0.08)g，P<0.05，平均抑瘤率為63.79%; 同時敲除URG11能顯著減少異種移植腫瘤的體積第21、28、35天的新生瘤體體積，實驗組VS對照組：(258.33±0.24)mm3VS (512.86±0.18)mm3，(414.59±0.17)mm3VS (685.78±0.23)mm3, (423.21±0.36)mm3VS (986.73±0.14)mm3，P<0.05(圖3)。

A.

B.

C.

A.

B.

3 討 論

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是癌轉(zhuǎn)移的重要事件，可增強癌細(xì)胞的侵襲能力。由于腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高，NSCLC患者的長期存活率較低，而腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長是影響NSCLC患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。因此，鑒定預(yù)測NSCLC侵襲和預(yù)后的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)URG11在細(xì)胞粘附，遷移和EMT方面起重要作用[22]。在前列腺癌、胃癌、肝癌和胰腺癌中，URG11過度表達(dá)并調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖和分化[11,23-25]。然而URG11在NSCLC中的作用尚未見相關(guān)報道。本實驗的裸鼠成瘤研究數(shù)據(jù)表明URG11促進NSCLC侵襲生長的證據(jù)，敲除URG11基因可以抑制NSCLC的侵襲性生長。筆者等的前期研究表明，URG11在NSCLC中異常表達(dá)，URG11的高表達(dá)與NSCLC的高侵襲和差預(yù)后相關(guān)，而敲除URG11 能顯著抑制NSCLC細(xì)胞的增殖，遷移/侵襲[18]。據(jù)此，筆者等推測URG11可能參與了NSCLC的腫瘤發(fā)生，可能是潛在的NSCLC的生物標(biāo)志物。上述研究結(jié)果表明URG11可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

Wnt/β-catenin信號通路在促進腫瘤發(fā)展、癌細(xì)胞增殖擴散和侵襲性生長中起重要作用[10,26-27]。 β-Catenin是Wnt信號通路關(guān)鍵的末端成分，可以調(diào)節(jié)下游基因cyclinD1，c-Myc和基質(zhì)金屬蛋白酶-7 的表達(dá)，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖失控和侵襲性生長[28]。近期有研究表明，Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路與NSCLC腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[29]。在兩種主要NSCLC細(xì)胞系中觀察到 β-Catenin啟動子的高甲基化，β-Catenin的缺失與多種癌癥的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和偏晚的TNM分期相關(guān)，并且和NSCLC預(yù)后不良密切相關(guān)[29]。Akiri等證實β-Catenin在NSCLC細(xì)胞系和原發(fā)性NSCLC中過量表達(dá)，下調(diào)Wnt信號傳導(dǎo)通路的活性，可以抑制 NSCLC增殖，并誘導(dǎo)更加高分化的腫瘤表型[30]。還有研究表明，內(nèi)源性URG11表達(dá)，降低了活化的β-Catenin/TCF及其下游效應(yīng)基因cyclinD1和膜型金屬蛋白酶1(membrane type-1 matrix metalloproteinase， MT1-MMP)在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)[11]。與上述研究結(jié)果一致，本研究實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除URG11抑制了β-Catenin，c-Myc和cyclinD1在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)。

URG11誘導(dǎo)EMT的重要機制是β-Catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序。URG11可以反式激活β-Catenin并促進β-Catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄[33]。β-Catenin是貼壁細(xì)胞間的連接部位，它能通過連接上皮和E-鈣粘蛋白的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域促進細(xì)胞粘附，也可以通過結(jié)合TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子來激活轉(zhuǎn)錄[31]。有研究表明，β-Catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄可誘導(dǎo)Slug[32]和Twist1[33]的表達(dá)，從而導(dǎo)致EMT。還有研究[34]發(fā)現(xiàn)URG11過表達(dá)增加β-Catenin轉(zhuǎn)錄，促進β-Catenin/TCF活性，從而誘導(dǎo)表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物a-SMA和波形蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，敲除URG11抑制了β-Catenin，c-Myc和細(xì)胞周期蛋白D1在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)。因此筆者等初步推論：在NSCLC中URG11過表達(dá)反式激活β-Catenin并促使其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致β-Catenin/TCF靶基因表達(dá)上調(diào)，引起上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(即 EMT)，最終通過EMT增強癌細(xì)胞侵襲能力。

總之，本實驗選擇人NSCLC細(xì)胞系作為研究對象，通過基因敲除URG11，細(xì)胞培養(yǎng)和裸鼠移植瘤模型，從轉(zhuǎn)錄水平評價URG11對β-catenin及下游靶基因cyclin D1、c-myc的上調(diào)作用，觀察 URG11 對β-catenin蛋白的表達(dá)量和細(xì)胞定位變化的影響，以闡明URG11的高表達(dá)與NSCLC的高侵襲和差預(yù)后相關(guān)，URG11對NSCLC的促進作用在于其反式激活Wnt信號通路的樞紐蛋白β-Catenin并促使其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致β-Catenin/TCF靶基因表達(dá)上調(diào)，最終引起上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(EMT)，即EMT最終導(dǎo)致了NSCLC的發(fā)生和進展。