李 康, 王凱博, 陶麗紅, 李 麗, 李佳俊,吳文偉, 肖 春*,, 葉 敏*,

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650201)

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda(以下簡(jiǎn)稱FAW)，屬于鱗翅目、夜蛾科、灰翅夜蛾屬，原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，廣泛分布于美洲大陸[1]。2019 年1 月11 日首次在中國(guó)云南省江城縣發(fā)現(xiàn)FAW 幼蟲(chóng)[2]，其主要為害玉米、水稻、高粱和甘蔗等糧食作物的芯葉及果穗，造成農(nóng)作物產(chǎn)量減少和品質(zhì)下降[3]?；瘜W(xué)農(nóng)藥是防治FAW 的重要措施。除蟲(chóng)脲 (diflubenzuron)、茚蟲(chóng)威 (indoxacarb) 以及氯蟲(chóng)苯甲酰胺 (chlorantraniliprole)、氟苯蟲(chóng)酰胺 (flubendiamide) 等雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑是中國(guó)防治FAW 的推薦用藥，在FAW 的防治中發(fā)揮了重要作用[4]。

目前，殺蟲(chóng)劑抗性行動(dòng)委員會(huì) (Insecticide Resistance Action Committee, IRAC) 分類(lèi)的雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑共有5 個(gè)品種：氯蟲(chóng)苯甲酰胺、氟苯蟲(chóng)酰胺、溴氰蟲(chóng)酰胺 (cyantraniliprole)、環(huán)溴蟲(chóng)酰胺(cyclaniliprole) 和四唑蟲(chóng)酰胺 (tetraniliprole)[5]。氯蟲(chóng)苯甲酰胺、氟苯蟲(chóng)酰胺、溴氰蟲(chóng)酰胺等雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑具有殺蟲(chóng)廣譜、內(nèi)吸性好、高選擇性及對(duì)刺吸式口器害蟲(chóng)防效優(yōu)異等特點(diǎn)[6-8]，且主要作用鱗翅目和鞘翅目昆蟲(chóng)魚(yú)尼丁受體 (ryanodine receptor，RyR)，其激活RyR 導(dǎo)致鈣離子釋放，破壞昆蟲(chóng)體內(nèi)鈣離子平衡，從而影響昆蟲(chóng)的神經(jīng)肌肉功能[9]。RyR 是一種分布于動(dòng)物肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌漿網(wǎng)上的鈣離子通道蛋白，由4 個(gè)相同的亞基構(gòu)成的同源四聚體，每個(gè)亞基含有約5 000 個(gè)氨基酸殘基，是目前已發(fā)現(xiàn)的最大的離子通道型蛋白[10]。以RyR 為靶標(biāo)開(kāi)發(fā)的氟苯蟲(chóng)酰胺和氯蟲(chóng)苯甲酰胺等雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑對(duì)小菜蛾P(guān)lutella xylostella(以下簡(jiǎn)稱DBM)、斜紋夜蛾Spodoptera litura等鱗翅目昆蟲(chóng)均具有較高的毒性，對(duì)哺乳動(dòng)物則低毒、安全。但是，隨著雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的大量使用，其抗藥性問(wèn)題也日益突出[11-14]。

目前，研究鱗翅目害蟲(chóng)對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性多以DBM 為模式害蟲(chóng)。DBM 對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑已產(chǎn)生了高水平抗性：Guo 等對(duì)從廣東不同地區(qū)采集的4 個(gè)DBM 種群進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的抗性水平達(dá)303～658 倍[11]；據(jù)Troczka 報(bào)道，泰國(guó)DBM 田間種群對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺和氟苯蟲(chóng)酰胺的抗性分別高于200 倍和750 倍，菲律賓DBM 田間種群對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺和氟苯蟲(chóng)酰胺的抗性分別超過(guò)4 100 倍和1 300 倍[12]。另外，F(xiàn)AW 對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑也易產(chǎn)生抗性：2018 年在美國(guó)波多黎各田間發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AW 種群對(duì)氟苯蟲(chóng)酰胺產(chǎn)生了500 倍抗性，對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺產(chǎn)生了160 倍抗性[13]；Bolzan 等發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)篩選所得抗氯蟲(chóng)苯甲酰胺FAW 種群與溴氰蟲(chóng)酰胺存在低水平交互抗性 (27 倍)，而對(duì)氟苯蟲(chóng)酰胺則存在高達(dá)42 000 倍的交互抗性[15]。目前，DBM 對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗藥性機(jī)制較為明確：Troczka 在泰國(guó)和菲律賓的DBM 抗性種群中檢測(cè)到RyR 的G4946E 突變，通過(guò)Sf9 體外表達(dá)研究證實(shí)了G4946E突變可影響雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑與RyR的結(jié)合[12]；Steinbach 等進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了DBMRyR的G4946E 突變是導(dǎo)致其對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的主要機(jī)制[16]；郭磊等在云南采集的抗性種群中篩查得到了新的突變位點(diǎn)E1338D、Q4594L和I4790M，并通過(guò)熒光配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了含多個(gè)突變的DBMRyR 與氯蟲(chóng)苯甲酰胺的親和力顯著減弱[11,17-18]。其他鱗翅目害蟲(chóng)中：甜菜夜蛾Spodoptera exigua的抗性種群對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的抗性在150 倍以上，通過(guò)對(duì)其RyR 跨膜區(qū)域進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，抗性種群的主要突變?yōu)镮4743M，但未檢測(cè)到G4900E 等位基因突變[14]；二化螟Chilo suppressalisRyR 的G4910E 和I4758M的突變也會(huì)導(dǎo)致其對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生不同程度的抗性[19-20]。

FAW 對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)制相關(guān)研究較少。在現(xiàn)有報(bào)道中，Boaventura 對(duì)田間采集的FAW 種群進(jìn)行抗藥性誘導(dǎo)，與敏感種群相比，其對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺和氟苯蟲(chóng)酰胺的抗性分別為225 倍和5 400 倍。通過(guò)對(duì)FAWRyR 的C-末端結(jié)構(gòu)域Ⅱ～Ⅵ進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)單核苷酸多態(tài)性，導(dǎo)致I4734M 突變，因此被認(rèn)為是對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的靶點(diǎn)[21]。在有關(guān)DBMRyR 已報(bào)道的突變位點(diǎn)中，G4946E 和I4790M 頻率最高，其中G4946 對(duì)應(yīng)FAWRyR 中的G4891 氨基酸，I4790 對(duì)應(yīng)FAWRyR 中的I4734 氨基酸。FAWRyR中的I4734 與DBMRyR 的I4790 突變報(bào)道一致，但尚未見(jiàn)有關(guān)FAWRyR 中的G4891 氨基酸突變引起抗藥性的報(bào)道。FAWRyR 的G4891 和I4734 氨基酸突變是否是造成其對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的原因仍需探索。

隨著計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的發(fā)展，分子對(duì)接、同源建模等技術(shù)手段日趨成熟。通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)受體與配體之間的結(jié)合模式為研究靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)制提供了新的方法[22]。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)由氨基酸序列確定，由于蛋白質(zhì)的同源性，可以根據(jù)已知的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)未知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)的初步結(jié)構(gòu)[23]。目前，F(xiàn)AW 和DBM的RyR 結(jié)構(gòu)尚未被解析，但兔子Oryctolagus cuniculus、野豬Sus scrofa等哺乳動(dòng)物的RyR 的結(jié)構(gòu)解析已較為成熟，且兔子RyR 與氯蟲(chóng)苯甲酰胺結(jié)合的結(jié)構(gòu)已被解析 (PDB：7CF9)：氯蟲(chóng)苯甲酰胺主要與兔子RyR 蛋白C 端跨膜區(qū)域中S0-S4構(gòu)成的活性口袋結(jié)合[24]。FAWRyR (序列號(hào)：QCQ29110.1)[21]與DBMRyR (序列號(hào)：AET09964.1)[25]的氨基酸序列已知，可通過(guò)同源建模的方法獲得其三維模型及分子對(duì)接的方法分析親和構(gòu)象。

因此，本研究擬通過(guò)同源建模的方法構(gòu)建DBMRyR 和FAWRyR 跨膜區(qū)域的三維模型，通過(guò)在FAWRyR 中引入已報(bào)道的DBMRyR 的突變位點(diǎn) (G4946E，對(duì)應(yīng)FAWRyR 中G4891) 和FAWRyR的突變位點(diǎn) (I4734M)，構(gòu)建FAWRyR 的突變模型；通過(guò)分子對(duì)接的方法研究FAWRyR 突變前后與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合模式，分析FAWRyR 突變位點(diǎn)與抗藥性的關(guān)系。本研究從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度探究FAW 抗雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的機(jī)理，旨在為研究FAW 對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 計(jì)算機(jī)軟件與在線工具

1.1.1 軟件 Open Babel-2.4.1[26]、UCSF Chimera-1.11.2[27]、Pymol-2.1.0[28]、Autodock Tool-1.5.6[29]和Autodock Vina-1.1.2[30]。

1.1.2 在線工具

同源建模在線工具SWISS-MODEL[31]：https://swissmodel.expasy.org/。

蛋白質(zhì)質(zhì)量評(píng)價(jià)工具SAVEs：https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/。

蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)：http://www1.rcsb.org/。

NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)工具TMHMM[32]：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/。

作用力分析工具PLIP[33]：https://projects.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip。

保守性分析在線工具M(jìn)EME[34]：(https://memesuite.org/meme/)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 同源建模及模型評(píng)價(jià) 從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載DBMRyR 氨基酸序列 (序列號(hào)：AET09964.1)和FAWRyR 氨基酸序列 (序列號(hào)：QCQ29110.1)，通過(guò)TMHMM 分別預(yù)測(cè)DBMRyR 和FAWRyR 的跨膜區(qū)域。通過(guò)同源建模方法構(gòu)建FAWRyR (未突變，WT) 蛋白三維模型：選擇FAWRyR 跨膜區(qū)域 (S1-S6) 的氨基酸序列，以Ma 等報(bào)道的與FAWRyR氨基酸序列同源度為61.8%的兔子RyR 冷凍電鏡結(jié)構(gòu) (PDB：7CF9)[24]的跨膜區(qū)域?yàn)槟０?，用SWISS-MODEL 工具構(gòu)建FAWRyR 跨膜區(qū)域 (S1-S6) 的模型；選擇FAWRyR 跨膜區(qū)域 (S0) 的氨基酸序列，通過(guò)SWISS-MODEL 進(jìn)行序列對(duì)比分析，以PDB：1p7b.1.A 為模板構(gòu)建FAWRyR 跨膜區(qū)域S0 的模型。使用Pymol-2.1.0 和UCSF Chimera-1.11.2 軟件對(duì)在線夠建的模型進(jìn)行拼合、優(yōu)化，構(gòu)建出WT FAWRyR 的四聚體結(jié)構(gòu)。DBMRyR 跨膜區(qū)域模型的構(gòu)建方法亦如此。

使用SAVEs 的Procheck[35]工具，驗(yàn)證所建模型在立體化學(xué)上的合理性及能量上的穩(wěn)定性。各殘基間的Pis 和Phi 兩個(gè)角度的合理性評(píng)價(jià)結(jié)果以拉氏圖 (Ramachandran Plot) 展示。根據(jù)拉氏圖中最優(yōu)區(qū)域、額外允許區(qū)域、一般允許區(qū)域等的百分比評(píng)價(jià)所建蛋白質(zhì)模型是否合理[35]。

1.2.2 FAWRyR 突變體構(gòu)建 將已報(bào)道的DBMRyR 的突變位點(diǎn)G4946E、I4790M，以及甜菜夜蛾S. exiguaRyR 的G4900E、I4743M[14]，二化螟C. suppressalisRyR 的G4910E、I4758M[19-20]與FAWRyR 氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明其分別對(duì)應(yīng)FAWRyR的G4891E 和I4734M，其中I4734M 為已報(bào)道的FAWRyR 突變位點(diǎn)[21]。故本研究使用UCSF Chimera-1.11.2 軟件分別將FAWRyR中G4891 的“Gly”突變?yōu)椤癎lu”、I4734 的“Ile”突變?yōu)椤癕et”，構(gòu)建突變模型FAWRyR-E4891 和FAWRyR-M4734。將WT FAWRyR、FAWRyRE4891 及FAWRyR-M4734 的模型分別用Autodock Tool-1.5.6 進(jìn)行能量最小化和去水加氫等處理，作為分子對(duì)接受體。

1.2.3 配體構(gòu)建 從IRAC 查詢雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑：氯蟲(chóng)苯甲酰胺、氟苯蟲(chóng)酰胺、溴氰蟲(chóng)酰胺、環(huán)溴蟲(chóng)酰胺和四唑蟲(chóng)酰胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使用Open Babel-2.4.1 軟件獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)的3D 結(jié)構(gòu)，利用Autodock Tool-1.5.6 進(jìn)行能量最小化等處理，作為分子對(duì)接配體。

1.2.4 分子對(duì)接及結(jié)合模式分析

1.2.4.1 分子對(duì)接 根據(jù)已報(bào)道的兔子RyR 與氯蟲(chóng)苯甲酰胺復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)蛋白質(zhì)模型疊合預(yù)測(cè)所建模型的活性口袋位置，并構(gòu)建Docking-Box (圖1)。FAWRyRs 對(duì)接所用Box 參數(shù)為：center-x = 252.259，center-y =207.152，center-z = 299.459；size-x = 22.0，size-y =18.0，size-z = 18.0。

將1.2.1 節(jié)和1.2.2 節(jié)中處理好的蛋白質(zhì)受體與1.2.3 節(jié)中準(zhǔn)備好的配體使用Autodock Vina-1.1.2 軟件進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算平臺(tái)HP-PC：Inter Corei5-1035G1CPU@3.6 GHz；對(duì)接參數(shù)為：exhaustive ness = 8，numb-modes = 9，energyrange = 3，對(duì)接結(jié)果按結(jié)合親和力打分排序。

1.2.4.2 結(jié)合模式分析 分別選擇5 種配體的最優(yōu)構(gòu)象，構(gòu)建其與受體的復(fù)合物，利用PLIP 在線工具分析配體與受體之間的氫鍵、鹵鍵、疏水作用、π-π 相互作用及π-陽(yáng)離子作用等非共價(jià)相互作用力，使用Pymol-2.1.0 繪制結(jié)合模式圖。

1.2.5 基因序列保守性分析 將FAWRyR 跨膜區(qū)域的蛋白質(zhì)序列作為查詢序列，在NCBI 中使用BLASTP 查詢相關(guān)同源蛋白。最終得到100 條與FAWRyR 同源的蛋白氨基酸序列，且主要以鱗翅目昆蟲(chóng)為主 (表1)。將這100 條RyR 氨基酸序列用MEME (https://meme-suite.org/meme/) 工具計(jì)算分析，獲得Motif 圖，并進(jìn)行保守性分析。

表1 與FAWRyR 跨膜區(qū)域氨基酸序列具有同源的昆蟲(chóng)基因數(shù)量Table 1 The number of insect genes with homologous amino acid sequences with FAWRyR of transmembrane region

2 結(jié)果與分析

2.1 同源建模結(jié)果及評(píng)價(jià)

根據(jù)DBMRyR 和FAWRyR 的氨基酸序列，分別以PDB：7CF9 的跨膜區(qū)域?yàn)槟０?，?gòu)建的跨膜區(qū)域S1-S6；以同源較高的PDB：1p7b.1.A 為模板，在線構(gòu)建的跨膜區(qū)域S0，拼合后所得最終RyR 四聚體結(jié)構(gòu)如圖2a、2d 所示。由圖2a、2d 可知：FAW 和DBM 的RyR 的四個(gè)亞基呈軸對(duì)稱分布，每個(gè)亞基的氨基酸序列相同，中間有一由親水性氨基酸殘基圍成的孔，鈣離子從中通過(guò)[36]；由圖2b、2e 可知，跨膜區(qū)域主要由幾組平行的α 螺旋構(gòu)成，展示出明顯的跨膜蛋白特性。

WT FAWRyR 和DBMRyR 的模型評(píng)價(jià)結(jié)果如圖2c、2f 所示：WT FAWRyR 及DBMRyR 的Procheck 評(píng)估結(jié)果分別為：最優(yōu)區(qū)域殘基占比87.4%、89.8%，額外允許區(qū)殘基占比11.7%、9.5%，兩者殘基位于允許區(qū)域的比例均大于90%，模型合理。

將WT FAWRyR 與DBMRyR 的模型進(jìn)行疊合對(duì)比 (圖3a、3b)，并把DBMRyR 跨膜區(qū)域的氨基酸序列與WT FAWRyR 跨膜區(qū)域的蛋白模型進(jìn)行對(duì)比 (圖3c)，三維結(jié)構(gòu)對(duì)比結(jié)果顯示：兩者的RMSD 值為0.082，其三維模型差異較小。二維序列對(duì)比結(jié)果表明：兩者的同源度為92.55%，覆蓋度為99%，具有較高的同源性。

2.2 分子對(duì)接結(jié)果分析

2.2.1 雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑與WT FAWRyR 的結(jié)合模式分析 對(duì)接方法驗(yàn)證：將WT FAWRyR 與5 種雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑分別對(duì)接后 (保留9 個(gè)構(gòu)象)，根據(jù)對(duì)接親和力打分進(jìn)行排序，并選擇最佳對(duì)接構(gòu)象與已解析的兔子RyR 與氯蟲(chóng)苯甲酰胺的復(fù)合晶體進(jìn)行疊合對(duì)比。結(jié)果表明：預(yù)測(cè)的配體構(gòu)象與實(shí)際構(gòu)象相似，結(jié)合模式合理，證明對(duì)接方法可行。

WT FAWRyR 與氯蟲(chóng)苯甲酰胺、氟苯蟲(chóng)酰胺、溴氰蟲(chóng)酰胺、環(huán)溴蟲(chóng)酰胺及四唑蟲(chóng)酰胺最優(yōu)構(gòu)象的結(jié)合親和力分別為：-31.813 6、-35.581、-33.488、-30.139 2 和-38.092 6 kJ/mol。對(duì)結(jié)合模式進(jìn)行分析可知：L4458、Y4462、Y4643、L4646 和F4892 與氯蟲(chóng)苯甲酰胺的苯環(huán)及吡啶環(huán)形成疏水作用；K4642 與吡啶環(huán)上的N 原子形成氫鍵；Y4639 與吡啶環(huán)形成π-π 相互作用；K4642的N 原子與吡唑環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用；G4891與吡啶環(huán)上的Cl 原子形成鹵鍵 (圖4a)。L4458、T4863、V4890 與氟苯蟲(chóng)酰胺的苯環(huán)形成疏水作用；K4642 與羰基上的O 原子形成氫鍵，R4896與磺?；系腛 原子形成氫鍵，V4890、G4891與酰胺上的NH 形成氫鍵；R4896 的N 原子與苯環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用 (圖4b)。L4458、Y4462、Y4643、L4646 和F4892 與溴氰蟲(chóng)酰胺的苯環(huán)、吡啶環(huán)形成疏水作用；K4642、G4891 分別與吡啶環(huán)上的N 原子和吡唑環(huán)側(cè)酰胺結(jié)構(gòu)NH 形成氫鍵；Y4639 與吡啶環(huán)形成π-π 相互作用；K4642與吡唑環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用；G4891 與吡啶環(huán)上的Cl 原子形成鹵鍵 (圖4c)。L4458、L4646、Y4863、V4890 和F4892 與環(huán)溴蟲(chóng)酰胺的吡啶環(huán)及環(huán)丙基形成疏水作用；K4642 與吡唑環(huán)的N 原子形成氫鍵，G4891 與環(huán)丙基側(cè)酰胺結(jié)構(gòu)的NH 形成氫鍵，R4896 與吡唑環(huán)側(cè)羰基的O 原子形成氫鍵；K4642、R4896 的N 原子分別與吡啶環(huán)和吡唑環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用 (圖4d)。Y4462、Y4643、L4646 和F4892 與四唑蟲(chóng)酰胺的苯環(huán)形成疏水作用；K4642、G4891 分別與吡啶環(huán)上的N 原子和吡唑環(huán)側(cè)酰胺結(jié)構(gòu)的NH 形成氫鍵；Y4639 和Y4863 分別與吡啶環(huán)和四唑環(huán)形成π-π 相互作用；K4642 的N 原子與吡唑環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用；S4860 與三氟甲基上的F 原子形成鹵鍵 (圖4e)。由于存在疏水作用、π-π 相互作用、π-陽(yáng)離子作用及分子間形成的氫鍵和鹵鍵，使分子能穩(wěn)定存在。5 種殺蟲(chóng)劑與WT FAWRyR 對(duì)接后的位置如圖4f 所示，可見(jiàn)其位置都位于預(yù)測(cè)的活性口袋內(nèi)。

2.2.2 雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑與FAWRyR-E4891 的結(jié)合模式分析 FAWRyR-E4891 與氯蟲(chóng)苯甲酰胺、氟苯蟲(chóng)酰胺、溴氰蟲(chóng)酰胺、環(huán)溴蟲(chóng)酰胺及四唑蟲(chóng)酰胺最優(yōu)構(gòu)象的結(jié)合親和力分別為：-26.371 8、-29.720 6、-28.464 8、-27.209 和-32.650 8 kJ/mol。對(duì)結(jié)合模式進(jìn)行分析可知：Y4639、K4642 和Y4738 與氯蟲(chóng)苯甲酰胺的苯環(huán)上的甲基和吡啶環(huán)形成疏水作用；Y4639 和K4642 分別與苯環(huán)側(cè)酰胺結(jié)構(gòu)的NH 和吡啶環(huán)上的N 原子形成氫鍵；Y4639 與苯環(huán)形成π-π 相互作用；K4642 的N 原子與吡啶環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用 (圖5a)。F4638、Y4639、Y4738、K4642、K4742 和Y4863 與氟苯蟲(chóng)酰胺的苯環(huán)及甲基形成疏水作用；K4642 與苯環(huán)側(cè)羰基上的O 原子形成氫鍵；K4642 的N 原子與苯環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用；Y4639 與苯環(huán)形成ππ 相互作用；Y4639 與三氟甲基上的F 原子形成鹵鍵(圖5b)。L4458、Y4639、K4642 和Y4738 與溴氰蟲(chóng)酰胺的苯環(huán)、苯環(huán)上的甲基和吡啶環(huán)形成疏水作用；Y4639、K4642 分別與酰胺結(jié)構(gòu)NH 和吡唑環(huán)側(cè)上羰基的O 原子形成氫鍵；Y4639 與苯環(huán)形成π-π 相互作用，K4642 的N 原子與吡啶環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用 (圖5c)。Y4639、K4642、Y4863、V4890 和R4896 與環(huán)溴蟲(chóng)酰胺的吡啶環(huán)及環(huán)丙烷等形成疏水作用；R4896 與吡唑環(huán)側(cè)羰基的O 原子形成氫鍵；K4642 和R4896 的N 原子分別與吡唑環(huán)和吡啶環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用 (圖5d)。V4890與四唑蟲(chóng)酰胺的吡啶環(huán)形成疏水作用；K4642 與四唑環(huán)上的N 原子形成氫鍵；K4642 的N 原子與四唑環(huán)、吡唑環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用 (圖5e)。FAWRyRE4891 與5 種殺蟲(chóng)劑對(duì)接的位置如圖5f 所示，可見(jiàn)其5 種構(gòu)象的位置都位于預(yù)測(cè)的活性口袋內(nèi)。

2.2.3 雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑與FAWRyR-M4734 的結(jié)合模式分析 FAWRyR-M4734 與氯蟲(chóng)苯甲酰胺、氟苯蟲(chóng)酰胺、溴氰蟲(chóng)酰胺、環(huán)溴蟲(chóng)酰胺及四唑蟲(chóng)酰胺最優(yōu)構(gòu)象的結(jié)合親和力分別為：-32.232 2、-35.581、-33.906 6、-29.720 6 和-38.512 2 kJ/mol。對(duì)結(jié)合模式進(jìn)行分析可知：L4458、Y4462、Y4643、L4646 和F4892 與氯蟲(chóng)苯甲酰胺的苯環(huán)和吡啶環(huán)形成疏水作用；K4642 與吡啶環(huán)上的N 原子形成氫鍵；Y4639 與吡啶環(huán)形成π-π 相互作用；K4642的N 原子與吡唑環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用；G4891 與吡啶環(huán)上的Cl 原子形成鹵鍵 (圖6a)；L4458、Y4738、K4742、Y4863 和V4890 與氟苯蟲(chóng)酰胺的苯環(huán)及甲基形成疏水作用；K4642 和K4742 分別與磺酰基上的O 原子形成氫鍵，V4890 和G4891與苯環(huán)側(cè)酰胺結(jié)構(gòu)的NH 形成氫鍵；R4896 的N 原子與苯環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用 (圖6b)；L4458、Y4462、Y4643、L4646 和F4892 與溴氰蟲(chóng)酰胺的苯環(huán)和吡啶環(huán)形成疏水作用；K4642、G4891 分別與吡啶環(huán)的N 原子和酰胺結(jié)構(gòu)的NH 形成氫鍵；Y4639 與吡啶環(huán)形成π-π 相互作用，K4642 與吡唑環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用；G4891 與吡啶環(huán)上的Cl 原子形成鹵鍵 (圖6c)；L4458、L4646、Y4863、V4890 和F4892 與環(huán)溴蟲(chóng)酰胺的吡啶環(huán)及環(huán)丙烷形成疏水作用；K4642 與吡唑環(huán)上的N 原子形成氫鍵，G4891 與環(huán)丙基側(cè)酰胺的NH 形成氫鍵，R4896 與丙三環(huán)側(cè)羰基的O 原子形成氫鍵；R4896的N 原子與吡啶環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用 (圖6d)；Y4462、Y4643、L4646 和F4892 與四唑蟲(chóng)酰胺的苯環(huán)形成疏水作用；K4642 與吡啶環(huán)上的N 原子形成氫鍵，G4891 與苯環(huán)側(cè)酰胺結(jié)構(gòu)的NH 形成氫鍵；Y4639 和Y4863 分別與吡啶環(huán)和四唑環(huán)形成π-π 相互作用；K4642 的N 原子與吡唑環(huán)形成π-陽(yáng)離子作用；S4860 與三氟甲基上的F 原子形成鹵鍵 (圖6e)；FAWRyR-M4734 與5 種殺蟲(chóng)劑對(duì)接的位置如圖6f 所示，可見(jiàn)其5 種構(gòu)象的位置都位于預(yù)測(cè)的活性口袋內(nèi)。

2.3 FAW 突變位點(diǎn)分析

由表2 可知：FAWRyR 的4734 位異亮氨酸(Ile) 突變?yōu)榈鞍彼?(Met) 后，與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合親和力未下降；FAWRyR 的4891 位甘氨酸(Gly) 突變?yōu)楣劝彼?(Glu) 后，與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合親和力明顯降低。

表2 FAWRyR 突變前后與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合親和力變化Table 2 The binding affinity changes of the wild-type (WT) & mutant FAWRyRs and diamides

五種雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑與WT FAWRyR、FAWRyRE4891 和FAWRyR-M4734 的結(jié)合模式如圖7 所示：將FAWRyR 的I4734 突變?yōu)镸4734 后，與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑之間的作用力方式、參與形成作用力的殘基和WT FAWRyR 基本一致，初步分析其主要原因是FAWRyR 的4734 號(hào)異亮氨酸(Ile) 不參與配體與受體之間作用力的形成。而FAWRyR 的4891 號(hào)甘氨酸 (Gly) 與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑之間存在氫鍵、鹵鍵相互作用，突變?yōu)楣劝彼?Glu) 后，不能與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑形成氫鍵、鹵鍵，導(dǎo)致受體與配體之間的作用力方式減少、親和力下降。FAWRyR 中G4891 突變?yōu)镋4891 可能是導(dǎo)致FAW 對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗藥性的主要原因，而I4734M 突變可能與抗藥性的產(chǎn)生無(wú)關(guān)。

2.4 氨基酸保守性分析

由MEME 工具分析得到Motif 圖 (圖8、圖9)，圖中FAWRyR 跨膜區(qū)域的活性口袋由L4458、Y4461、L4641、Y4462、Y4639、K4642、Y4643、S4860、F4861、S4864、V4888、V4890、G4891、F4892 和K4893 構(gòu)成 (如圖8 所示)，其中Y4461、L4641、Y4462、Y4639、K4642、Y4643、S4860、F4861、S4864、V4888、V4890、G4891、F4892、K4893 均在保守區(qū)域，而L4458 在不保守區(qū)域，存在L4458Y 突變的可能 (如圖9 所示)，但尚未見(jiàn)L4458 氨基酸突變?yōu)閅4458 氨基酸的相關(guān)報(bào)道，且L4458 氨基酸不與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑形成氫鍵等關(guān)鍵相互作用，L4458Y 突變引起雙酰胺類(lèi)抗藥性的幾率較低。而G4891 氨基酸雖在FAWRyR的保守區(qū)域，但前文研究表明，G4891E 突變會(huì)引起FAWRyR 與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合親和力下降，因此，引起抗藥性的G4891E 突變可能為隨機(jī)突變。

3 討論

解析鱗翅目害蟲(chóng)RyR 與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合模式一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Steinbach 等根據(jù)Yan 等[37]解析的兔子RyR (PDB：3J8H) 的結(jié)構(gòu)構(gòu)建了DBMRyR 的同源模型，在此模型上引入G4946E 和I4790M 突變，并分析了雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑與DBMRyR 的結(jié)合模式，提出RyR 與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合位點(diǎn)可能在這兩個(gè)突變位點(diǎn)附近，但雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑與DBMRyR 的結(jié)合模式、相互作用力以及形成作用力的殘基等尚不明確[16]。2020 年，Ma 等使用冷凍電鏡解析了兔子RyR 和氯蟲(chóng)苯甲酰胺復(fù)合體的結(jié)構(gòu) (PDB：7CF9)，揭示了兔子RyR 中氯蟲(chóng)苯甲酰胺的結(jié)合口袋、作用方式以及參與結(jié)合的殘基[24]，但FAWRyR 與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合模式尚不明確。另外，F(xiàn)AW 對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)制的相關(guān)研究較少。因此，本研究在已有研究的基礎(chǔ)上，選擇PDB：7CF9為模板，同源構(gòu)建FAWRyR 的三維模型，并使用分子對(duì)接方法分析FAWRyR 與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合模式。結(jié)果表明：5 種雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑與FAWRyR 結(jié)合的活性口袋以及兩者之間形成作用力的氨基酸殘基基本一致。該結(jié)果與Qi 等報(bào)道的“氯蟲(chóng)苯甲酰胺和氟苯蟲(chóng)酰胺雖結(jié)構(gòu)上略有差異，但結(jié)合位點(diǎn)相同”[38-39]的觀點(diǎn)一致。

目前，鱗翅目害蟲(chóng)對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性可能與DBMRyR 的G4946E、I4790M，S. exiguaRyR 的I4743M 以及C. suppressalisRyR 的G4910E和I4758M (均對(duì)應(yīng)FAWRyR 的G4891、I4734) 突變有關(guān)。鱗翅目害蟲(chóng)RyR 跨膜區(qū)域氨基酸序列同源度一般在92%以上[40]，本研究通過(guò)對(duì)比WT FAWRyR和DBMRyR 跨膜區(qū)域的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)兩者的同源度高達(dá)92.55%；對(duì)比兩者RyR 三維模型，其RMSD 值為0.082，兩者同源度極高。因此，本研究根據(jù)DBMRyR 的G4946E 和I4790M 突變構(gòu)建了FAWRyR-E4891 和FAWRyR-M4734 突變體，并分析了其與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合模式。結(jié)果表明：FAWRyR 的G4891 突變?yōu)镋4891 后，與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的親和力下降。目前已有研究結(jié)果表明，DBMRyR、C. suppressalisRyR 的G4946E 和G4910E (均對(duì)應(yīng)FAWRyR 的G4891) 突變均可能導(dǎo)致其對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性。因此，F(xiàn)AWRyR的G4891E 突變，可能是FAW 對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的原因之一。在今后的研究中，需重點(diǎn)關(guān)注FAWRyR 的G4891E 突變?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，F(xiàn)AWRyR 的I4734M 突變也可能與FAW 對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺和氟苯蟲(chóng)酰胺的抗性有關(guān)[21]。但本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AWRyR 的4734 號(hào)氨基酸不參與其與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合，I4734 突變?yōu)镸4734 后FAWRyR 與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的親和力并未下降。另外，Ma 等的研究結(jié)果表明：DBMRyR 的I4790(對(duì)應(yīng)FAW 的I4734) 也不是其與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑形成親和力的主要?dú)埢鵞24]。Boaventura 等在研究FAWRyR 的4734 號(hào)氨基酸突變與抗藥性關(guān)系時(shí)所測(cè)田間幼蟲(chóng)樣本數(shù)量有限，田間樣本中I4734M突變頻率較低[21]，I4734M 突變是否能夠?qū)е翭AW 對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性仍需進(jìn)一步研究探索。本研究也表明：G4891 在FAWRyR 的保守區(qū)域，引起抗藥性的G4891E 突變可能為隨機(jī)突變。除G4891 外，K4642、V4890 和R4896 與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑也可能存在氫鍵相互作用，同時(shí)也存在隨機(jī)突變的可能性。因此，在后期研究中，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注這3 個(gè)氨基酸的突變，并進(jìn)一步研究該突變與其對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑抗性的關(guān)系。另外在未來(lái)研究中，除了使用通過(guò)分子對(duì)接、氨基酸序列保守性分析的方法外，還可以考慮使用突變預(yù)測(cè)工具，如：AIMMS[41]、KRDS[42]在線工具和生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)建模方法[43]等預(yù)測(cè)其他隨機(jī)突變與抗藥性之間的關(guān)系。

目前，本研究?jī)H通過(guò)同源建模方法構(gòu)建了FAWRyR 突變前后的三維模型，通過(guò)分子對(duì)接方法模擬FAWRyR 突變前后與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合模式，能夠?yàn)榉治鯢AW 對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)制提供理論依據(jù)。但是，分子對(duì)接的方法只能初步分析配體與受體之間的親和力，而分子動(dòng)力學(xué)模擬能更加準(zhǔn)確地計(jì)算配體與蛋白受體的絕對(duì)結(jié)合自由能，其在藥物結(jié)合靶標(biāo)研究中被廣泛應(yīng)用[44-45]。LAMMPS、Gromacs、NAMD 等傳統(tǒng)的分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件操作繁瑣，不適合進(jìn)行大量的結(jié)合模式分析和結(jié)合自由能計(jì)算工作。目前也有一些圖形化的分子動(dòng)力學(xué)模擬在線工具 (如：LARMD[46]) 正在研發(fā)中，在未來(lái)研究中可以考慮運(yùn)用這些工具進(jìn)一步分析配體與受體之間的結(jié)合模式，計(jì)算親和力。另外，本研究通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬得出的理論計(jì)算結(jié)果并未經(jīng)過(guò)實(shí)際的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，且同源建模和分子對(duì)接方法僅是計(jì)算機(jī)模擬方法，無(wú)法完全準(zhǔn)確模擬受體和配體之間的結(jié)合模式。在今后研究中，可以通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證該文的理論計(jì)算結(jié)果，以及可以使用冷凍電鏡或X-ray 衍射法分析FAWRyR與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，精確分析兩者之間的結(jié)合模式。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)蛋白質(zhì)模建、分子對(duì)接等計(jì)算機(jī)分子模擬方法，分析了WT FAWRyR 與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合模式；根據(jù)已報(bào)道的鱗翅目害蟲(chóng)RyR 的突變位點(diǎn)，構(gòu)建FAWRyR 突變體，并對(duì)其分析與5 種雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合模式。主要結(jié)論有：

1) 通過(guò)同源建模的方法構(gòu)建了FAWRyR 的C 端跨膜區(qū)域及其突變體的三維模型。

2) 通過(guò)對(duì)比分析FAWRyR 突變前后與5 種雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合模式，發(fā)現(xiàn)G4891E 突變會(huì)導(dǎo)致FAWRyR 與雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的結(jié)合親和力下降、形成的作用力方式減少，從而導(dǎo)致FAW 對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性。

本研究從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度初步分析了FAW 抗雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的機(jī)理，能夠?yàn)檠芯縁AW 對(duì)雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性提供線索，同時(shí)為今后殺蟲(chóng)劑分子設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)修飾提供參考。在今后研究中可結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、冷凍電鏡或X-ray 衍射法進(jìn)一步驗(yàn)證FAW 抗雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑的機(jī)理。