梁秀美, 張 井, 林定鵬, 何如意, 謝拾冰,廖琳慧, 王 亮, 徐 靜, 張維一*,

(1. 浙江省溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)站，浙江 溫州 325006；2. 浙江省麗水市蓮都區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 麗水 323000)

中國(guó)是禽蛋生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，禽蛋具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其質(zhì)量安全直接關(guān)系到消費(fèi)者的身體健康和國(guó)家經(jīng)濟(jì)利益[1]。但養(yǎng)殖場(chǎng)在養(yǎng)殖過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)使用衛(wèi)生殺蟲(chóng)劑來(lái)維持場(chǎng)內(nèi)環(huán)境，如使用菊酯類、有機(jī)磷類等來(lái)消滅雞羽虱[2]等。一些不易降解的農(nóng)藥會(huì)經(jīng)過(guò)禽類飼料等食物鏈的傳遞、富集，進(jìn)入禽蛋并積累其中[3]。人們?nèi)绻L(zhǎng)期食用含有農(nóng)藥甚至超標(biāo)的禽蛋，可引起慢性中毒；農(nóng)藥長(zhǎng)期在人體內(nèi)累積會(huì)產(chǎn)生致畸、致癌和致突變作用[4]。因此，建立禽蛋中農(nóng)藥多殘留的快速精準(zhǔn)檢測(cè)方法，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

現(xiàn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)大都針對(duì)植物源性食品[5-6]，禽蛋中農(nóng)藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)大多集中在氟蟲(chóng)腈及其代謝物的農(nóng)藥殘留[7]，諸多農(nóng)藥殘留缺乏有效的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物源性食品中農(nóng)藥殘留樣品前處理方法主要有固相萃取法[8]、加速溶劑萃取法[9]、凝膠滲透色譜法[10]及QuEChERS 法[11]等。與前3 種方法相比，QuEChERS 法具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、環(huán)境友好、檢測(cè)高效等優(yōu)勢(shì)，而且還可準(zhǔn)確分離出殘留的農(nóng)藥成分[12]。因此，本研究選取QuEChERS 方法作為樣品前處理方法。農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[13-14]、氣相色譜法[15-16]、液相色譜法[17-18]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 (GC-MS/MS)[19-20]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[21-22]等。其中GC-MS/MS 不僅適用于復(fù)雜基質(zhì)混合物的定性分析，還可以利用得到的二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行定量，并具有較高的靈敏度。雖已有報(bào)道利用GC-MS/MS 檢測(cè)禽蛋中200 余種農(nóng)藥殘留的方法，但該方法需要大量的有機(jī)試劑，操作繁瑣[23]。本研究基于本單位日常農(nóng)產(chǎn)品例行檢測(cè)中檢出率較高的農(nóng)藥和養(yǎng)殖場(chǎng)可能使用的衛(wèi)生殺蟲(chóng)劑，重點(diǎn)針對(duì)有機(jī)氯 (包括六六六、滴滴涕等)、有機(jī)磷及擬除蟲(chóng)菊酯類等衛(wèi)生殺蟲(chóng)劑和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的農(nóng)藥，在QuEChERS 樣品前處理方法基礎(chǔ)上，優(yōu)化提取和凈化條件，建立了可同時(shí)檢測(cè)禽蛋中53 種農(nóng)藥殘留的GC-MS/ MS 分析方法，旨在為禽蛋中農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)提供可操作性強(qiáng)的實(shí)用分析技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及材料

Agilent 7890B/7000D 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有EI 離子源 (美國(guó)Agilent 公司)；艾本德5804R冷凍高速離心機(jī) (德國(guó)EPPENDORF 公司)；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；OA-SYS/N-EVAP-112 氮吹儀 (美國(guó)Organomation 公司)；MS7610-33 旋渦振蕩器 (美國(guó)Thermo Fisher 公司)；Milli-Q Direct 8 超純水儀(美國(guó)Millipore 公司)；AR1502CN 電子天平 (奧豪斯儀器有限公司)。

53 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，質(zhì)量濃度均為100 mg/L (液態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。

十八烷基硅烷 (C18，40～63 μm)、乙二胺-N-丙基硅烷 (PSA，40～63 μm)、石墨化碳黑 (GCB，120～400 目)、酸性氧化鋁 (7G010005)、堿性氧化鋁 (AG010005) 和硅藻土 (545) (德國(guó)CNW 公司)；弗羅里硅土 (0.150～0.250 mm) (美國(guó)WZ.der.Floridin公司)；超純硅膠 (60～200 μm) (加拿大SILICYCLE公司)；EMR 凈化管 (5 982～1 010) (美國(guó)Agilent 公司)；無(wú)水硫酸鎂和二氯甲烷 (分析純，西隴化工股份有限公司)；乙腈和正己烷 (分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇 (分析純，衢州巨化試劑有限公司)；丙酮 (分析純，浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司)；乙酸乙酯 (分析純，上海展云化工有限公司)；乙酸乙酯和甲酸 (色譜純，德國(guó)默克公司)；0.22 μm 濾膜、1 mL 注射器和2 mL 樣品瓶 (上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；試驗(yàn)用水為Milli-Q Direct 8 超純水儀制備的超純水。

供試禽蛋品種包括雞蛋、鴨蛋、鴿子蛋、鵪鶉蛋和鵝蛋共5 種，為溫州市各縣市區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及養(yǎng)殖基地抽檢樣品。

1.2 檢測(cè)條件

色譜條件：HP-5MS 色譜柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；載氣為氦氣，流速為2.25 mL/min；碰撞氣為氮?dú)猓魉贋?.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度290 ℃；傳輸線溫度280 ℃；柱升溫程序：初始溫度60 ℃ 保持1 min，以40 ℃/min 升至170 ℃，再以10 ℃/min 升至310 ℃，保持3 min；進(jìn)樣體積1.0 μL；不分流進(jìn)樣，不分流時(shí)間為1 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源 (EI)；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離能70 eV；質(zhì)譜接口溫度280 ℃；動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 (dMRM)；總運(yùn)行時(shí)間20.75 min。53 種農(nóng)藥的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù) (按出峰順序) 見(jiàn)表1，典型色譜圖見(jiàn)圖1。

續(xù)表1Table 1 (Continued)

1.3 樣品前處理方法

樣品制備：取約1.5 kg 禽蛋，去殼后用組織勻漿機(jī)充分?jǐn)嚢杈鶆?，?-20 ℃保存，待測(cè)。

稱取2.50 g 均質(zhì)樣品于50 mL 離心管中，加入10.00 mL 乙酸乙酯，超聲30 min；加入2.0 g無(wú)水硫酸鎂，渦旋1 min 后于6 000 r/min、-4 ℃下離心5 min；取6 mL 上清液于15 mL離心管中，加入900 mg 無(wú)水硫酸鎂、150 mg 弗羅里硅土和300 mg 硅藻土，渦旋30 s 后于10 000 r/min、-4 ℃下離心5 min；取4.00 mL 上清液于5 mL 試管中，40 ℃水浴下氮吹至近干，用1.00 mL 乙酸乙酯復(fù)溶，過(guò)0.22 μm 濾膜，待測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液1 (1.00 mg/L)的配制：準(zhǔn)確移取53 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各0.100 mL 于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度線，于4 ℃保存，備用。

標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液2 (0.40 mg/L，以甲基毒死蜱計(jì)) 配制：按53 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的定量限比例，分別移取一定體積的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度線，于4 ℃保存，備用。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 配制：臨用時(shí)，用乙酸乙酯溶液溶解的樣品空白基質(zhì)提取液，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液1，配制成0.10、0. 20、0.50、1、2、5、10、20 和50 μg/L 系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液1，用于確定儀器的檢出限和方法的定量限。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2 配制：臨用時(shí)，用乙酸乙酯溶液溶解的樣品空白基質(zhì)提取液，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液2，配制成1、2、5、10、20 和50 μg/L (以甲基毒死蜱計(jì)) 系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液2，用于確定方法的線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 樣品提取 以雞蛋為研究對(duì)象，通過(guò)添加回收試驗(yàn)，考察了不同溶劑對(duì)53 種農(nóng)藥的提取效果。稱取2.50 g 樣品 (每個(gè)處理3 個(gè)平行、1 個(gè)空白)，添加250 μL 標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液1，靜置30 min后加入10.00 mL 提取溶劑，超聲30 min 后加入2.0 g 無(wú)水硫酸鎂，渦旋1 min 后于6 000 r/min、-4 ℃下離心5 min；取上清液，過(guò)0.22 μm 濾膜，待GC-MS/MS 檢測(cè)，空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。結(jié)果顯示：乙腈、乙酸乙酯的提取效果較其他溶劑更好 (表2)。龐國(guó)芳等的研究表明，在提取液中加入緩沖試劑如甲酸，對(duì)維持溶液的pH 值及降低敏感性藥物的降解有很好的作用[24-26]，故本研究考察了加入體積分?jǐn)?shù)1%的甲酸對(duì)提取效果的影響。結(jié)果顯示，在乙腈中加入1%的甲酸對(duì)目標(biāo)物的提取效果影響不明顯。考慮到乙酸乙酯的價(jià)格、毒性均較乙腈低，因此選擇乙酸乙酯為提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對(duì)53 種農(nóng)藥提取效果的影響 (n = 3)Table 2 Extraction efficiency of different extraction solvents on 53 pesticides (n = 3)

2.1.2 樣品凈化

2.1.2.1 吸附情況 本研究除對(duì)QuEChERS 方法常用凈化材料C18、PSA 和GCB 進(jìn)行考察外，還對(duì)超純硅膠、弗羅里硅土、硅藻土、酸性氧化鋁、堿性氧化鋁和EMR 等常見(jiàn)的固相萃取柱填料進(jìn)行了研究。GCB 雖然能夠強(qiáng)烈吸附色素類物質(zhì)，但它對(duì)非極性農(nóng)藥也有吸附作用，會(huì)降低大部分農(nóng)藥的回收率[27-28]。因此，本研究考察了備選凈化材料對(duì)待測(cè)目標(biāo)物的吸附情況。在2.1.1 節(jié)優(yōu)化的提取條件下，取6 mL 空白雞蛋樣品提取液于15 mL 離心管中，添加600 μL 的標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液1，渦旋、混勻；加入900 mg 無(wú)水硫酸鎂、150 mg 凈化劑 (每個(gè)處理3 個(gè)平行、1 個(gè)空白)，渦旋30 s 后于10 000 r/min、-4 ℃下離心5 min；取上清液，過(guò)0.22 μm 濾膜，待GC-MS/MS 檢測(cè)，空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。結(jié)果顯示：9 種凈化劑對(duì)目標(biāo)物的吸附性不強(qiáng)，目標(biāo)物的回收率均可達(dá)到要求 (表3)。

2.1.2.2 基質(zhì)效應(yīng) 本研究采用相對(duì)響應(yīng)值法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià) (基質(zhì)效應(yīng) = 空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值)，當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)小于1 時(shí)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，反之則為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[29]。對(duì)雞蛋進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)的結(jié)果顯示弗羅里硅土和硅藻土的凈化效果優(yōu)于其他7 種凈化劑。為了提高凈化效果，降低基質(zhì)效應(yīng)，本研究又考察了弗羅里硅土和硅藻土組合對(duì)目標(biāo)物的吸附情況及凈化效果，結(jié)果顯示目標(biāo)物的回收率均可達(dá)到要求 (表3)，其中凈化劑150 mg 弗羅里硅土 + 300 mg 硅藻土組合，43 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)在0.80～1.20 之間，凈化效果優(yōu)于其他組合 (表4)。為提高靈敏度，本研究取4.00 mL 凈化液，于40 ℃水浴氮吹至近干，用1.00 mL 乙酸乙酯復(fù)溶，過(guò)0.22 μm 濾膜，GC-MS/MS 檢測(cè)，空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示目標(biāo)物的回收率亦均可達(dá)到要求(表3)?；诖?，本研究?jī)艋椒ㄗ罱K選擇150 mg 弗羅里硅土 + 300 mg 硅藻土，并選用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方式來(lái)減弱基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表3 不同凈化劑對(duì)53 種農(nóng)藥回收率的影響Table 3 Recoveries of 53 pesticides with different clean up sorbents

表4 不同凈化劑對(duì)53 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)Table 4 Matrix effect of 53 pesticides with different cleanup sorbents

2.2 方法評(píng)價(jià)

2.2.1 線性范圍、檢出限及定量限 取基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1，在上述優(yōu)化的檢測(cè)條件下，經(jīng)GC-MS/MS 測(cè)定后，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (x)，質(zhì)譜定量離子的峰面積為縱坐標(biāo) (y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考GB/T 33 260.2—2018 計(jì)算目標(biāo)物的儀器檢出限[30]。結(jié)果 (表5) 表明，儀器檢出限(LOD) 在0.000 25～0.005 mg/L 之間。方法定量限(LOQ) 以最小添加濃度且可準(zhǔn)確定量的水平予以評(píng)價(jià)，則在0.000 5～0.01 mg/kg 之間。

確定了每個(gè)待測(cè)目標(biāo)物的定量限后，取基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2，在上述優(yōu)化的檢測(cè)條件下，經(jīng)GC-MS/MS 測(cè)定后，計(jì)算線性范圍，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果 (表5) 表明，目標(biāo)物的線性相關(guān)系數(shù)在0.996 7～1 之間，能夠滿足定量分析的基本要求[31]。

表5 53 種農(nóng)藥的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 5 Linear regression equation, r, LOD and LOQ of 53 pesticides

續(xù)表5Table 5 (Continued)

2.2.2 方法的添加回收準(zhǔn)確度與精密度 向雞蛋中添加適當(dāng)體積的53 種標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液2，添加水平均分別為L(zhǎng)OQ、2 LOQ 和10 LOQ。由表6可知，53 種化合物在雞蛋中的平均回收率在76%～104%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 在0.090%～14%之間 (n= 6)，表明方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性[31]。

表6 53 種農(nóng)藥在雞蛋中的平均添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n = 6)Table 6 Average recoveries and relative standard deviation of 53 pesticides in hen’s eggs (n = 6)

續(xù)表6Table 6 (Continued)

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

運(yùn)用本研究建立的檢測(cè)方法，對(duì)溫州市各縣市區(qū)銷售流通環(huán)節(jié)64 個(gè)點(diǎn)抽檢的101 個(gè)禽蛋樣品進(jìn)行分析 (每個(gè)樣品2 個(gè)重復(fù))，每個(gè)樣品抽取1.5 kg左右。結(jié)果表明：51 個(gè)雞蛋樣品累計(jì)檢出11 種農(nóng)藥，檢出率在2%～69%之間；36 個(gè)鴨蛋樣品累計(jì)檢出7 種農(nóng)藥，檢出率在3%～69 之間；6 個(gè)鴿子蛋、4 個(gè)鵪鶉蛋和4 個(gè)鵝蛋樣品均累計(jì)檢出毒死蜱、馬拉硫磷，檢出率在50%～100%之間。參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[32]，所有檢出農(nóng)藥均未超標(biāo)。實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7，檢出參數(shù)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖見(jiàn)圖2。

表7 實(shí)際市場(chǎng)抽檢樣品中53 種農(nóng)藥殘留檢測(cè)結(jié)果Table 7 Detection results of 53 pesticides in market samples

本研究中，1 個(gè)雞蛋樣品檢出氟蟲(chóng)腈的代謝物氟蟲(chóng)腈砜，不排除目前養(yǎng)殖場(chǎng)仍存在使用氟蟲(chóng)腈等殺蟲(chóng)效果較強(qiáng)、對(duì)人類危害較大農(nóng)藥的可能性；雖然毒死蜱、馬拉硫磷的檢出濃度較低，但整體檢出率較高，這可能與養(yǎng)殖場(chǎng)大量、普遍使用衛(wèi)生殺蟲(chóng)劑來(lái)維持場(chǎng)內(nèi)環(huán)境，或取食的植物性飼料中含有這些農(nóng)藥殘留有關(guān)[2]。因此建議加強(qiáng)動(dòng)物源性農(nóng)藥代謝物的檢測(cè)與研究，以便為食品安全管理作出正確的決策提供參考。

3 結(jié)論

本研究利用基質(zhì)分散固相萃取法結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了禽蛋中農(nóng)藥殘留多指標(biāo)同步定性、定量檢測(cè)的分析方法。本方法使用改良的QuEChERS 前處理技術(shù)，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，基質(zhì)匹配外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，53 種農(nóng)藥的儀器檢出限在0.000 25～0.005 mg/L 之間，方法定量限在0.000 5～0.01 mg/kg 之間，目標(biāo)物的線性相關(guān)系數(shù) (r) 在0.996 7～1 之間；在LOQ、2 LOQ 和10 LOQ 3 個(gè)添加水平下，53 種農(nóng)藥在雞蛋中的平均添加回收率在76%～104% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.090%～14%之間 (n= 6)。該方法準(zhǔn)確、快捷、靈敏，為我國(guó)禽蛋中農(nóng)藥殘留的高通量快速檢測(cè)以及食品安全提供了科學(xué)支持和技術(shù)保障，對(duì)于推進(jìn)政府監(jiān)管部門(mén)執(zhí)法、提高檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本等均具有一定的實(shí)際意義和社會(huì)效益，可應(yīng)用于禽蛋食品安全日常監(jiān)測(cè)。