宮磊，張志堅(jiān)，楊建課，高繼光，戚之琳

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002；2. 皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物化學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

腦腱黃瘤病(cerebrotendinous xanthomatosis，CTX)是一種常染色體隱性遺傳的脂質(zhì)代謝性疾病。90%以上的病例是由于CYP27A1基因突變導(dǎo)致編碼產(chǎn)物固醇27-羥化酶功能異常，繼而引起膽酸合成障礙而發(fā)病，臨床表現(xiàn)為多系統(tǒng)損害，如青少年白內(nèi)障、肌腱黃瘤、早發(fā)性動(dòng)脈硬化、進(jìn)行性神經(jīng)功能障礙等。通過(guò)基因檢測(cè)早期明確診斷并采用鵝去氧膽酸治療對(duì)于阻止或延緩病情發(fā)展具有重要的意義[1-3]。在對(duì)CYP27A1基因的檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)由于其編碼序列GC含量較高，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，很容易出現(xiàn)非特異性條帶，不利于后續(xù)對(duì)PCR產(chǎn)物的測(cè)序分析。為提高PCR反應(yīng)的特異性，我們采用了熱啟動(dòng)PCR，并在反應(yīng)體系中添加了去離子甲酰胺，以優(yōu)化CYP27A1基因檢測(cè)的方法，同時(shí)也為高GC比DNA片段的擴(kuò)增提供方法上的參考。

1 資料與方法

1.1血液標(biāo)本 健康人體外周血標(biāo)本1例，肝素鋰抗凝，-20℃冰柜凍存。

1.2研究方法

1.2.1主要儀器和試劑 Mastercycler Gradient PCR儀(Eppendorf公司)；血液基因組DNA提取試劑盒(Axygen公司)；去離子甲酰胺(上海生工生物工程公司)；熱啟動(dòng)Taq酶(Takara公司)；DL2000 DNA Marker(Takara公司)；dNTPs(Takara公司)；PCR清潔試劑盒(Axygen公司)。

1.2.2DNA提取 將全血室溫解凍后，使用血液基因組DNA提取試劑盒提取出基因組DNA。

1.2.3引物設(shè)計(jì)和合成 NCBI網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)4對(duì)引物分別擴(kuò)增CYP27A1基因4個(gè)片段，涵蓋CYP27A1基因全部外顯子以及外顯子內(nèi)含子接頭處。引物序列、位置以及擴(kuò)增片段的編號(hào)、大小、GC含量見表1。

表1 引物序列、位置以及擴(kuò)增片段的編號(hào)、大小、GC含量

1.2.4不同濃度去離子甲酰胺條件下采用熱啟動(dòng)PCR擴(kuò)增CYP27A1基因目標(biāo)片段 在反應(yīng)體系中不含去離子甲酰胺和去離子甲酰胺濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的情況下擴(kuò)增CYP27A1基因片段2；在不含去離子甲酰胺和去離子甲酰胺濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%的情況下擴(kuò)增CYP27A1基因片段1、3、4。PCR總反應(yīng)體積為50 μl，其中熱啟動(dòng)Taq酶1.25 U，MgCl21.5mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上游及下游引物各0.25 μmol/L。PCR循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s ，72℃延伸1 min 30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。對(duì)PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5去離子甲酰胺對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響的分析 采用Image J 軟件分別測(cè)量不同去離子甲酰胺濃度條件下擴(kuò)增出的4條目標(biāo)帶的光強(qiáng)度值。然后采用SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較不同濃度下目標(biāo)帶的光強(qiáng)度值差異。

1.2.6測(cè)序分析 挑選4個(gè)目標(biāo)帶的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)PCR清潔試劑盒純化后進(jìn)行測(cè)序分析。

2 結(jié)果

2.1不同濃度去離子甲酰胺條件下CYP27A1基因的擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1片段2的擴(kuò)增結(jié)果 在反應(yīng)體系中不含去離子甲酰胺和去離子甲酰胺濃度為1%～8%時(shí)，均擴(kuò)增出目標(biāo)帶，但濃度為7%和8%時(shí)，目標(biāo)帶明顯減弱。濃度為9%和10%時(shí)，未擴(kuò)增出目標(biāo)帶。在反應(yīng)體系中不含去離子甲酰胺和去離子甲酰胺濃度為1%～3%時(shí)可見非特異性條帶，濃度為4%～8%時(shí)，未見非特異性帶。

2.1.2片段1、3、4的擴(kuò)增結(jié)果 在反應(yīng)體系中不含去離子甲酰胺和去離子甲酰胺濃度為1%～6%時(shí)，均擴(kuò)增出目標(biāo)帶；在反應(yīng)體系不含去離子甲酰胺時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物均存在非特異性帶，當(dāng)去離子甲酰胺濃度為3%～6%時(shí)，均未見非特異性條帶，見圖1。

注：圖A：片段1的擴(kuò)增結(jié)果；圖B：片段2的擴(kuò)增結(jié)果；圖C：片段3的擴(kuò)增結(jié)果；圖D：片段4的擴(kuò)增結(jié)果； M為DL2000 DNA Marker；圖A、B、C、D中第1至第7泳道對(duì)應(yīng)的去離子甲酰胺濃度均依次為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%。

2.2不同去離子甲酰胺濃度條件下擴(kuò)增產(chǎn)物中目標(biāo)帶光強(qiáng)度值的比較結(jié)果 經(jīng)單因素分差分析，去離子甲酰胺濃度在0、1%、2%、3%、4%、5%、6%條件下擴(kuò)增出的目標(biāo)帶光強(qiáng)度值無(wú)明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 不同去離子甲酰胺濃度下擴(kuò)增CYP27A1基因目標(biāo)帶的光強(qiáng)度值比較

2.3DNA測(cè)序結(jié)果CYP27A1基因4個(gè)目標(biāo)帶的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析和NCBI 網(wǎng)站BLAST 比對(duì)驗(yàn)證為目標(biāo)序列，見圖2。

注：圖A：片段1的測(cè)序結(jié)果；圖B：片段2的的測(cè)序結(jié)果；圖C：片段3的的測(cè)序結(jié)果；圖D：片段4的的測(cè)序結(jié)果。

3 討論

采用PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因然后進(jìn)行測(cè)序分析是基因檢測(cè)或診斷中常用的一種簡(jiǎn)便而經(jīng)濟(jì)的方法。在使用PCR擴(kuò)增高GC含量的DNA片段時(shí)，可能因?yàn)橥嘶饡r(shí)模板易形成鏈內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)而出現(xiàn)產(chǎn)量低、特異性低的問(wèn)題[4-6]。由于甲酰胺能夠減弱核苷酸之間的氫鍵，消除局部的二級(jí)結(jié)構(gòu)，Sarkar G等[4]在擴(kuò)增GC含量為55%的DRD2基因片段時(shí)，為了提高特異性，最先在PCR反應(yīng)體系中加入甲酰胺，使其終濃度分別為1.25%、2.5%、5%、10%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酰胺濃度為5%時(shí)不僅提高了擴(kuò)增的效率，而且完全消除了非特異性帶，而當(dāng)甲酰胺濃度為10%時(shí)，未擴(kuò)增出目標(biāo)片段。之后相繼有學(xué)者報(bào)道一定濃度的甲酰胺可以提高高GC比片段擴(kuò)增的效率和特異性，但不同研究結(jié)果所顯示的甲酰胺在PCR反應(yīng)體系中的最佳使用濃度存在差異，有3%、4%和5%[6-8]。Strien J等[9]在分別使用HotStarTaq 聚合酶、 DAp GoldStar○RDNA聚合酶、OneTaq○RDNA聚合酶并添加甲酰胺的情況下擴(kuò)增 GC比分別為56%和82%片段時(shí)，未獲得成功，因而不建議甲酰胺作為PCR添加劑時(shí)與這些酶聯(lián)用。本研究在擴(kuò)增CYP27A1基因4個(gè)高GC含量的片段時(shí)，為了提高PCR反應(yīng)的特異性，在Mg2+濃度為1.5 mmol/L的情況下，首先采用了熱啟動(dòng)PCR方法，結(jié)果均擴(kuò)增出目標(biāo)帶，但4個(gè)目標(biāo)帶的擴(kuò)增均見非特異性條帶。為進(jìn)一步提高反應(yīng)的特異性，我們向反應(yīng)體系中添加了不同濃度的去離子甲酰胺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的特異性明顯增強(qiáng)，當(dāng)去離子甲酰胺的終濃度為4%、5%和6%時(shí)，4個(gè)片段的擴(kuò)增均完全消除了非特異性帶。為進(jìn)一步了解去離子甲酰胺的濃度是否會(huì)影響目標(biāo)帶的擴(kuò)增效率，我們采用了Image J軟件測(cè)量反應(yīng)體系中不含去離子甲酰胺以及去離子甲酰胺濃度為1%、2%、3%、4%、5%、6% 7種情況下4個(gè)目標(biāo)條帶的光強(qiáng)度值，比較不同濃度下目標(biāo)帶的光強(qiáng)度值差異，結(jié)果顯示無(wú)明顯差異，提示去離子甲酰胺濃度在6%及以下時(shí)，對(duì)熱啟動(dòng)PCR的擴(kuò)增效率無(wú)影響。而當(dāng)我們將去離子甲酰胺的濃度增加至7%或8%來(lái)擴(kuò)增CYP27A1基因片段2時(shí)，目標(biāo)帶明顯減弱；增至9%或10%時(shí)，PCR反應(yīng)完全被抑制，這一結(jié)果與Sarkar G等[4]在10%的甲酰胺濃度下未擴(kuò)增出目標(biāo)帶以及Kovárová M等[7]報(bào)道的2M(相當(dāng)于8%)的甲酰胺可導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率下降90%相似。綜合CYP27A1基因4個(gè)片段的擴(kuò)增結(jié)果及已有的報(bào)道，我們認(rèn)為采用熱啟動(dòng)PCR，同時(shí)向反應(yīng)體系中添加去離子甲酰胺能有效擴(kuò)增出高GC含量的DNA片段，同時(shí)避免非特異性帶的產(chǎn)生，但反應(yīng)體系中去離子甲酰胺的濃度宜控制在4%～6%。這一方法不僅適用于腦腱黃瘤病的致病基因—CYP27A1基因的檢測(cè)，也可用于其他富含GC的基因的檢測(cè)。