◆作者：侯楠楠 謝全喜 王 梅 王 倩 鹿曉慧 周 紅 谷 巍

◆單位：山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

苯乳酸也稱(chēng)3-苯乳酸或β-苯乳酸，是一種安全無(wú)毒新型天然廣譜生物防腐劑，其分子式為C9H10O3，相對(duì)分子質(zhì)量為166（Alistair L Wilkins，2015）。研究發(fā)現(xiàn)，苯乳酸能夠抑制多種細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，具有較好的溶解性和穩(wěn)定性，可用作食源性防腐劑。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)的干酪在成熟過(guò)程中產(chǎn)生苯乳酸對(duì)食源致病菌具有很強(qiáng)的抑制作用（Dieuleveux V，1998）；同時(shí)研究學(xué)者進(jìn)一步確定苯乳酸的廣譜抑菌效果（Lavermicocca P，2000）。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，苯乳酸是丹參的一種衍生物，可應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，抑制溶血空斑的形成，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力等（李艷杰，2012）。因此苯乳酸無(wú)論是在生物防腐還是醫(yī)藥領(lǐng)域都有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。目前合成方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法。其中化學(xué)合成存在許多不足，比如技術(shù)條件復(fù)雜、反應(yīng)條件嚴(yán)苛、環(huán)境污染比較大等；生物合成苯乳酸是一種新方法，具有環(huán)境友好，副產(chǎn)物少的特點(diǎn)（鄧林，2014）。研究發(fā)現(xiàn)許多微生物發(fā)酵都可以產(chǎn)生苯乳酸（李興峰，2011；Shuhuai，2014）。

單純依靠菌株自身產(chǎn)苯乳酸，能力有限，通過(guò)誘變菌株、改良培養(yǎng)基或是添加底物的方法可以提高苯乳酸的產(chǎn)量。添加底物主要有苯丙氨酸和苯丙酮酸，李興峰等（2011）研究發(fā)現(xiàn)：在乳酸菌利用苯丙氨酸合成苯乳酸的過(guò)程中，轉(zhuǎn)氨反應(yīng)是限速步驟，成為苯乳酸產(chǎn)生的瓶頸，可以采用苯丙酮酸代替苯丙氨酸作為底物合成苯乳酸，因此苯丙酮酸作為底物來(lái)提高苯乳酸的產(chǎn)量成為研究熱點(diǎn)。但如何同時(shí)評(píng)價(jià)發(fā)酵制品中苯乳酸及苯丙酮酸的含量成為研究的難題。因此，開(kāi)發(fā)一種快速分離檢測(cè)苯乳酸與苯丙酮酸的檢測(cè)方法是必不可少的。國(guó)內(nèi)外對(duì)苯乳酸及苯丙氨酸的分析方法，主要還是薄層層析、氣相色譜、液相色譜等，但同時(shí)對(duì)兩種成分進(jìn)行檢測(cè)分析的方法在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)液相檢測(cè)條件的摸索優(yōu)化，成功開(kāi)發(fā)出一種能夠同時(shí)檢測(cè)分析苯乳酸與苯丙酮酸的檢測(cè)方法，在提高靈敏度及分離度的前提下，減少了分析時(shí)間，節(jié)省溶劑用量，節(jié)約成本。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

三氟乙酸和甲醇（均為色譜級(jí)）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，純度≥99.5%）、DL-3苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，純度≥98%）：美國(guó)Sigma公司。

微孔濾膜（直徑13 mm、孔徑0.22μm），LC-20A液相色譜儀，InertSustain AQ-C18 5μm 4.6×250mm（W）色譜柱，AL204電子分析天平，GL21M高速冷凍離心機(jī)，超純水凈化系統(tǒng)（超純水儀）CLDC271509，雷磁精密酸堿度計(jì)PHS-3C，超聲波清洗機(jī)SB120D。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥品及試劑配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取DL-3苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品0.2058 g（實(shí)含苯乳酸0.2048 g）、苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品0.2143 g（實(shí)含苯丙酮酸0.21 g），用超純水溶解后定容至100 mL，配制成2.048 g/L的苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和2.100 g/L的苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后從中分別 吸 取0.625 mL、1.25 mL、2.5mL和5.0 mL用超純水定容至10.0 mL，各組質(zhì)量濃度如表1。流動(dòng)相A（0.05%三氟乙酸水溶液）：0.5 mL三氟乙酸加水定容至1 L；流動(dòng)相B（0.05%三氟乙酸甲醇溶液）：0.5 mL三氟乙酸加甲醇定容至1 L。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度組成 單位：g/L

1.2.2 色譜條件

HPLC法測(cè)定苯乳酸/苯丙酮酸含量，色譜條件為色譜柱：InertSustain AQ-C18 5μm 4.6×250mm（W），柱溫箱：30℃，進(jìn)樣量：20μL，流速：1.0 mL/min。流動(dòng)相A：0.05%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B：0.05%三氟乙酸甲醇溶液；梯度洗脫條件：0-15min流動(dòng)相B的比例由40%升至80%，15-16min流動(dòng)相B的比例保持80%，16-18min流動(dòng)相B的比例由80%降至40%，洗脫完成。檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.2.3 樣品的制備與提純

乳酸菌發(fā)酵液制備：將超低溫冰箱（-80℃）保存的乳酸菌菌株 BLCC2-0011、BLCC2-0021、BLCC2-0024、BLCC2-0026、BLCC2-0038、BLCC2-0069、BLCC2-0323、BLCC2-0327 和BLCC2-0410凍干粉分別接種于MRS固體斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)好的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)挑取一環(huán)接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，經(jīng)10000r/min，離心5min，取發(fā)酵上清液經(jīng)0.22μm濾膜兩次過(guò)濾后，作為待測(cè)樣品，采用高效液相色譜法測(cè)定苯乳酸/苯丙酮酸含量。

固體樣品：使用乳酸菌菌株BLCC2-0021發(fā)酵液2%添加，苯丙酮酸0.15%添加，發(fā)酵豆粕（料水比100∶45），37℃發(fā)酵3天，準(zhǔn)確稱(chēng)取5.000 g發(fā)酵料樣品加入加無(wú)水甲醇10 mL，將樣品混合均勻后4℃靜止4 h，超聲提取30 min，混勻后經(jīng)4000 r/min離心5 min，取上清至20 mL刻度試管，再加無(wú)水甲醇10 mL，混勻后經(jīng)4000 r/min離心5 min，取上清至20 mL刻度試管，定容至20 mL。取定容好的上清液10000 r/min，離心5 min取上清，經(jīng)0.22μm濾膜兩次過(guò)濾后作為待測(cè)樣品，采用高效液相色譜法測(cè)定苯乳酸/苯丙酮酸含量。

1.2.4 定性與定量分析

定性分析：利用上述色譜條件分別檢測(cè)苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液、苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液、處理完的樣品溶液，確定樣品中是否含有苯乳酸或苯丙氨酸。

定量分析：將上述1.2.1中配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液利用上述色譜條件分別進(jìn)樣分析，以峰面積和濃度作圖，得到苯乳酸或苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程，根據(jù)峰面積帶入公式自動(dòng)計(jì)算樣品中各組分的含量。

1.2.5 樣品回收率測(cè)定

通過(guò)在同一發(fā)酵液中加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品混合液，測(cè)定該方法的回收率（張建玲，2020）。

1.2.6 樣品精密度測(cè)定

通過(guò)對(duì)同一發(fā)酵料重復(fù)檢測(cè)5次，測(cè)定該方法的精密度。

2 結(jié)果與分析

表2 不同菌株發(fā)酵24 h苯乳酸、苯丙酮酸產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)

2.1 色譜分離

按1.2.2所述色譜條件，將苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)液、苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液和混合標(biāo)準(zhǔn)液分別多次進(jìn)樣分析，確定樣品保留時(shí)間，苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖（圖1，苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度2.048 g/L），可以看出，在10.709 min左右出現(xiàn)苯乳酸色譜峰，且穩(wěn)定性良好、分離效果好、峰型理想、靈敏度高；苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖（圖2）可以看出，在10.034 min左右出現(xiàn)苯丙酮酸色譜峰，且穩(wěn)定性良好、分離效果好、峰型理想；苯乳酸和苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)的HPLC色譜圖（圖3）可以看出，在10.034 min左右出現(xiàn)苯丙酮酸色譜峰，在10.709 min左右出現(xiàn)苯乳酸色譜峰，分離效果好，峰型理想。

圖1 苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖3 苯乳酸和苯丙酮酸混標(biāo)色譜圖

國(guó)內(nèi)外有關(guān)苯乳酸檢測(cè)的報(bào)道比較多（黃國(guó)昌，2016；朱育菁，2015；寧亞維，2021），本實(shí)驗(yàn)采用日本島津公司LC-20A紫外檢測(cè)器，在激發(fā)波長(zhǎng)210、254、340 nm分別檢測(cè)同一樣品，發(fā)現(xiàn)210 nm條件下檢測(cè)干擾少、雜峰少，檢測(cè)效果最佳，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。流動(dòng)相的優(yōu)化，流動(dòng)相A：0.05%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B：0.05%三氟乙酸甲醇溶液，少量的三氟乙酸可以與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用，起到改善峰形、克服峰展寬和拖尾問(wèn)題；梯度洗脫流動(dòng)相A和B比例的調(diào)整，初始流動(dòng)相B的比例從20%調(diào)整到40%時(shí)，可以有效避免目標(biāo)峰的重疊，將苯乳酸與丙苯酮酸分離開(kāi)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以苯乳酸/苯丙氨酸的色譜峰面積（A）對(duì)應(yīng)進(jìn)樣的質(zhì)量濃度（C，g/L）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖4、圖5。苯乳酸的線(xiàn)性回歸方程為C=0.00000002151A-0.1092（R2=0.9955），苯丙酮酸的線(xiàn)性回歸方程為

圖4 苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖5 -苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3 定性與定量分析

發(fā)酵液中苯乳酸及苯丙酮酸的檢測(cè)如圖3所示，目標(biāo)峰與其他峰分離效果較好，利用該方法可以有效分析發(fā)酵液中苯乳酸及苯丙酮酸。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告多數(shù)乳酸菌可以產(chǎn)生苯乳酸，本實(shí)驗(yàn)中共檢測(cè)了10株乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸的含量，發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸的產(chǎn)量在0.1～1.1 g/L不等。這一結(jié)果與張?chǎng)┑戎把芯堪l(fā)現(xiàn)酸奶、泡菜等乳酸菌發(fā)酵食品中檢測(cè)出苯乳酸的結(jié)果不謀而合，歸結(jié)起來(lái)應(yīng)該是乳酸菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生苯乳酸（張?chǎng)?020；吳仁蔚，2020）。

關(guān)于液體樣品的提取，試驗(yàn)中還分別對(duì)比了4000 r/min和10000 r/min離心同一樣品的色譜圖，發(fā)現(xiàn)10000 r/min離心過(guò)的樣品雜峰更少，因此選擇液體樣品10000 r/min離心的處理方式。關(guān)于固體樣品苯乳酸檢測(cè)的前處理方法有很多（鄧林，2014），因?yàn)楸饺樗嵛⑷苡谒崛∪軇┮话氵x擇甲醇，比較了甲醇溶解直接檢測(cè)和甲醇溶解后4℃靜止4 h，超聲30 min的效果，發(fā)現(xiàn)后者苯乳酸提取率相對(duì)更高。

2.4 回收率與精密度

上述發(fā)酵液加標(biāo)后，分別統(tǒng)計(jì)苯乳酸及苯丙酮酸的含量，計(jì)算苯乳酸/苯丙酮酸的加標(biāo)回收率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。

表3 BLLC2-0021發(fā)酵液加標(biāo)后檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

將上述發(fā)酵料重復(fù)5次進(jìn)樣，檢測(cè)每次發(fā)酵料中苯乳酸和苯丙酮酸的含量，檢測(cè)結(jié)果表4所示。結(jié)果表明，苯乳酸的回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是100.79%、2.62%；苯丙酮酸的回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是99.12%、0.86%；該方法可靠，重復(fù)性好，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

表4 BLLC2-0021發(fā)酵料重復(fù)進(jìn)樣結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論

本研究通過(guò)使用甲醇提取發(fā)酵制品中苯乳酸及苯丙酮酸，建立了一種同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵液及發(fā)酵制品中苯乳酸和苯丙酮酸的檢測(cè)方法，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，該方法更加簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、且分離效果比較好，10.709 min左右出現(xiàn)苯乳酸色譜峰，10.034 min左右出現(xiàn)苯丙酮酸色譜峰。本研究建立起來(lái)的方法可以滿(mǎn)足發(fā)酵工藝中防腐物質(zhì)苯乳酸的檢測(cè)，以及工藝升級(jí)苯丙酮酸殘余量的檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：（略）