李幸樂，盧世棟，馬紅霞，李 懿,葉 瑩,黃學(xué)勇，郭萬申

1)河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 鄭州 450016 2)河南省傳染病病原生物重點實驗室 鄭州 450016

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)是由新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)引起的，以發(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn)的呼吸道傳染病。與其他病毒性肺炎相比，COVID-19的早期臨床表現(xiàn)不具有特異性，隨著疾病的進展，患者可出現(xiàn)繼發(fā)感染，臨床表現(xiàn)更加復(fù)雜，對其他疾病的診療也有多方面的影響[1-5]。因此，在疾病的各個階段，實驗室診斷和鑒別診斷對于2019-nCoV感染的預(yù)防、控制和治療具有非常重要的指導(dǎo)意義。本研究以一例COVID-19合并Ⅰ型單純皰疹病毒(human herpesivirus Ⅰ,HSV-1)感染為例，通過實驗室技術(shù)手段分析COVID-19感染的可能特征，以期為2019-nCoV的防控和臨床治療提供數(shù)據(jù)支持和技術(shù)支持。

1 對象與方法

1.1 調(diào)查對象選取河南省2020年1月1日至1月31日期間的COVID-19確診病例12例作為研究對象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病前14 d內(nèi)有武漢旅行史或居住史。②有發(fā)熱和(或)呼吸道癥狀。③實時熒光定量PCR檢測2019-nCoV核酸陽性。排除免疫缺陷性疾病患者。

1.2 病毒分離取2019-nCoV核酸陽性咽拭子樣本進行細(xì)胞接種，采用Vero和Vero E6細(xì)胞系常規(guī)分離病毒，接種后逐日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)。發(fā)生細(xì)胞病變者穩(wěn)定傳代；無細(xì)胞病變者盲傳3代，3代均無細(xì)胞病變者按照陰性處理。

1.3 2019-nCoV核酸檢測采用實時熒光定量PCR法對分離株病毒二代培養(yǎng)物進行2019-nCoV核酸檢測。病毒分離株首先于56 ℃30 min滅活，然后采用西安天隆生物科技有限公司生產(chǎn)的病毒DNA/RNA提取試劑盒提取總RNA，用上海伯杰醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的2019-nCoV核酸檢測試劑盒進行鑒定，儀器為美國ABI公司生產(chǎn)的7500Fast實時熒光定量PCR儀，按照試劑盒和儀器使用說明操作。

1.4 基因組序列測定分析采用北京微未來科技有限公司生產(chǎn)的2019-nCoV全基因組捕獲試劑盒對毒株進行全基因組DNA建庫，非2019-nCoV毒株采用杭州杰毅生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的全自動核酸檢測反應(yīng)體系構(gòu)建系統(tǒng)進行宏基因組DNA建庫，采用美國Illumina公司的MiSeq測序平臺進行序列測定，采用北京微未來科技有限公司的nCoV和MicroSpectrum病原體鑒定分析軟件分析測序結(jié)果。均按照試劑盒和儀器使用說明操作。

1.5 生物安全控制COVID-19病例樣本的采集和實驗活動嚴(yán)格遵守相關(guān)的生物安全規(guī)定：采樣人員在采樣過程中采取個人生物安全三級防護；病毒分離培養(yǎng)和病毒滅活在BSL-3級實驗室進行。

2 結(jié)果

2.1 病例基本情況和病毒分離結(jié)果12例12份咽拭子樣本中分離得到5株病毒。5株病毒在Vero和Vero E6細(xì)胞上均產(chǎn)生典型病變且病變可以穩(wěn)定傳代；病變均表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、聚集和脫落。5株病毒命名為HN01～HN05。HN03株培養(yǎng)物在傳代過程中觀察到支原體感染現(xiàn)象。

HN03株來源病例衛(wèi)某，男，27歲，河南洛陽人，發(fā)病前為武漢市某農(nóng)貿(mào)市場冷庫管理員； 2020年1月13日出現(xiàn)發(fā)熱、干咳癥狀；19日出現(xiàn)高熱(40 ℃)、呼吸困難、胸悶、乏力和氣促癥狀并入住河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院；21日采集咽拭子樣本(原始樣本)進行2019-nCoV核酸檢測，呈陽性。臨床分型為普通型。

2.2 2019-nCoV核酸檢測HN03株表現(xiàn)為弱陽性。分別對HN03株一代、二代和三代培養(yǎng)物進行2019-nCoV核酸檢測，無論是Vero還是Vero E6細(xì)胞，Ct值均隨培養(yǎng)代次的增加而升高，第三代培養(yǎng)物表現(xiàn)為陰性。余4株各代培養(yǎng)物均為陽性。

2.3 基因組序列測定分析經(jīng)MiSeq測序，HN01株、HN02株、HN04株和HN05株獲得2019-nCoV全基因組序列。GenBank序列號依次為MT412338、MT412134、MT412339和MT412340；HN03株獲得部分2019-nCoV基因序列。對HN03株三代培養(yǎng)物的分析結(jié)果顯示無2019-nCoV基因序列。MicroSpectrum病原體鑒定分析軟件比對了116種病原體，HN03株三代培養(yǎng)物中可檢出10種病原體，其中HSV-1占絕對優(yōu)勢，此外豬鼻支原體占據(jù)相當(dāng)?shù)谋壤?，詳見圖1。

圖1 COVID-19病例分離毒株HN03株宏基因測序比對分析圖

3 討論

人類HSV感染極為普遍，且初次感染后多轉(zhuǎn)為潛伏感染。HSV-1是臨床常見的免疫抑制性感染性病原。當(dāng)機體受其他細(xì)菌、病毒感染或者細(xì)胞免疫受抑制時，HSV-1可被激活。HSV-1感染通常表現(xiàn)為口唇、皮膚和角膜等機體淺表層皰疹或炎癥，此外HSV-1感染還可引起腦炎、脊髓炎和神經(jīng)根炎。2019-nCoV可侵犯全身多組織、器官，感染者以肺和免疫系統(tǒng)損害為主。因此，2019-nCoV和HSV-1合并感染是可能存在的，HSV-1感染更可能是繼發(fā)于2019-nCoV感染。

人類對2019-nCoV普遍易感，且感染者以輕型為主，如果缺乏明確的流行病學(xué)史，從臨床表現(xiàn)方面難以區(qū)分COVID-19與其他病毒性肺炎，必須借助實驗室技術(shù)手段[6]。另外，COVID-19重癥和危重癥患者通常合并有細(xì)菌和真菌感染[7]，掌握COVID-19重癥、危重癥患者繼發(fā)感染的特征，對臨床治療具有積極意義。如何系統(tǒng)、科學(xué)地運用實驗室技術(shù)手段實現(xiàn)早期快速診斷的目的，需要根據(jù)情況合理安排。本例首先以實時熒光定量PCR進行早期快速診斷，隨后采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離病毒株，采用基因組序列測定分析技術(shù)對病毒株進行鑒定，證實HN03株源病例為2019-nCoV合并HSV-1感染病例。熒光定量PCR方法迅速、靈敏，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可獲得具有生物活性的病毒株，宏基因組序列測定分析技術(shù)可同時鎖定多種病原。

支原體是可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小原核細(xì)胞型微生物。支原體廣泛存在于人體和動物體內(nèi)。豬鼻支原體既是豬鼻腔的正常寄居微生物，也是細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染微生物。本研究在細(xì)胞培養(yǎng)階段在HN03株培養(yǎng)物內(nèi)觀察到支原體感染現(xiàn)象，其他樣本沒有這種現(xiàn)象，提示豬鼻支原體并非來自培養(yǎng)過程中的污染，應(yīng)該來自源病例樣本。有研究[8]顯示豬鼻支原體與多種人類惡性腫瘤有顯著相關(guān)性，暫未發(fā)現(xiàn)豬鼻支原體導(dǎo)致肺炎的病例。流行病學(xué)調(diào)查顯示豬鼻支原體感染可能發(fā)生在病例于農(nóng)貿(mào)市場從事冷庫管理工作期間，與2019-nCoV感染無關(guān)。