饒玉梅，張微微，張 穎，趙 倩，李留霞，郭瑞霞

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052

卵巢癌病死率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首[1]。 卵巢癌確診時往往期別較晚，預(yù)后差，5 a生存率約為47%[2]。因此，研究卵巢癌的發(fā)病機制，能為該疾病的診治提供理論和實踐依據(jù)，具有重要意義。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中，獲取漿液性卵巢癌與正常卵巢組織基因芯片數(shù)據(jù)，經(jīng)過分析獲得二者間差異表達基因(differentially expressed gene,DEG)，通過對DEG進一步分析，得到與卵巢癌患者生存期相關(guān)的關(guān)鍵基因，有助于我們更好地探索卵巢癌發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)提取從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中篩選下載數(shù)據(jù)集GSE54388、GSE105437，數(shù)據(jù)集分析平臺均為GPL(gene platform)570。GSE54388包含16例漿液性卵巢癌和6例正常卵巢組織，GSE105437包含10例高級別漿液性卵巢癌和 5例正常卵巢組織。

1.2 DEG篩選利用GEO分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)分別篩選出兩個數(shù)據(jù)集中兩組之間的DEG。篩選標準為校正后P<0.05，|lgFC|>1。下載所得原始DEG數(shù)據(jù)，去除沒有對應(yīng)基因符號的探針組或同一基因?qū)?yīng)多個探針等情況。然后應(yīng)用Venn軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)分析并作圖，得出交集。

1.3 GO和KEGG富集分析用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(http://david.ncifcrf.gov/)對篩選出的DEG進行功能富集，主要包括GO和KEGG富集分析。設(shè)P<0.05為富集差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)及模塊分析用String 11.0數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)構(gòu)建DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)。利用String檢索DEG中的交互基因。然后用Cytoscape 3.7.1軟件中的MCODE 1.5.1對篩選基因進行重塑，構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模塊[3]。

1.5 關(guān)鍵基因篩選分析應(yīng)用Kaplan Meier plotter(http://kmplot.com/analysis)網(wǎng)站分析關(guān)鍵基因，進一步篩選出在卵巢癌組織中表達與總生存率有關(guān)的關(guān)鍵基因(P<0.05)。再利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn)分析所獲得的關(guān)鍵基因，再一次篩選出表達異常的基因(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 DEG的篩選從GSE105437、GSE54388兩個數(shù)據(jù)集分別得到1 959個(上調(diào)1 399個、下調(diào)560個)、3 147個(上調(diào)1 881個、下調(diào)1 266個)DEG。Venn軟件對二者取交集獲得322個DEG，包括174個上調(diào)和 148個下調(diào)基因(圖1)。

左：上調(diào)基因；右：下調(diào)基因

2.2 GO和KEGG富集分析結(jié)果對322個DEG進行GO和KEGG富集分析。GO分析結(jié)果見表1，表內(nèi)基因數(shù)為對應(yīng)GO的DEG數(shù)目，結(jié)果分為生物學(xué)過程、細胞組分和分子功能3個方面。DEG的生物學(xué)過程：上調(diào)基因主要集中在染色體分離、血管平滑肌發(fā)育、上皮細胞分化等方面(僅列出前3位)；下調(diào)基因主要集中在平滑肌細胞增殖負調(diào)節(jié)、蛋白分泌正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄負調(diào)控等方面。細胞組分：上調(diào)基因主要集中在染色體、膜結(jié)合細胞器、膜封閉管腔等部位；下調(diào)基因主要集中在Z盤、膜的外部成分、高爾基管腔等部位。分子功能：上調(diào)基因涉及蛋白質(zhì)結(jié)合；下調(diào)基因涉及氧化還原酶活性、核酸結(jié)合、肌動蛋白絲結(jié)合等方面。KEGG富集分析結(jié)果見表2：上調(diào)基因富集于細胞周期、癌癥通路、ECM作用受體3條信號通路；下調(diào)基因富集于干細胞多能性的信號通路調(diào)節(jié)、酪氨酸代謝、癌癥蛋白多糖等信號通路。

表1 卵巢癌DEG的GO分析結(jié)果

表2 卵巢癌DEG的KEGG富集分析結(jié)果

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因選擇的結(jié)果對322個DEG分析后制作的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。對篩選的關(guān)鍵基因進行網(wǎng)絡(luò)模塊構(gòu)建，得到MCM10、 MCM4、GINS2、BRCA1、FANCD2、TOP2A、KIF4A、MKI67、ESPL1、CDCA3、NEK2、KPNA2、ASF1B、ESCO2 14個關(guān)鍵基因，均為上調(diào)基因(圖3)。

紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因

圖3 關(guān)鍵基因的模塊圖

2.4 關(guān)鍵基因分析結(jié)果用Kaplan Meier plotter網(wǎng)站分析14個關(guān)鍵基因表達與卵巢癌患者總生存率之間關(guān)系，其中MCM10、FANCD2、TOP2A、ESPL1、CDCA3、NEK2、ESCO2等7個基因高表達及BRCA1低表達與患者總生存率不良有關(guān)(圖4)。用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析這8個關(guān)鍵基因在卵巢癌和正常卵巢組織中表達情況,結(jié)果顯示卵巢癌組織中MCM10、TOP2A、ESPL1、CDCA3、NEK2、ESCO2等6個基因的表達水平高于正常卵巢組織中的表達水平(圖5)。

圖4 卵巢癌組織中8個關(guān)鍵基因表達水平與患者總生存曲線關(guān)系

圖5 6個關(guān)鍵基因在卵巢癌與正常卵巢組織中的表達情況

3 討論

我國每年死于卵巢癌的女性約為2.5萬，而且呈上升趨勢[4]。漿液性卵巢癌早期診斷困難，患者就診時往往已發(fā)生盆腹腔廣泛轉(zhuǎn)移[5]。因此，尋找能早期診斷、預(yù)后預(yù)測、靶向治療的分子靶標，成為目前分子腫瘤學(xué)研究重點之一。為此，本研究提取GSE105437、GSE54388兩個數(shù)據(jù)集中卵巢癌和正常卵巢組織資料，運用生物信息學(xué)分析方法，最終獲取了MCM10、TOP2A、ESPL1、CDCA3、NEK2、ESCO2等6個關(guān)鍵基因。

MCM10高表達與前列腺癌[6]、乳腺癌[7]等腫瘤預(yù)后不良或惡性行為有關(guān)。MCM10在染色體復(fù)制的S期使DNA松解，其核心序列含有進化保守的結(jié)構(gòu)域，由寡核苷酸-糖和相鄰的鋅指結(jié)構(gòu)組成。其異常表達致腫瘤患者預(yù)后不良機制未明。ESCO2對細胞染色體凝聚及基因組穩(wěn)定性有重要作用，其在腎細胞癌[8]、乳腺癌[9]組織或細胞中高表達。ESCO2表達失調(diào)能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2表達，從而影響結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移[10]。在胃癌細胞中抑制ESCO2的表達，能通過影響AMPK信號通路而抑制腫瘤細胞的增殖并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[11]。而CDCA3高表達與結(jié)腸癌預(yù)后不良有關(guān)，在結(jié)腸癌細胞SW480中降低CDCA3表達，能影響P21通路使腫瘤細胞阻滯在G1/S期，導(dǎo)致細胞增殖受抑[12]。同樣在胃癌組織中CDCA3高表達也促進腫瘤惡性行為[13]。ESPL1編碼一種分離酶，在細胞有絲分裂過程中切割染色體，其高表達不僅使乳腺癌細胞容易受到因染色體錯聚，而致染色體非整倍體出現(xiàn)，而且還使細胞容易受到其他不穩(wěn)定性遺傳因素的影響，包括DNA損傷和關(guān)鍵抑癌基因位點的丟失。這些變化疊加起來，能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展[14]。MCM10、ESPL1、CDCA3、ESCO2在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中有重要作用，但其在卵巢癌中的研究鮮有報道。我們的研究顯示這4種基因在卵巢癌組織中都是高表達，且高表達的患者生存期縮短。

有研究顯示：NEK2在卵巢癌組織中高表達[15]，且與卵巢癌的紫杉醇耐藥有關(guān)[16]。抑制卵巢癌細胞中NEK2表達，能抑制腫瘤細胞的侵襲和增殖[17]。TOP2A在細胞有絲分裂中集聚于染色質(zhì)，作用于著絲點，在DNA穩(wěn)定性中發(fā)揮作用。它也是化療藥蒽環(huán)類和依托泊苷類藥物的作用靶點之一[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)TOP2A在漿液性卵巢癌組織中表達上調(diào)，并通過TGF-β/Smad途徑加速卵巢癌進展。復(fù)發(fā)性上皮性卵巢癌組織中TOP2A表達升高，患者對脂質(zhì)體阿霉素的敏感性更高[20]。表明TOP2A在預(yù)測卵巢癌患者對脂質(zhì)體阿霉素敏感性方面有良好的價值。

總之，雖然本研究發(fā)現(xiàn)了一些有意義的結(jié)果，但也有一些局限性。比如缺乏實驗驗證，以及這6個基因如何影響卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，尚需進一步研究。