繆鵬飚，徐 倩，賈西云，王夢(mèng)丹，傅聿銘，巴 楠，張自森

1)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院普通外科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 鄭州 450052

胃癌居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率第2位并呈上升趨勢(shì)[1]，其治療方法主要包括手術(shù)治療、化療及靶向治療，但由于胃癌早期診斷率低，多數(shù)患者診斷時(shí)已屬中晚期[2]，其整體預(yù)后較差?；熓侵型砥谖赴┗颊叩闹匾委煼椒ㄖ?，然而近年來(lái)由于腫瘤異質(zhì)性的發(fā)生及耐藥性的形成，化療效果難再提高，亟須探索新的治療方法；siRNA抗腫瘤研究的應(yīng)用為胃癌患者帶來(lái)了希望[3]。表皮生長(zhǎng)因子受體( epithelial growth factor receptor，EGFR)在調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中具有重要作用[4]。作者前期研究結(jié)果表明，EGFR與胃癌關(guān)系密切[5]，干擾EGFR表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)并增加化療藥物敏感性[6]。本研究在已構(gòu)建的EGFR低表達(dá)胃癌細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，觀察細(xì)胞活力和化療藥物敏感性的變化，并運(yùn)用基因芯片分析胃癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化，為靶向EGFR的胃癌治療提供分子理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑人胃腺癌AGS細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，EGFR低表達(dá)的AGS細(xì)胞委托漢恒生物科技(上海)有限公司構(gòu)建完成。F-12K培養(yǎng)基購(gòu)自Millipore公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；ReverTra Ace?qRT-PCR試劑盒、SYBR Green Real-time PCR Master Mix購(gòu)自TOYOBO公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自浙江奧默生物醫(yī)藥有限公司；紫杉醇(PTX)購(gòu)自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司；奧沙利鉑(L-OHP)購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；5-氟尿嘧啶(5-FU)購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；順鉑(DDP)購(gòu)自齊魯制藥有限公司；多柔比星(ADM)購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司。Agilent Human lncRNA基因芯片由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。

1.2 細(xì)胞的分組及培養(yǎng)將胃腺癌AGS細(xì)胞(對(duì)照組)和低表達(dá)EGFR的AGS細(xì)胞(EGFR干擾組)置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，每24～48 h以PBS洗滌細(xì)胞碎片及殘?jiān)⒏鼡Q新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 兩組細(xì)胞活力的CCK-8方法檢測(cè)待細(xì)胞部分融合或鋪滿(mǎn)細(xì)胞瓶70%～80%時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，以預(yù)冷PBS洗滌3遍，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化后，室溫1 000 r/min離心5 min，棄去上清，以完全培養(yǎng)基重懸沉淀并調(diào)整細(xì)胞密度至5×106個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液接種于96孔板中(每孔加入100 μL)，分別培養(yǎng)24、48、72和96 h后，每孔加入10 μL CCK-8，孵育2 h后檢測(cè)450 nm處的光密度(OD)值。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 兩組細(xì)胞集落形成能力的檢測(cè)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組細(xì)胞，與預(yù)冷PBS溶液洗滌3次，分別收集陳舊的細(xì)胞培養(yǎng)基及PBS洗脫液，用2.5 g/L胰蛋白酶消化分離細(xì)胞，并加入2倍體積新鮮培養(yǎng)基終止消化；混合上述溶液并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，室溫下500 r/min離心5 min后重懸細(xì)胞至密度200個(gè)/mL，每孔1 mL加入24孔板中，于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7 d后，用甲醇溶液固定，體積分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫染色進(jìn)行觀察。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 兩組細(xì)胞化療藥物敏感性取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組細(xì)胞，消化、離心，按相同倍數(shù)稀釋?zhuān)謩e取200 μL細(xì)胞懸液(25 000個(gè)/mL)接種于96孔板中，觀察細(xì)胞形態(tài)及長(zhǎng)勢(shì)，待細(xì)胞長(zhǎng)至孔底面積約70%時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，以PBS輕微洗滌2次，加入預(yù)先配制的不同濃度含藥物培養(yǎng)基200 μL，輕輕搖勻使藥物充分接觸細(xì)胞，置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力變化并分別計(jì)算不同藥物的IC50值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 芯片掃描與數(shù)據(jù)分析樣品總RNA利用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)檢測(cè)RNA完整性。RNA樣本質(zhì)檢合格后，將其反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA并進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記好的cDNA與基因芯片雜交，用Feature Extraction軟件處理原始圖像，提取原始數(shù)據(jù)。利用Genespring軟件進(jìn)行匯總、標(biāo)準(zhǔn)化處理。利用兩組基因表達(dá)差異t檢驗(yàn)的P值和差異倍數(shù)(FC)值篩選差異基因，標(biāo)準(zhǔn)為log2FC≥2.0且P≤0.05，根據(jù)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.7 差異表達(dá)基因的功能富集分析應(yīng)用功能富集分析(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能描述。通過(guò)GO分析和KEGG信號(hào)通路分析預(yù)測(cè)差異表達(dá)基因可能涉及的重要生物學(xué)功能和信號(hào)通路。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間集落數(shù)量、OD值與細(xì)胞活力的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 作圖。

2 結(jié)果

2.1 兩組AGS細(xì)胞活力和集落形成能力的比較與對(duì)照組相比，EGFR干擾組細(xì)胞活力下降(P<0.05，圖1A)，集落形成能力降低(P<0.05；圖1B)。

圖1 兩組AGS細(xì)胞活力(A)和集落形成能力(B)變化的比較

2.2 兩組AGS細(xì)胞化療藥物敏感性的比較隨著化療藥物濃度的增加，兩組細(xì)胞生長(zhǎng)活力下降， 且EGFR干擾組AGS細(xì)胞對(duì)化療藥物更敏感；各類(lèi)化療藥物IC50值均低于對(duì)照組(圖2A～E)。

A～E分別為L(zhǎng)-OHP，ADM，5-FU，DDP，PTX

2.3 兩組AGS細(xì)胞差異表達(dá)基因分析結(jié)果共篩選出差異表達(dá)基因1 204個(gè)。差異表達(dá)的mRNA有865個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)242個(gè)，表達(dá)下調(diào)623個(gè)(圖3A)；差異表達(dá)的lncRNA有203個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)83個(gè)，表達(dá)下調(diào)120個(gè)(圖3B)；差異表達(dá)的circRNA有136個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)75個(gè)，表達(dá)下調(diào)61個(gè)(圖3C)。差異表達(dá)大的前10位mRNA、lncRNA、circRNA分別見(jiàn)表1～3。

A：差異表達(dá)的mRNA;B：差異表達(dá)的lncRNA；C：差異表達(dá)的circRNA。紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)

表1 前10位差異表達(dá)的mRNA

表2 前10位差異表達(dá)的lncRNA

表3 前10位差異表達(dá)的circRNA

2.4 差異表達(dá)基因的GO注釋分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在炎性反應(yīng)、膠原分解代謝過(guò)程、心房心肌細(xì)胞膜去極化調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程(圖4A)。在細(xì)胞組分中，差異表達(dá)基因主要與胞膜的構(gòu)成組分、胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)等相關(guān)(圖4B)。分子功能分析顯示，差異表達(dá)基因主要參與鈣離子結(jié)合、趨化因子活性、β淀粉樣蛋白結(jié)合等調(diào)控(圖4C)。

A：生物學(xué)過(guò)程；B：細(xì)胞組分；C：分子功能

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示自身免疫性甲狀腺疾病、1型糖尿病、NF-κB信號(hào)通路等信號(hào)通路富集程度顯著(圖5A)。表達(dá)上調(diào)基因主要富集在移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病、1型糖尿病等信號(hào)通路(圖5B)。表達(dá)下調(diào)基因主要與NF-κB信號(hào)通路、金葡菌感染和萜類(lèi)化合物生物合成重要組分等信號(hào)通路相關(guān)(圖5C)。

A：總體差異表達(dá)基因；B：表達(dá)上調(diào)基因；C：表達(dá)下調(diào)基因

3 討論

近年來(lái)，針對(duì)EGFR突變的靶向治療因在臨床應(yīng)用中取得顯著成效而備受關(guān)注。然而，中國(guó)人群胃癌中EGFR罕見(jiàn)突變致其應(yīng)用受阻，需要重新思考和探索EGFR的生物學(xué)功能及應(yīng)用價(jià)值[7]。EGFR基因在胃癌中呈過(guò)度表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)，體現(xiàn)了其潛在應(yīng)用價(jià)值[8]。研究[9]表明，靶向抑制EGFR表達(dá)，而非其激酶活性，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，為EGFR陽(yáng)性表達(dá)腫瘤的個(gè)體化治療提供了新的途徑。而且，在卵巢癌小鼠模型中，通過(guò)納米水凝膠遞送系統(tǒng)靶向EGFR siRNA治療與EGFR水平升高相關(guān)的卵巢癌被證實(shí)是一種有效策略[10]。近年來(lái)siRNA藥物陸續(xù)被批準(zhǔn)上市，這為實(shí)現(xiàn)EGFR siRNA靶向治療胃癌提供了可能。作者委托漢恒生物科技(上海)有限公司構(gòu)建了低表達(dá)EGFR的AGS細(xì)胞株，通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定集落形成能力，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)化療敏感性的變化。并運(yùn)用基因芯片分析比較了EGFR表達(dá)抑制前后胃癌細(xì)胞中基因表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn)了1 204個(gè)存在差異表達(dá)的基因(包括mRNA、lncRNA和circRNA)，這表明EGFR基因在胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中具有重要作用，機(jī)制可能較為復(fù)雜。

差異表達(dá)mRNA分析結(jié)果顯示，EGFR表達(dá)抑制后IFI27、FAM129C、CLU、TRABD2B均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，PLXNA2、RALGPS1、SHROOM2、HKDC1均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)。干擾素α誘導(dǎo)蛋白27(interferon alpha inducible protein 27，IFI27)是一種α干擾素誘導(dǎo)蛋白，又名干擾素-刺激基因12a蛋白(interferon-stimulated gene 12a protein，ISG12A)，其在1型干擾素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著重要作用[11]，其高表達(dá)可降低乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移能力[12]。FAM129C基因，又名BCNP1，是一種B細(xì)胞特異性的漿膜蛋白，其功能尚不清楚。有研究表明，與野生型脾B細(xì)胞相比，BCNP1缺陷型脾B細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的存活、增殖能力[13]；在WEHI231未成熟B細(xì)胞中BCNP1過(guò)度表達(dá)增強(qiáng)了α-IgM誘導(dǎo)的凋亡，而在BCNP1缺陷的WEHI231細(xì)胞出現(xiàn)凋亡減少[14]。簇集蛋白(Clusterin，CLU)是一種廣泛表達(dá)的糖蛋白，它具有促凋亡和抗凋亡的雙重功能，可能與其不同亞型有關(guān)。研究表明，CLU轉(zhuǎn)染可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞本身和化療誘導(dǎo)的凋亡，反義CLU則抑制細(xì)胞凋亡[15]；在神經(jīng)母細(xì)胞瘤小鼠模型中研究表明CLU是一個(gè)腫瘤和轉(zhuǎn)移抑制基因[16]。含2B的TraB結(jié)構(gòu)域(TraB domain containing 2B，TRABD2B)基因，又名TIKI2，也被報(bào)道在骨肉瘤組織和細(xì)胞中呈低表達(dá)，具有抑制骨肉瘤生長(zhǎng)作用[17 ]。

在EGFR表達(dá)抑制后下調(diào)的基因中，PLXNA2是叢蛋白家族成員，是信號(hào)素配體的跨膜受體，在前列腺癌中呈高表達(dá)，PLXNA2上調(diào)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力[18-19]。RALGPS1是一種鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子，又名RalGEF2，在體內(nèi)和體外均能激活Ral(一種廣泛表達(dá)的Ras)，可能與Ras信號(hào)通路激活有關(guān)[20]。SHROOM2是RhoA-ROCK通路中調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和肌動(dòng)蛋白骨架組織的關(guān)鍵介質(zhì)，有研究[21]報(bào)道SHROOM2在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)，具有抑制細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移的作用。本研究顯示的EGFR表達(dá)抑制下調(diào)SHROOM2基因表達(dá)，其作用和意義還不清楚。己糖激酶結(jié)構(gòu)域成分1(Hexokinase domain component 1，HKDC1) 基因在多種腫瘤中表現(xiàn)為癌基因特性，可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[22]。

在對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行信號(hào)通路預(yù)測(cè)分析中發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因存在顯著性富集，尤其是在表達(dá)下調(diào)的差異基因中，這說(shuō)明EGFR表達(dá)抑制可能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖的生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，EGFR和NF-κB是癌癥發(fā)生中的分子伴侶，共同為癌細(xì)胞提供致癌信號(hào)，維持細(xì)胞增殖、存活和侵襲性[23]；兩者也共同參與了胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移[24]。CLU過(guò)度表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞中NF-κB信號(hào)的激活，相反，CLU抑制促進(jìn)NF-κB信號(hào)的激活[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR抑制促進(jìn)了CLU表達(dá)，抑制了NF-κB信號(hào)機(jī)制，降低了胃癌細(xì)胞增殖能力，這與上述文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

綜上所述，抑制EGFR表達(dá)可有效抑制胃癌細(xì)胞活力，增加胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，并可影響細(xì)胞內(nèi)基因組表達(dá)，其差異表達(dá)基因的變化與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。這表明干擾EGFR表達(dá)用于抗胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有分子理論基礎(chǔ)，可能是一種有效的個(gè)體化抗胃癌治療的新途徑，值得進(jìn)一步深入開(kāi)展應(yīng)用研究。