王 樂，馬丹丹，徐 盼，張 茜，崔 勇，葉放蕾

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院耳科 鄭州 450052 2)廣東省醫(yī)學科學院·廣東省人民醫(yī)院耳鼻咽喉科 廣州 510080

誘導多能干細胞是體外通過一定條件將成體細胞重新編程到多能干細胞狀態(tài)，具有胚胎干細胞相似的形態(tài)及增殖分化能力。人類誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)[1]完全克服了胚胎干細胞在臨床應用時涉及的倫理及免疫排斥問題，具有重要的臨床應用價值，成為干細胞治療的主要細胞來源。目前hiPSC已逐漸被應用到治療中樞神經系統(tǒng)性疾病的研究[2-3]中，體外誘導hiPSC定向分化為神經干細胞的方法各不相同，效率低。本研究擬應用小分子化合物A8301和DMH1體外誘導hiPSC分化為神經干細胞，為進一步的細胞治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細胞滋養(yǎng)層細胞系CF-1和hiPSC細胞來源于中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院。

1.2 主要試劑及儀器DMH1和A8301購自R&D公司，兔抗人Nestin多克隆抗體和鼠抗人Pax6多克隆抗體購自Santa Cruz公司，bFGF、Trizol試劑、DMEM/F12培養(yǎng)基、N2、B27、matrigel膠、血清替代物和2.5 g/L胰蛋白酶等購自Invitrogen公司，DMEM高糖培養(yǎng)基和GlutaMax等購自Gibco公司；紫外分光光度計和離心機為Eppendorf公司產品，光學顯微鏡和倒置熒光顯微鏡為Zeiss公司產品。

1.3 培養(yǎng)基與實驗分組各個階段應用的培養(yǎng)基及其組成成分見表1。細胞根據(jù)懸浮階段所用培養(yǎng)基的不同分為實驗組和對照組。懸浮階段對照組用基礎的無血清懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)；實驗組用加入小分子化合物A8301和DMH1的無血清懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)。兩組貼壁階段均用維持神經分化的貼壁培養(yǎng)基。

表1 各階段培養(yǎng)基組成成分

1.4 細胞培養(yǎng)

1.4.1HiPSC培養(yǎng) 實驗前1 d 6孔板鋪基質膠，30 min后每孔加入2×105個CF-1細胞及2 mL滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)基。吸棄hiPSC原有培養(yǎng)基，加入F12，洗2遍；加入500 μL胰蛋白酶，37 ℃孵育，消化至克隆周邊卷起；吸棄培養(yǎng)基，F(xiàn)12洗2遍；加入1 mL KSR，用1 mL槍頭輕輕刮下hiPSC細胞團，平均分配到已經鋪好滋養(yǎng)層細胞的6孔板中；每孔補加KSR到2 mL；搖勻，將6孔板緩慢轉移至培養(yǎng)箱中。實驗組和對照組各設6個復孔。

1.4.2懸浮培養(yǎng)與類胚體形成 吸棄hiPSC原有培養(yǎng)基，加入F12，洗2遍；加入500 μL胰蛋白酶，37 ℃孵育3 min；吸棄培養(yǎng)基，F(xiàn)12洗2遍；添加適量F12，用1 mL槍頭吹打細胞團，使其脫落；用無菌移液管轉移細胞團至15 mL離心管，自然沉淀；棄上清，添加懸浮培養(yǎng)基2 mL，重懸；轉移細胞克隆團至低黏附培養(yǎng)瓶中；于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中過夜；次日更換培養(yǎng)瓶。

1.4.3貼壁培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)第9天，6孔板中每孔加入200 μL matrigel膠鋪勻，鋪設范圍距離孔邊0.5 cm，置37 ℃培養(yǎng)箱中30 min；吸棄matrigel膠；將懸浮狀態(tài)下的類胚體移至15 mL離心管中，自然沉降；棄上清，貼壁培養(yǎng)基重懸類胚體；每孔均勻分配20～30個類胚體，滴加300 μL貼壁培養(yǎng)基，勿超出matrigel膠覆蓋的范圍；次日補加2 mL貼壁培養(yǎng)基。

1.5 qRT-PCR檢測細胞中Pax6和Nestin mRNA的表達收集貼壁培養(yǎng)第12天時的各孔細胞，嚴格按照RNA抽提試劑盒說明提取總RNA。Pax6和Nestin引物見表2。PCR反應條件：預變性93 ℃ 2 min，然后93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)，最后72 ℃ 1 min延伸。以actin為內參，采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

表2 引物序列

1.6 免疫熒光染色檢測細胞Pax6及Nestin蛋白的表達吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗，500 mL 40 g/L多聚甲醛固定5 min；500 mL PBS清洗5 min，吸棄，重復3遍；添加Pax6及Nestin一抗(均稀釋1 000倍后使用)，孵育過夜；吸棄一抗，PBS洗3遍；添加二抗，常溫孵育1 h，PBS洗3遍；加DPAI至完全覆蓋細胞，常溫孵育10 min，PBS洗3遍；加入1 mL PBS，錫箔紙避光包裝，保存于4 ℃冰箱。應用熒光顯微鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計學處理應用SPSS 23.0分析。兩組Pax6和Nestin mRNA表達的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準a=0.05。

2 結果

2.1 HiPSC和類胚體的形態(tài)學觀察在滋養(yǎng)層細胞上可以觀察到未分化的hiPSC形成橢圓或圓形的細胞克隆團，邊界清楚；克隆團內細胞核質比大，橢圓形或圓形(圖1A)。懸浮培養(yǎng)第3 天，可見三維球形樣細胞團即類胚體(圖1B)。

2.2 神經花環(huán)的形成實驗組類胚體進入貼壁培養(yǎng)階段后，可進一步分化形成花環(huán)樣結構，即神經花環(huán)(圖1C)；而對照組神經花環(huán)形成較少(圖1D)。

A：未分化階段的hiPSC(×50)；B：懸浮階段形成的類胚體(×50)；C：實驗組貼壁階段形成的神經花環(huán)(×100)；D：對照組貼壁階段細胞形態(tài)(×100)

2.3 細胞中Pax6和Nestin表達情況實驗組細胞Pax6和Nestin mRNA的相對表達量分別為(2.75±0.26)和(3.052±0.344)，均高于對照組的(0.97±0.18)和(1.018±0.131)(t=5.622和5.530，P<0.001)；免疫熒光染色結果見圖2。

A：細胞核DAPI染色后呈藍色熒光；B：Pax6染色后呈紅色熒光；C：Nestin染色后呈綠色熒光；D：DAPI、Pax6和Nestin共染

3 討論

HiPSC的產生解決了胚胎干細胞帶來的倫理及免疫排斥問題，已被廣泛應用到各種疾病如心肌病、神經系統(tǒng)疾病等的研究[4-6]中；其治療神經系統(tǒng)疾病被認為是最具前景的方法[7-8]，但到目前為止，仍然未找到一種誘導hiPSC向神經細胞分化的高效方案。傳統(tǒng)的關于干細胞誘導分化為神經干細胞的方法有以下幾種。①視黃酸誘導：視黃酸是一種經典的神經誘導劑[9]，能促進胚胎干細胞定向分化為神經干細胞，但因視黃酸加入培養(yǎng)基后活性不穩(wěn)定而使誘導效率低。②共培養(yǎng)法，可分為基質共培養(yǎng)和條件共培養(yǎng)，但共培養(yǎng)基成分復雜，不利于進行機制研究[10]。本研究采用無血清培養(yǎng)法，培養(yǎng)基由成分確定的生長因子及蛋白組成，不含成分不明的血清[11]，利于進行基礎研究。

在體外懸浮培養(yǎng)時，多能干細胞形成三維球形樣細胞聚集，這些聚集而成的細胞團叫作類胚體。類胚體有胚胎發(fā)育的所有標記，是干細胞分化的關鍵環(huán)節(jié)，調控類胚體的分化可有效控制干細胞的分化方向[12]。類胚體制作方法有懸滴法、應用低吸附培養(yǎng)板培養(yǎng)等[13]，這些方法操作復雜，成本較高。本研究首先使hiPSC在沒有分裂能力的滋養(yǎng)層細胞上生長，形成細胞克隆團；其次通過懸浮培養(yǎng)使細胞克隆團形成類胚體；然后貼壁培養(yǎng)促使類胚體內細胞分化形成神經花環(huán)。神經花環(huán)由表達神經干細胞特異性標記的細胞構成，并能在一定條件下分化為各種神經細胞[14]。本研究觀察到神經花環(huán)在培養(yǎng)12 d時形成的最多，這也與正常人類胚胎發(fā)育過程中神經管形成所需2周的時間一致[15]。

類胚體具有胚胎發(fā)育的所有標記，可分化成內胚層、中胚層及外胚層細胞，而在類胚體的形成過程中加入原條細胞抑制劑可以減少內胚層和中胚層細胞的形成。原條細胞的形成依賴于活化的BMP和TGF-β等信號通路[16]。很多研究[17]在形成類胚體階段通過添加TGF-β和BMP信號通路抑制劑，抑制胚胎干細胞向中胚層和內胚層分化，同時應用堿性成纖維細胞生長因子促使神經干細胞增殖。但既往應用的抑制劑多為蛋白質,活性不穩(wěn)定。小分子化合物作為高效穩(wěn)定抑制劑，已被廣泛應用到干細胞領域[18-19]；小分子化合物A8301可以選擇性抑制TGF-βⅠ型受體激酶ALK5[19]；小分子化合物DMH1是BMP信號通路ALK2受體的選擇性抑制劑[18]。Pax6和Nestin為神經元前體細胞的特征性標記。本研究聯(lián)合應用小分子化合物A8301和DMH1抑制TGF-β和BMP信號通路，結果表明實驗組Pax6和Nestin表達增高，提示A8301和DMH1可阻滯干細胞向內胚層及中胚層分化，從而更有利于hiPSC定向分化為神經干細胞。

綜上，hiPSC可經過體外懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)形成富含神經干細胞的神經花環(huán)，同時小分子化合物A8301和DMH1可有效地促進hiPSC分化為神經干細胞。