盧天宇高 虹楊博超于佳楠徐亞新王若琳秦 川

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

在臨床實踐中，可供移植用的人類組織器官目前仍面臨嚴重的短缺問題，使用源自豬的細胞、組織或器官進行異種移植，是解決該問題的潛在途徑之一[1]。豬內源逆轉錄病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)是一種C型逆轉錄病毒，在進化過程中以前病毒DNA的形式被整合在豬基因組中[2]。目前PERV對于體內人類細胞的感染風險尚不確定，而供體豬不能通過無特定病原體培育、早期斷奶或胚胎移植等方式消除PERV，從而造成了異種移植的潛在生物安全隱患[3]。因此，精確的測定PERV在供體動物中的拷貝數(shù)，以預測PERV的感染風險，對于異種移植的臨床研究及應用具有重要的意義。

傳統(tǒng)檢測PERV拷貝數(shù)通常使用Southern blot[4]、熒光原位雜交[5]以及定量PCR(quantitative PCR，qPCR)[6－7]等方法，不同的方法對PERV的拷貝數(shù)測定結果有所差異[8]。其中，最常使用的qPCR方法在每次檢測時都必須進行標準曲線的制備，而單次所能夠檢測樣品數(shù)較少，加之PERV在不同來源的豬基因組中的拷貝數(shù)變化較大[9]，擴增效率很難保證一致，易造成檢測結果的準確性低和重復性差。

數(shù)字PCR作為新興的技術，越來越廣泛的用于核酸樣品的分析，例如基因表達的檢測[10]、病毒拷貝數(shù)的分析和絕對定量分析[11－13]以及拷貝數(shù)變異分析[14]等。相比于qPCR技術，使用數(shù)字PCR技術進行絕對定量分析不依賴于引物擴增效率，不需要使用標準品，可以直接測定出樣品中目標基因的拷貝數(shù)，極大地減少了技術干擾，是真正意義上的絕對定量[15]。而微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)則是通過微滴發(fā)生油將整個反應體系分割成多個反應微滴，再在單個微滴內進行獨立的PCR擴增，通過讀取熒光信號確定陽性微滴和陰性微滴，根據(jù)泊松分布的原理推算目標基因的拷貝數(shù)[16－17]。

本研究采用雙重熒光TaqMan探針，分別以豬GAPDH和TFRC作為內參基因，通過對于退火溫度、反應循環(huán)數(shù)以及檢測樣本量等參數(shù)進行了系統(tǒng)的優(yōu)化，建立了基于ddPCR技術的PERV拷貝數(shù)檢測方法。通過與基于qPCR檢測方法的比較，我們展示了所建立的PERV拷貝數(shù)檢測新方法具有更高的靈敏度和更好重復性，為異種移植研究中PERV拷貝數(shù)的檢測提供更好的技術和參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質粒標準品

將豬GAPDH基因(3430~4294 bp)、TFRC基因(1200~1947 bp)和PERV的pol基因(3344~4115 bp)，長度分別為730、665和748 bp的DNA片段，克隆到pEASY(3929 bp)載體上，獲得pEASYGAPDH、pEASY-TFRC和pEASY-pol質粒。紫外分光光度計測定標準品質粒的濃度而計算拷貝數(shù)，通過10倍梯度稀釋，獲得107、106、105、104、103、102、10和1 copies/μL的濃度梯度稀釋的質粒標準品。

1.1.2 豬基因組DNA

本研究中采用的豬基因組DNA樣品，分別是來自2個豬胚胎成纖維細胞(porcine embryonic fibroblasts，PEF)、豬的腎表皮細胞系PK15以及來自3個不同個體的巴馬小型豬的肺部組織，按照基因組提取試劑盒說明書獲得細胞和組織基因組。

1.2 主要試劑與儀器

基因組提取試劑盒(全式金，中國)；用于qPCR的TB Green Mix(TaKaRa公司，中國)；微滴生成油、微滴讀取油、ddPCR的反應液、微滴生成卡(Bio-Rad，美國)；MseI內切酶(NEB，中國)；96孔板(ABI，美國)；Nano Drop紫外分光光度(賽默飛，美國)；QX20TM Droplet Digital PCR系統(tǒng)(Bio-Rad，美國，包括微滴發(fā)生儀、微滴分析儀和熱膜封口儀)；CFX定量PCR儀(Bio-Rad，美國)；T100梯度PCR儀(Bio-Rad，美國)；引物和探針均由北京六合華大合成，具體信息見表1。

表1 檢測PERV拷貝數(shù)所用的引物和探針序列Table 1 Sequences of primers and probes

1.3 實驗方法

1.3.1 微滴數(shù)字PCR

(1)基因組酶切:500 ng基因組采用5 U MseI限制性內切酶，37℃水浴2 h。

(2)微滴生成:配制20μL反應體系(其中包含反應液mix 10μL，引物各900 nmol/L，探針各250 nmol/L，標準質粒或MseI酶切后的基因組1μL，補充水至20μL)加入微滴反應卡中。在微滴反應卡加入70μL微滴生成油，發(fā)生卡膠墊蓋好后，將微滴發(fā)生卡放在微滴生成儀中生成微滴。

(3)PCR擴增:將生成的微滴轉移到96孔板中，用PX1進行膜熱封后，96孔板放在PCR儀上進行擴增。反應參為95℃10 min；94℃30 s，退火溫度1 min，40~50個循環(huán)；98℃10 min，所有步驟升溫速度均為2℃/s。

(4)微滴讀取:擴增反應結束后，將96孔板放入QX200微滴分析儀中，采用Quantsoft軟件進行微滴讀取。

1.3.2 qPCR反應體系和條件

本實驗中qPCR的反應體系為25μL(TB Green mix 12.5μL、10μmol/L PCR引物各1μL、模板DNA約100 ng、補充水至25μL)。PCR反應條件為95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)。

1.3.3 ddPCR退火溫度的優(yōu)化

選擇63.0℃、61.9℃、60.9℃、59.9℃、58.6℃、57.5℃6個溫度，進行退火和延伸溫度的優(yōu)化。以104copies/μL的3個質粒標準品以及1.25 ng的PEF 10?；蚪M為模板，確定最佳退火溫度。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用Quantasoft軟件對ddPCR數(shù)據(jù)進行圖像處理和結果分析，本研究中所有涉及的ddPCR反應微滴生成數(shù)均在10000~15000，符合ddPCR泊松分布的統(tǒng)計學原理，保證了后續(xù)分析結果的準確性。采用GraphPad進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異分析，結果用平均數(shù)±標準差(±s)表示，三組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 微滴數(shù)字PCR退火溫度的優(yōu)化

以104copies/μL的標準品為模板，分別在63.0℃、61.9℃、60.9℃、59.9℃、58.6℃、57.5℃6個退火溫度下進行PCR反應，結果顯示pEASYGAPDH、pEASY-TFRC和pEASY-pol標準品在這6個溫度條件下均能檢測到熒光信號，在不同退火溫度下沒有顯著差別(圖1A和表2)。

表2 標準品質粒在不同退火溫度下ddPCR檢測的拷貝數(shù)Table 2 Copy numbers of standard plasmids detected by ddPCR at different annealing temperatures

以63.0℃、61.9℃、60.9℃、59.9℃、58.6℃、57.5℃為退火和延伸溫度，PEF基因組作為模板，分別以GAPDH和TFRC為內參基因進行ddPCR檢測。如一維散點圖所示，pol基因、GAPDH基因和TFRC基 因 分 別 在59.9℃~61.9℃、57.5℃~63.0℃、57.5℃~60.9℃進行退火和延伸溫度適合(圖1B和1C)。綜上，本研究選用59.9℃作為后續(xù)ddPCR反應的最佳退火和延伸溫度。

2.2 微滴數(shù)字PCR循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

根據(jù)Bio-Rad官方建議，ddPCR反應擴增循環(huán)數(shù)應為40個，但在以基因組為模板對退火溫度優(yōu)化時，PERVpol基因擴增后的陰、陽微滴較難分開(圖1B和1C)，易造成結果分析的偏差。因此，本研究通過提高PCR擴增循環(huán)數(shù)來優(yōu)化這一反應條件。實驗分別采用40、45和50個擴增循環(huán)對PEF的基因組模板進行PCR擴增。結果顯示，擴增循環(huán)數(shù)的提高對于微滴生成并沒有顯著影響(圖2A)。但是，隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，pol基因擴增微滴的陰、陽性信號逐漸分開(圖2B)。因此，本研究確定50個擴增循環(huán)作為后續(xù)ddPCR檢測的反應條件。

圖1 不同退火溫度下ddPCR擴增一維散點圖Figure 1 One-dimensional scatter plot of ddPCR at different annealing temperatures

圖2 ddPCR反應循環(huán)數(shù)優(yōu)化Figure 2 Optimization of ddPCR cycle number

2.3 dd PCR檢測范圍的確定

本研究將3個基因的標準品質粒進行10倍濃度梯度稀釋，對不同濃度的標準品分別進行ddPCR檢測。結果顯示，隨著標準品濃度降低，陽性微滴數(shù)減少，3個基因的標準品以106copies/μL為模板進行PCR擴增產生的微滴全部為陽性微滴，超出了檢測上限；以1 copy/μL的標準品為模板進行PCR擴增后，所產生的微滴中并未檢測到陽性微滴(圖3A)。采用ddPCR檢測標準品的拷貝數(shù)與紫外分光光度計測定的DNA拷貝數(shù)，在檢測范圍內具有良好的相關性，pol基因r2＝0.992，P<0.001、GAPDH基因r2＝0.9976，P<0.0001、TFRC基因r2＝0.996，P<0.001(圖3B)。

本研究將PEF基因組按照107.5、5、2.5、1.25和0.625 ng為模板進行ddPCR。樣本以10 ng基因組為模板，陽性微滴數(shù)超過了總微滴數(shù)的90%(圖3C)。隨著基因組模板濃度的降低，檢測結果的變異系數(shù)提高(圖3 D)。因此在滿足ddPCR反應不超過檢測上限的基礎上，提高模板量能夠提高結果的準確性。檢測PERV拷貝數(shù)時，采用基因組模板在1.25~7.5 ng進行PERV拷貝數(shù)的檢測為宜。

圖3 ddPCR對于PERV拷貝數(shù)的檢測范圍Figure 3 Range of template for PERV copy number detected by ddPCR

2.4 樣本檢測

對來自3個細胞和3個肺組織的基因組樣本，采用ddPCR和qPCR兩種方法進行PERV拷貝數(shù)的檢測。結果顯示，ddPCR檢測PERV拷貝數(shù)結果的變異系數(shù)在0.44%~8.29%之間，顯著低于同一樣本qPCR檢測結果的變異系數(shù)，顯示了ddPCR檢測結果具有良好的穩(wěn)定性(表3)。

表3 ddPCR和qPCR測定不同來源豬基因組中PERV的拷貝數(shù)(±s)Table 3 PERV copy numbers in pig genome detected by ddPCR and qPCR

表3 ddPCR和qPCR測定不同來源豬基因組中PERV的拷貝數(shù)(±s)Table 3 PERV copy numbers in pig genome detected by ddPCR and qPCR

注:數(shù)據(jù)來自3次獨立重復試驗。Note.Data came from three independent replicates.

微滴式數(shù)字PCR(copies/μL)ddPCR樣品Samples熒光定量PCR(copies/μL)qPCR GAPDH為內參GAPDH as reference gene TFRC為內參TFRC as reference gene GAPDH為內參GAPDH as reference gene TFRC為內參TFRC as reference gene拷貝數(shù)Copy number變異系數(shù)Coefficient of variation拷貝數(shù)Copy number變異系數(shù)Coefficient of variation拷貝數(shù)Copy number變異系數(shù)Coefficient of variation拷貝數(shù)Copy number變異系數(shù)Coefficient o variation PEF 6＃ 32.50±0.14 0.44% 33.25±2.76 8.29% 67.53±13.43 19.89% 24.38±4.06 16.66%PEF 10＃ 33.17±1.42 4.27% 32.87±1.03 3.12% 210.44±63.70 30.27% 52.00±12.67 24.37%PK15 59.10±3.87 6.65% 57.60±0.66 1.14% 175.75±32.26 18.41% 78.70±2.65 3.37%肺1＃Lung 1＃ 41.07±0.93 2.26% 28.83±0.71 2.46% 49.52±5.92 11.95% 32.58±3.76 11.54%肺2＃Lung 2＃ 40.37±0.31 0.76% 32.60±0.56 1.71% 69.10±7.76 11.24% 42.33±3.11 7.35%肺3＃Lung 3＃ 39.50±2.02 5.12% 32.40±1.18 3.64% 64.68±9.23 14.27% 40.88±2.65 6.63%

3 討論

隨著免疫抑制藥物研究和基因修飾供體動物的快速發(fā)展，將豬源器官異種移植到非人靈長類動物模型后，移植物可以存活數(shù)月甚至數(shù)年[19－21]，異種移植是否可應用于臨床也被不斷的討論。但是，體外研究發(fā)現(xiàn)PERV可以感染人源細胞[22－23]，因此豬源組織器官異種移植到人體存在生物安全風險。從當前豬到非人靈長類模型的的研究結果，對供體豬體內PERV活性進行實時監(jiān)測可以提前預測并防范該風險[24]。因此，對PERV拷貝的精確檢測對于異種移植的臨床應用具有重要的意義。

本研究采用ddPCR技術對豬基因組中PERV拷貝數(shù)的進行檢測。與傳統(tǒng)的qPCR方法相比，檢測結果具有更好的穩(wěn)定性和重復性，所需的被檢測樣本量也僅是qPCR方法所需的1/10~1/20，更適操作中，微滴生成后，需將微滴轉移到其他模塊中進行擴增和檢測。在轉移過程中可能造成液體的損失，從而導致目標分子定量的低估[25]。因此，本研究中我們采用TaqMan熒光探針雙重微滴的方法，在同一微滴內對內參基因和目標基因進行絕對定量，從而規(guī)避了ddPCR的這一缺點。其次，ddPCR結果分析時確保陰性和陽性微滴的劃分對于結果的準確性也非常重要，保證引物及探針的序列特異性和控制模板檢測范圍是控制這一因素的重要條件[26]。但是，PERV是作為前病毒被插入在豬基因組中，即使是高度保守的pol基因也含有點突變，且基因組中PERV的拷貝數(shù)較高，因此在ddPCR結果分析過程中微滴出現(xiàn)了“下雨”現(xiàn)象。為了解決這一問題，本研究中在選擇特異性較好的引物和探針的條件下，還提高了PCR的循環(huán)數(shù)，從而提高了陽性微滴熒光的振幅，解決了陽性微滴的識別，提高了結果的準確性。這一結果也為采用ddPCR技術進行拷貝數(shù)變異分析時，優(yōu)化檢測條件提供了可行的方向。

在ddPCR中選擇適合的內參基因，對于檢測結果的準確性和穩(wěn)定性具有重要的影響。GAPDH和TFRC基因是豬基因組中的單拷貝基因[27]，在本研究中被選做內參基因。結果顯示，在3個細胞來源的樣品中，分別采用兩個不同的內參基因，PERV拷貝數(shù)檢測顯示了良好的一致性，在后續(xù)的研究中可以作為PERV拷貝數(shù)檢測的候選內參基因。但是在組織樣品檢測中，GAPDH和TFRC分別作為內參基因后所得到的結果略有差異。我們推測可能是由于組織樣本中含有多種類型的細胞，尤其是存在大量血細胞，而造成了這一差異[8]。因此，在后續(xù)研究中，從組織樣本分離單一類型的細胞進行PERV拷貝數(shù)的檢測有可能提高檢測結果的準確性。

綜上所述，本研究建立了基于ddPCR技術對PERV拷貝數(shù)的檢測方法，為異種移植供體動物中PERV的監(jiān)測提供了可靠的方法，對于異種移植的臨床研究具有重要的意義。