孫 赟陳桂芳高 娟張麗娟張 祎*王睿睿*

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500；2.云南省民族特色養(yǎng)生理論與健康產(chǎn)品工程實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種較為常見(jiàn)的慢性皮膚疾病，容易復(fù)發(fā)，常發(fā)病于嬰兒和兒童，少見(jiàn)發(fā)病于成年人。AD是一種特殊類(lèi)型的濕疹[1－2]，其主要癥狀是皮膚瘙癢，伴隨不同程度的皮屑脫落和皮膚潰爛，嚴(yán)重者甚至?xí)a(chǎn)生睡眠障礙，具有慢性遷延和反復(fù)發(fā)作的特征。近年來(lái)AD的發(fā)病是呈上升的趨勢(shì)[3]，目前發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其病因十分復(fù)雜，可能與遺傳、免疫、環(huán)境、感染、精神心理、皮膚屏障受損等多種因素有關(guān)[4]。

中西醫(yī)治療AD的方法各有不同[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)從基因、免疫、皮膚屏障功能、感染等多種因素進(jìn)行了深入的研究，在診斷以及流行病學(xué)方面取得了一定成績(jī)。對(duì)于AD的治療，常用方法是使用抗組胺藥，以及在局部使用潤(rùn)膚劑、皮質(zhì)類(lèi)固醇激素和免疫抑制劑等，但使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生副作用，患者耐受程度較低。中醫(yī)對(duì)AD疾病的治療藥物較多，有湯劑，散劑、油膏劑、外洗劑等，包括了口服和外用等劑型，在治療和減少?gòu)?fù)發(fā)方面均有一定特色和優(yōu)勢(shì)[6]。

氧化苦參堿具有廣泛的藥理作用，如抗病毒、抗炎、抗心律失常、抗纖維化、免疫抑制及抗腫瘤等[7－12]，研究標(biāo)明，氧化苦參堿可改善小鼠濕疹及慢性濕疹皮損，顯著減輕炎癥反應(yīng)[13－16]。本文擬探討氧化苦參堿治療AD小鼠模型的藥效作用和初步作用機(jī)制，為AD治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，6~8周齡，體重(20±2)g；SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，6~8周齡，體重(20±2)g，均購(gòu)買(mǎi)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2016-0002]。小鼠飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中[SYXK(滇)2017-005]，溫度:22℃~24℃，濕度:45%~55%，光照12 h為一個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審查(R-0620160015)，符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利相關(guān)規(guī)定。實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

氧化苦參堿，≥98%(HPLC)，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)Y30S6Y17043；醋酸地塞米松，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)170512；右旋糖酐，Biotopped公司，批號(hào)17-0270-01；2，4-二硝基氯苯，成都貝斯特試劑有限公司，批號(hào)Z0016B5；丙酮，云南楊林工業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)油滇藥業(yè)有限公司，批號(hào)20160325；橄欖油，山東魯花集團(tuán)有限公司，批號(hào)20180803；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)50116；IgE ELISA試劑盒，聯(lián)科生物，批號(hào)A27591234；IL-4 ELISA試劑盒，聯(lián)科生物，批號(hào)A20481252；IL-13 ELISA試劑盒，聯(lián)科生物，批號(hào)A21300855。全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，昆明倍捷科技有限公司，型號(hào):Plus384；－80℃超低溫冰箱，美國(guó)Thermo Forma公司，型號(hào):Forma 902；低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào):5810R；電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司，型號(hào):AR224CN。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 氧化苦參堿對(duì)右旋糖酐致小鼠瘙癢模型的影響

將50只KM小鼠按性別體重隨機(jī)分為5組，設(shè)空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(醋酸地塞米松1.5 mg/kg)以及氧化苦參堿高、低劑量(100、50 mg/kg)組，每組10只；地塞米松組、氧化苦參堿各劑量組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，每日2次，連續(xù)7次?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組灌胃等體積的0.5%CMC-Na。末次給藥后10 min，在每只小鼠左后足腳墊內(nèi)注射右旋糖酐50μL，觀察并記錄15 min內(nèi)小鼠舔后足的次數(shù)，小鼠連續(xù)舔后足出現(xiàn)短暫停頓記為1次瘙癢。

1.3.2 氧化苦參堿對(duì)AD模型小鼠的影響

60只BALB/c小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(BC)、模型對(duì)照組(DEX)、陽(yáng)性對(duì)照組(醋酸地塞米松2 mg/kg)(OXM)、氧化苦參堿低、中、高劑量組(25、50、100 mg/kg；OXY-L、OXYM、OXY-H)，每組8只。實(shí)驗(yàn)前1 d，所有小鼠用電推剪加脫毛膏進(jìn)行背部脫毛(2 cm×2 cm)，暴露皮膚；實(shí)驗(yàn)第1、2天，除空白對(duì)照組外，其余小鼠在背部皮膚涂抹以丙酮-橄欖油混合溶液為溶媒配制的3%2，4-二硝基氯苯(DNCB)溶液，每次100μL，第3~6天不作任何處理，第7天開(kāi)始每隔2 d涂抹1次1%DNCB溶液，每次70μL，共3次?？瞻讓?duì)照組小鼠背部皮膚僅涂抹丙酮-橄欖油混合溶液，涂抹時(shí)間和體積與造模組一致。自實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始各組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)給藥14 d，每天稱(chēng)重。末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥后30 min麻醉，腹主動(dòng)脈取血，剖取脾和胸腺、稱(chēng)重，計(jì)算臟器系數(shù)，剪取背部造模處皮損組織切為兩部分，一部分置于－80℃冰箱，一部分置于10%中性福爾馬林溶液中備用。

分離血清，采用ELISA試劑盒測(cè)定血清中總IgE和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13的含量；10%中性福爾馬林固定的皮損組織經(jīng)脫水、透蠟、包埋、切片等制備成病理切片，HE染色觀察一般組織病理學(xué)變化；石蠟切片經(jīng)脫蠟進(jìn)行甲苯胺藍(lán)(TB)染色以觀察皮損組織真皮層中肥大細(xì)胞(mast cell，MC)的浸潤(rùn)情況，每組隨機(jī)選取8個(gè)視野，拍照，封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad prism 8.0.2軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用單因素方差分析和t檢驗(yàn)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氧化苦參堿對(duì)瘙癢模型小鼠的影響

與模型對(duì)照組相比，氧化苦參堿高低劑量可減少小鼠的抓癢次數(shù)(P<0.01)，對(duì)右旋糖酐所致瘙癢有一定程度的抑制，以50 mg/kg效果較佳，因此選擇此劑量為受試劑量繼續(xù)探究氧化苦參堿對(duì)特應(yīng)性皮炎實(shí)驗(yàn)的干預(yù)效果及初步作用機(jī)制(圖1)。

圖1 對(duì)右旋糖酐所致小鼠瘙癢的影響(n＝10)Figure 1 Effect of oxymatrine on itching mice model induced by dextran

2.2 氧化苦參堿對(duì)AD模型小鼠的影響

2.2.1 氧化苦參堿對(duì)AD小鼠一般情況的影響

與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠體重偏低，氧化苦參堿各劑量12 d后小鼠體重均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖2)。

圖2 對(duì)AD小鼠體重的影響(n＝8)Figure 2 Effect of oxymatrine on the body weight of AD mice

2.2.2 氧化苦參堿對(duì)AD模型小鼠臟器系數(shù)的影響

與模型對(duì)照組相比，氧化苦參堿高劑量可降低AD模型小鼠的胸腺系數(shù)(P<0.01)表現(xiàn)出類(lèi)似地塞米松樣的免疫抑制作用；氧化苦參堿高中劑量可降低小鼠脾系數(shù)(P<0.05)，推測(cè)可能與抑制被過(guò)度激活的B淋巴細(xì)胞有關(guān)(圖3)。

圖3 對(duì)AD模型小鼠臟器系數(shù)的影響(n＝8)Figure 3 Effect of oxymatrine on organ coefficients of AD model mice

2.2.3 氧化苦參堿對(duì)血清總IgE含量的影響

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠外周血總IgE含量增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組比較相比，陽(yáng)性藥和氧化苦參堿高劑量均能顯著抑制AD模型小鼠外周血總IgE的表達(dá)(P<0.05)(圖4)。

圖4 對(duì)AD小鼠外周血總IgE含量的影響(n＝8)Figure 4 Effect of oxymatrine on the total IgE content of peripheral blood in AD mice

2.2.4 氧化苦參堿對(duì)外周血Th2型細(xì)胞因子含量的影響

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠外周血IL-4、IL-13含量均有增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性藥和氧化苦參堿均能顯著抑制AD模型小鼠外周血IL-4、IL-13含量的表達(dá)(P<0.05)(圖5)。

圖5 對(duì)小鼠血清Th2型細(xì)胞因子的影響(n＝8)Figure 5 Effect of oxymatrine on the content of Th2 type cytokine in AD mice serum

2.2.5 氧化苦參堿對(duì)AD模型小鼠皮損組織病理的影響

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠皮損處皮膚結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，角化過(guò)度，棘層肥厚明顯伴灶性海綿水腫，真皮血管擴(kuò)張充血并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，毛囊結(jié)構(gòu)減少。與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠表皮各層結(jié)構(gòu)較清晰，表皮增厚明顯減輕，真皮未見(jiàn)血管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞較模型組明顯減輕，毛囊結(jié)構(gòu)明顯增多；氧化苦參堿各劑量組小鼠皮膚炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，角質(zhì)層角化不全有所緩解(圖6)。

圖6 對(duì)小鼠皮損皮膚一般組織病理的影響(HE染色)Figure 6 Effect of oxymatrine on the general histopathology of skin lesions in mice(HE staining)

2.2.6 氧化苦參堿對(duì)AD模型小鼠皮損肥大細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠皮損處肥大細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多；與模型對(duì)照組相比，地塞米松和氧化苦參堿各劑量均能顯著減少皮損處肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)，具體結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 對(duì)小鼠皮損肥大細(xì)胞浸潤(rùn)的影響(TB染色)Figure 7 Effect of oxymatrine on mast cell infiltration in the lesions of AD model mice(TB staining)

3 討論

AD是慢性易復(fù)發(fā)的皮膚炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中免疫功能異常是發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞免疫中T淋巴細(xì)胞在AD中的作用已較為明確，在急性期AD病變主要由Th2細(xì)胞和IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子主導(dǎo)，慢性期以Th1型細(xì)胞反應(yīng)為主[17－19]。Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-5、IL-13可誘導(dǎo)淋巴B細(xì)胞產(chǎn)生IgE，間接活化肥大細(xì)胞。因此，在AD發(fā)病機(jī)制中，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-9和IL-13即是調(diào)控AD的關(guān)鍵細(xì)胞因子，同時(shí)肥大細(xì)胞活化后會(huì)產(chǎn)生一系列炎癥因子，并與T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等相互作用，共同參與AD的皮膚瘙癢和炎癥反應(yīng)過(guò)程，證明Th細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及肥大細(xì)胞均在AD機(jī)制中扮演重要角色。因此，抑制Th2型細(xì)胞因子表達(dá)，調(diào)控肥大細(xì)胞應(yīng)該能夠有效抑制AD。

本研究表明，中藥苦參中有效成分氧化苦參堿能明顯改善小鼠的皮膚病理癥狀、減輕皮膚增厚，減少肥大細(xì)胞的數(shù)目以及Th2型細(xì)胞因子等在皮膚組織的表達(dá)，對(duì)AD小鼠有治療作用，并提示氧化苦參堿治療AD小鼠的作用機(jī)制可能與減少皮膚真皮層中肥大細(xì)胞浸潤(rùn)、減輕Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)，但氧化苦參堿如何通過(guò)下調(diào)Th2型細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)而減少肥大細(xì)胞的募集和激活還有待于進(jìn)一步的研究。