傅春妮 李元輝 李鵬程 李留安 秦順義

(天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

玉米赤霉烯酮(zearalenon,ZEN)是鐮刀菌產(chǎn)生的有毒害作用的霉菌毒素，家畜可通過被污染的谷物接觸到ZEN，影響生長、繁殖、免疫等功能，其中豬是對ZEN最敏感的動物[1]。因此，尋找一種有效抵抗真菌毒素的添加劑有重要意義。低聚殼聚糖硒作為有機硒多糖，結(jié)合了硒和低聚殼聚糖兩者的功能，可增強機體抗氧化能力、提高繁殖性能、促進免疫器官發(fā)育[2-4]。從食物攝入的毒素首先攻擊的是胃腸道，已有研究表明，ZEN可誘導豬腸上皮細胞產(chǎn)生線粒體損傷和氧化應激[5-6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可維持細胞穩(wěn)態(tài)，是蛋白質(zhì)的合成、加工的重要場所[7]。Ben等[8]發(fā)現(xiàn)番紅花和槲皮素可通過減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激保護人結(jié)腸癌細胞和人胚胎腎細胞免受ZEN誘導的細胞凋亡。目前并未見有關(guān)于低聚殼聚糖硒通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑緩解ZEN對豬腸道損傷的研究。因此，本試驗采用豬腸上皮細胞(IPEC-J2細胞)為材料，研究低聚殼聚糖硒在ZEN誘導的細胞氧化損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的作用機制，以期為低聚殼聚糖硒保護ZEN對腸道的損傷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

IPEC-J2細胞(天津師范大學動物營養(yǎng)與飼料實驗室惠贈)，低聚殼聚糖硒(天津農(nóng)學院基礎(chǔ)獸醫(yī)實驗室制，硒(Se)含量為22 g/kg，合成方法參照徐春蘭等[9])，低聚殼聚糖(Comybion公司，相對分子質(zhì)量2 000)，亞硒酸鈉(成都艾科達化學試劑有限公司，AR，98%)，玉米赤霉烯酮(上海源葉生物科技有限公司)，線粒體膜電位(JC-1)檢測試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒(南京凱基科技有限公司)，細胞計數(shù)檢測試劑盒(CCK8)、β-肌動蛋白(β-actin)兔單克隆抗體、山羊抗兔二抗(碧云天生物技術(shù)公司)，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protine 78,GRP78)、磷酸化蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶/蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(phosphorylated protein kinase receptor like endoplasmic reticulum kinase/protein kinase receptor like endoplasmic reticulum kinase,P-PERK/PERK)、轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)、轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)抗體(Proteintech公司)，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白檢測試劑盒(索萊寶科技有限公司)。

1.2 細胞存活率的測定

用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞含量至1×105個/mL，接種于96孔板中，分為5組：對照組(C組)、ZEN組(30 μg/mL)、ZEN+0.5 Se組(30 μg/mL ZEN+0.5 μmol/L低聚殼聚糖硒，以Se計)、ZEN+1.5 Se組(30 μg/mL ZEN+1.5 μmol/L低聚殼聚糖硒，以Se計)、ZEN+3.0 Se組(30 μg/mL ZEN+3.0 μmol/L低聚殼聚糖硒，以Se計)，每組重復6次。細胞長至60%～70%時，ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se、ZEN+3.0 Se組更換為含對應濃度低聚殼聚糖硒的培養(yǎng)液，其他組更換為正常培養(yǎng)液。12 h后向含ZEN組加入ZEN，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。接著加入CCK8培養(yǎng)45 min，按說明書操作，在450 nm波長測定每孔的吸光度(OD)值。計算細胞存活率，計算公式如下：

細胞存活率(%)=[(試驗組OD值-空白
對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白
對照組OD值)]×100。

1.3 LDH活性測定

細胞分組及處理同1.2，收集細胞培養(yǎng)基，按照LDH試劑盒說明操作，測定各個樣品中LDH活性，在450 nm波長測定每孔的OD值。培養(yǎng)基中LDH活性計算公式如下：

LDH活性(U/L)=[(測定OD值-對照OD值)/
(標準OD值-空白OD值)]×
0.2×1 000。

1.4 ROS含量的測定

用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞含量至4×105個/mL，接種于6孔板中，分組及處理同1.2。將按上述處理培養(yǎng)好的6孔板細胞棄上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍，加入稀釋好的二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)1 mL于每孔中，37 ℃孵育20 min，用不含血清的培養(yǎng)基洗3遍，于熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.5 線粒體膜電位的測定

細胞分組及處理同1.2，使用線粒體探針對細胞進行染色。按照說明書加入JC-1工作液，于細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min，孵育結(jié)束后，吸除上清，用PBS洗2次，加入培養(yǎng)液，于熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.6 氧化應激相關(guān)蛋白表達

細胞分組及處理同1.2，用細胞裂解液裂解細胞，置冰上30 min，將細胞刮下，離心取上清，用BCA試劑盒測定蛋白濃度；加入5×Buffer變性煮10 min得目的蛋白。Western blot測定Nrf2、HO-1蛋白在IPEC-J2細胞中的表達量。

1.7 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路相關(guān)蛋白表達

細胞分組及處理同1.2，Western blot測定GRP78、ATF4、P-PERK/PERK、CHOP蛋白在IPEC-J2細胞中的表達量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

測定值以平均值±標準差表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one way-ANOVA)，若存在差異顯著性，再進行多重比較(LSD法)。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 低聚殼聚糖硒對ZEN誘導條件下IPEC-J2細胞存活率的影響

由圖1可知，與對照組相比，添加ZEN可極顯著降低IPEC-J2細胞存活率(P<0.01)；ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se、ZEN+3.0 Se組細胞存活率極顯著高于ZEN組(P<0.01)；ZEN+3.0 Se組細胞存活率與對照組無顯著差異(P>0.05)。

數(shù)據(jù)點標注不同大寫字母表示極顯著差異(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 低聚殼聚糖硒對ZEN誘導條件下IPEC-J2細胞LDH活性的影響

由表1可知，ZEN組LDH活性相比對照組顯著升高(P<0.05)；ZEN+3.0 Se組LDH活性與ZEN組相比顯著降低(P<0.05)；ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se、ZEN+3.0 Se組LDH活性與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表1 低聚殼聚糖硒對ZEN誘導條件下IPEC-J2細胞LDH活性的影響Table 1 Effects of oligomeric chitosan selenium on LDH activity of IPEC-J2 cells induced by ZEN U/L

2.3 低聚殼聚糖硒對ZEN誘導條件下IPEC-J2細胞ROS含量的影響

通過熒光強度來反映ROS含量，由圖2可知，ZEN組的ROS含量極顯著高于對照組(P<0.01)；ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se、ZEN+3.0 Se組的ROS含量與ZEN組相比均極顯著降低(P<0.01)。

2.4 低聚殼聚糖硒對ZEN誘導條件下IPEC-J2細胞線粒體膜電位的影響

通過熒光強度來反映線粒體膜電位的變化，由圖3可知，ZEN組的線粒體膜電位極顯著低于對照組(P<0.01)；ZEN+1.5 Se和ZEN+3.0 Se組的線粒體膜電位與ZEN組相比極顯著升高(P<0.01)。

2.5 低聚殼聚糖硒對ZEN誘導條件下IPEC-J2細胞氧化應激相關(guān)蛋白表達的影響

由圖4和表2可知，ZEN組Nrf2蛋白表達量顯著低于對照組(P<0.05)，ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se和ZEN+3.0 Se組Nrf2蛋白表達量顯著或極顯著高于對照組(P<0.01或P<0.05)；且ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se和ZEN+3.0 Se組Nrf2蛋白表達量極顯著高于ZEN組(P<0.01)。ZEN和ZEN+0.5 Se組HO-1蛋白表達量顯著低于對照組(P<0.05)，ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se、ZEN+3.0 Se組與ZEN組無顯著差異(P>0.05)，但ZEN+1.5 Se、ZEN+3.0 Se組與對照組也無顯著差異(P>0.05)。

表2 低聚殼聚糖硒對ZEN誘導條件下IPEC-J2細胞氧化應激相關(guān)蛋白表達的影響Table 2 Effects of oligomeric chitosan selenium on expression of oxidative stress-related proteins in IPEC-J2 cells induced by ZEN

A：熒光顯微鏡觀察低聚殼聚糖硒抗ZEN對IPEC-J2細胞活性氧含量的影響；B：低聚殼聚糖硒抗ZEN對IPEC-J2細胞活性氧含量的影響。

A：熒光顯微鏡觀察低聚殼聚糖硒抗ZEN對IPEC-J2細胞線粒體膜電位的影響；B：低聚殼聚糖硒抗ZEN對IPEC-J2細胞線粒體膜電位的影響。

2.6 低聚殼聚糖硒對ZEN誘導條件下IPEC-J2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白表達的影響

由圖5和表3可知，ZEN組GRP78、P-PERK/PERK、ATF4、CHOP蛋白表達量均顯著或極顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01)；ZEN+3.0 Se組GRP78蛋白表達量顯著低于ZEN組(P<0.05)；ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se和ZEN+3.0 Se組P-PERK/PERK蛋白表達量顯著或極顯著低于ZEN組(P<0.05或P<0.01)；ZEN+1.5 Se和ZEN+3.0 Se組ATF4蛋白表達量顯著或極顯著低于ZEN組(P<0.05或P<0.01)；ZEN+3.0 Se組CHOP蛋白表達量顯著低于ZEN組(P<0.05)。

A：Nrf2蛋白條帶圖 Nrf2 protein band map；B：HO-1蛋白條帶圖 HO-1 protein band map。

A：GRP78蛋白條帶圖 GRP78 protein band map；B：P-PERK/PERK蛋白條帶圖 P-PERK/PERK protein band map；C：ATF4蛋白條帶圖 ATF4 protein band map；D：CHOP蛋白條帶圖 CHOP protein band map。

表3 低聚殼聚糖硒對ZEN誘導條件下IPEC-J2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白表達的影響Table 3 Effects of oligomeric chitosan selenium on expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in IPEC-J2 cells induced by ZEN

3 討 論

本試驗研究表明，IPEC-J2細胞受ZEN損傷后，細胞活力降低，培養(yǎng)上清中的LDH活性升高，而添加低聚殼聚糖硒可增加細胞活力，降低LDH的活性。LDH是一種存在于胞質(zhì)中的酶，當細胞受到外界刺激引起細胞損傷或凋亡時，LDH就會釋放到外界，并存在于細胞培養(yǎng)液中。這表明低聚殼聚糖硒可抵抗ZEN引起的IPEC-J2細胞損傷。

細胞受到刺激時，線粒體膜通透性改變，線粒體膜電位就會降低，與前人研究結(jié)果[10]一致，ZEN降低線粒體膜電位，而添加低聚殼聚糖硒后線粒體膜電位會增加，提高了紅色熒光的比例，恢復了細胞的狀態(tài)。

正常的細胞中ROS以較低水平來維持正常的細胞生理活動。氧化應激是ZEN毒性作用的一個重要途徑，長期保持高含量的ROS會引起DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)受損，當超過機體的抗氧化能力后，就會引起細胞損傷和凋亡[11]。據(jù)報道，ZEN可引起多種細胞氧化損傷[12-14]?？寡趸瘎╊A處理可降低ZEN引起的ROS的產(chǎn)生[10,15]。ROS作為一種強氧化應激信號，不僅可以直接損傷細胞，也可以激活一系列損傷、凋亡相關(guān)的傳導途徑。本研究表明，ZEN會使ROS含量大量增加，導致IPEC-J2細胞氧化損傷；添加低聚殼聚糖硒后，ROS含量降低。這說明低聚殼聚糖硒對ROS的產(chǎn)生有一定的抑制作用，可啟動細胞內(nèi)的抗氧化機制。

Nrf2是具有細胞保護功能的抗氧化劑的主要調(diào)節(jié)劑，可保護細胞不會受到自由基的影響，抵御外來氧化刺激，抑制細胞凋亡，促進細胞存活[16]，它是激活HO-1重要的因素，HO-1也是典型的氧化應激標記物[17]，是一種經(jīng)典的抗氧化酶，有良好的抵抗氧化應激的作用[18]。多項研究表明，Nrf2信號通路在抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。Xiao等[19]研究發(fā)現(xiàn)，通過激活Nrf2途徑，可改善腸上皮細胞的氧化損傷。酵母硒可激活腎臟中的Nrf2信號通路，改善Nrf2和Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Keap)的含量，減輕赭曲霉毒素誘導的氧化損傷[20]。與之一致，本試驗中，ZEN使Nrf2蛋白表達量顯著下降，低聚殼聚糖硒的添加顯著增加了Nrf2蛋白表達量。但是對于HO-1，添加ZEN可使其蛋白表達量顯著降低，且ZEN+0.5 Se組也顯著低于對照組，ZEN+0.5 Se、ZEN+1.5 Se、ZEN+3.0 Se組與ZEN組無顯著差異，但ZEN+1.5 Se、ZEN+3.0 Se組與對照組也無顯著差異。從而說明本試驗劑量下的低聚殼聚糖硒可顯著增加Nrf2蛋白表達量，雖然未達到明顯增加HO-1蛋白表達量的作用，但是有改善的趨勢，可能是低聚殼聚糖硒劑量還不夠，至使Nrf2未能完全激活HO-1。

研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)可由ROS產(chǎn)生觸發(fā)[21]，氧化應激通過增加錯誤折疊的蛋白質(zhì)破壞氧化還原平衡從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[22]，但也可能是由于ERS產(chǎn)生從而引起活性氧蓄積。當細胞受到刺激時CHOP表達會上升，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡途徑[23]。其中PERK可以抑制蛋白質(zhì)繼續(xù)翻譯，緩解氧化應激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在錯誤折疊的蛋白會誘導PERK激活，促使下游ATF4轉(zhuǎn)錄，通過激活凋亡通路PERK/ATF4/CHOP，損傷細胞[24]。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激重要的標志性指標，在蛋白質(zhì)合成和加工過程中起關(guān)鍵作用[25]。ZEN誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路誘導小鼠睪丸細胞凋亡[26]。由嘔吐毒素(T-2)引起的ER應激通過內(nèi)切核糖核酸酶肌醇需要酶1-氨基末端激酶(IRE1-JNK)和PERK-ATF4-CHOP信號轉(zhuǎn)導途徑觸發(fā)山羊子宮內(nèi)膜上皮細胞凋亡[27]。Se通過抑制ERS從而保護腎臟免受ZEN氧化損傷和凋亡的影響[28]。同樣，Xiao等[15]表明，Se改善了ZEN誘導的ROS的產(chǎn)生，并逆轉(zhuǎn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)基因和GRP78、ATF4的蛋白表達水平，可以緩解ZEN對雞脾淋巴細胞的損傷。本試驗中，ZEN組GRP78、ATF4、P-PERK/PERK、CHOP蛋白表達量相比于對照組均顯著增加，并且分別在添加不同濃度低聚殼聚糖硒后表達顯著降低，這表明低聚殼聚糖硒通過作用于IPEC-J2細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路，表現(xiàn)出對ZEN損傷的保護作用。因此本試驗研究發(fā)現(xiàn)，低聚殼聚糖硒可能是通過緩解氧化損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激減輕ZEN對IPEC-J2細胞的損傷作用(圖6)，當硒作用后，ROS和ERS可被抑制，將不會激活下游CHOP蛋白并且不會改變線粒體膜電位，從而保護IPEC-J2細胞免受ZEN損傷。

圖6 低聚殼聚糖硒對ZEN誘導的IPEC-J2細胞氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的機制圖Fig.6 Mechanism of oligomeric chitosan selenium on oxidative stress and endoplasmic reticulum stress induced by ZEN in IPEC-J2 cells

4 結(jié) 論

低聚殼聚糖硒可緩解ZEN引起的IPEC-J2細胞氧化損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。