何家俊 吳漢葵 楊昕澗 李 莉 趙國強 孟慶翔 解祥學*

(1.廣東溢多利生物科技股份有限公司，珠海 519060；2.廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣州 510507；3.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100193)

犢牛養(yǎng)殖存在腹瀉、肺部疾病高發(fā)和斷奶應激等諸多問題，嚴重影響了犢牛的健康和生長性能，如何改善犢牛健康和生長性能，對反芻動物生產(chǎn)具有重要意義。通常將出生后至6月齡之間的小牛稱為犢牛，這個階段生理功能急劇變化，自身免疫系統(tǒng)尚未完全建立，抵抗力差，淘汰率高[1]。尤其是斷奶階段的犢牛，其消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)未發(fā)育成熟[2]，腹瀉發(fā)生率較高。犢牛腹瀉易造成生長速度緩慢且機體素質(zhì)變差，感染呼吸道疾病的風險增加，成年后生長性能降低[3]。有研究表明，乳酸菌、酵母菌和丁酸梭菌等益生菌類添加劑可有效降低犢牛腹瀉率[4]，改善動物健康，提高生長性能[5-6]。我國2020年7月1日起已全面禁止在飼料中使用促生長類抗生素，表明政府、消費者和養(yǎng)殖從業(yè)人員對于動物養(yǎng)殖安全的重視。益生菌產(chǎn)品被認為是安全綠色可靠的飼料添加劑，研究表明益生菌可顯著提高飼料消化率和養(yǎng)殖生產(chǎn)效率[7]。丁酸梭菌生長代謝產(chǎn)物包括短鏈脂肪酸、氨基酸和促消化酶，能促進有益菌雙歧桿菌、乳酸桿菌等的生長，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，改善營養(yǎng)物質(zhì)代謝，提高動物生產(chǎn)性能。丁酸梭菌在生長后期會形成芽孢，因此受顆粒飼料加工過程中的高溫、機械摩擦、高壓等不利環(huán)境影響較小，能耐受酸堿、動物胃腸液的影響[8]。

相較于其他益生菌，目前對丁酸梭菌的研究主要集中在單胃動物領域[7,9-10]，丁酸梭菌在反芻動物上的應用研究較少，僅李文茜[11]和Uyeno等[12]做過一些研究，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加丁酸梭菌對犢牛、奶牛的生長性能和腸道健康有影響，但研究的數(shù)據(jù)偏少，且對丁酸梭菌產(chǎn)生作用的機理不是很清晰。因此，本試驗旨在研究飼糧中添加丁酸梭菌對犢牛生長性能和血清生化、抗氧化、免疫指標及糞便微生物數(shù)量的影響，探究丁酸梭菌對犢牛生長性能和健康的影響，并在一定程度上研究其作用機理，為其可能在反芻動物養(yǎng)殖上的應用提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丁酸梭菌產(chǎn)品由廣東某生物科技股份有限公司提供，產(chǎn)品主要由丁酸梭菌和載體組成，丁酸梭菌活菌數(shù)為5×108CFU/g，載體主要成分為玉米淀粉。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

試驗采用分欄散養(yǎng)，每天飼喂3次，分別在06:00、14:00和20:30飼喂。每天定時清掃犢牛欄，并定期消毒。每頭犢牛代乳粉飼喂量為650 g/d，用50 ℃左右的溫開水按6∶1的比例沖調(diào)代乳粉，混勻后用奶盆飼喂，試驗組飼喂的丁酸梭菌直接加到奶盆中，攪拌均勻。開食料和苜蓿干草放置在食槽中供犢牛自由采食，并自由飲用溫水。開食料組成及營養(yǎng)水平見表1。代乳粉使用荷蘭普瑞福犢牛代乳粉，其營養(yǎng)水平見表2。

表1 開食料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the starter (air-dry basis) %

表2 代乳粉營養(yǎng)水平Table 2 Nutrient levels of milk replacer

1.3 樣品采集

在試驗期第30天(斷奶前)，全部犢牛晨飼后3 h進行頸靜脈采血。分別用加入抗凝劑(肝素鈉)和無抗凝劑的5 mL真空采血管收集血液，置于冰盒中低溫保存，迅速帶回實驗室離心、分裝。3 000 r/min離心15 min，血清收集分裝于2 mL離心管中，-20 ℃保存待測。糞便樣品連續(xù)采集3 d，并冷藏保存，立即進行微生物數(shù)量的檢測。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 開食料和代乳粉營養(yǎng)成分含量

干物質(zhì)(DM)含量按照GB/T 6435—2014方法測定；粗脂肪(EE)含量按照GB/T 6433—2006方法測定；粗灰分(Ash)含量按照GB/T 6438—2007方法測定；粗蛋白質(zhì)(CP)含量按照GB/T 6432—1994方法測定；中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)含量采用ANKOM纖維分析儀并結(jié)合ANKOM濾袋技術(shù)進行測定；淀粉含量采用酶分析法，使用Megazyme公司淀粉總量檢測試劑盒測定；磷含量采用釩鉬酸銨顯色法，用分光光度計測定；鈣含量采用原子吸收儀測定。

1.4.2 生長性能及腹瀉情況

試驗開始和結(jié)束當天對試驗牛進行稱重，計算初始體重、終末體重和平均日增重(average daily gain，ADG)；每周測1次采食量，記錄犢牛開食料投料量和剩料量，計算開食料平均日采食(starter ADFI)；每天10:00—11:00觀察試驗牛只的腹瀉情況，對糞便進行評分，試驗結(jié)束時計算腹瀉率(diarrhea rate)。

腹瀉率(%)=[Σ試驗期內(nèi)腹瀉牛頭數(shù)/
(試驗牛頭數(shù)×試驗天數(shù))]×100。

1.4.3 血清生化指標

血清總蛋白(TP)含量采用雙縮脲法測定，尿素氮(UN)含量采用脲酶法測定，葡萄糖(GLU)含量采用二硝基水楊酸(DNS)還原法測定，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性及總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量均采用相應的試劑盒測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.4.4 血清抗氧化和免疫指標

血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量均采用相應的試劑盒測定，試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

血清免疫球蛋白G(IgG)含量的測定采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法，使用試劑盒測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.4.5 糞便微生物數(shù)量

將糞便樣品梯度稀釋后，選擇合適的稀釋倍數(shù)涂布于對應的固體培養(yǎng)基平板上，觀察菌落形態(tài)，進行計數(shù)。大腸桿菌數(shù)量的測定參考GB/T 18869—2019，沙門氏菌數(shù)量的測定參考GB/T 13091—2002，丁酸梭菌數(shù)量的測定參考GB/T 4789.35—2016。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗數(shù)據(jù)均用Excel 2010進行初步處理，應用SPSS 22.0軟件中的one-way ANOVA 過程進行單因素方差分析。數(shù)據(jù)以平均值和均值標準誤(SEM)表示。P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有顯著趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 丁酸梭菌對犢牛生長性能的影響

丁酸梭菌對犢牛生長性能的影響見表3。飼糧中添加丁酸梭菌對犢牛終末體重、平均日增重和開食料平均日采食量無顯著影響(P>0.05)；CB4組和CB8組的平均日增重較對照組分別提高了90和120 g，腹瀉率較對照組分別降低了0.20和0.52個百分點。

表3 丁酸梭菌對犢牛生長性能的影響Table 3 Effects of Clostridium butyrate on growth performance of calves

2.2 丁酸梭菌對犢牛血清生化指標的影響

丁酸梭菌對犢牛血清生化指標的影響見表4。CB4組和CB8組的血清TP含量較對照組顯著升高(P<0.05)。CB4組和CB8組的血清ALT和AST活性較對照組顯著升高(P<0.05)。CB4組和CB8組的血清UN含量較對照組有升高的趨勢(P=0.061)。CB8組的血清GLU含量較對照組和CB4組顯著升高(P<0.05)，CB4組的血清GLU含量與對照組差異不顯著(P>0.05)。CB8組的血清HDL-C含量較對照組有降低的趨勢(P=0.066)。飼糧中添加丁酸梭菌對犢牛血清TCH和LDL-C含量無顯著影響(P>0.05)。

表4 丁酸梭菌對犢牛血清生化指標的影響Table 4 Effects of Clostridium butyrate on serum biochemical indexes of calves

2.3 丁酸梭菌對犢牛血清抗氧化和免疫指標的影響

丁酸梭菌對犢牛血清抗氧化和免疫指標的影響見表5。對于血清抗氧化指標，CB8組的血清T-AOC較對照組有升高的趨勢(P=0.073)，血清GSH-Px活性較對照組顯著升高(P<0.05)。CB4組的血清SOD活性較對照組顯著升高(P<0.05)，血清T-AOC較對照組有升高的趨勢(P=0.073)。CB8組的血清GSH-Px活性較CB4組顯著升高(P<0.05)。飼糧中添加丁酸梭菌對犢牛血清MDA含量無顯著影響(P>0.05)。對于血清免疫指標，CB8組的血清IgG含量較對照組顯著升高(P<0.05)，CB4組的血清IgG含量與對照組和CB8組無顯著差異(P>0.05)。

表5 丁酸梭菌對犢牛血清抗氧化和免疫指標的影響Table 5 Effects of Clostridium butyrate on serum antioxidant and immune indexes of calves

2.4 丁酸梭菌對犢牛糞便微生物數(shù)量的影響

丁酸梭菌對犢牛糞便微生物數(shù)量的影響見表6。CB4組和CB8組的糞便丁酸梭菌數(shù)量較對照組顯著升高(P<0.05)，分別較對照組提高了5.3倍和7.4倍。CB4組和CB8組的糞便大腸桿菌數(shù)量較對照組顯著降低(P<0.05)。CB4組的糞便沙門氏菌數(shù)量較對照組顯著降低(P<0.05)。

表6 丁酸梭菌對犢牛糞便微生物數(shù)量的影響Table 6 Effects of Clostridium butyrate on fecal microorganisms number of calves

3 討 論

3.1 丁酸梭菌對犢牛生長性能的影響

動物生長性能反映了動物的生長狀況對某一因素的變化，是機體代謝的綜合性指標。研究表明，丁酸梭菌等益生菌作為飼料添加劑使用可有效提高動物的生長性能和飼料轉(zhuǎn)化效率[13-15]。Casas等[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1.25×1011～3.00×1011CFU/kg的丁酸梭菌飼喂20～55日齡的仔豬，與添加抗生素和不添加抗生素的對照組相比，均可提高斷奶期仔豬平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率。王海亮等[17]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.5×108、1.0×108和5.0×108CFU/kg的丁酸梭菌飼喂28～56日齡的斷奶期仔豬，顯著提高了仔豬平均日增重和平均日采食量，顯著降低了料重比，腹瀉率與對照組相比分別降低了45.38%、52.75%、54.62%。Liao等[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2.5×108～10.0×108CFU/kg丁酸梭菌飼喂肉雞，可顯著提高1～21日齡肉雞的平均日增重，與抗生素添加組效果相同，飼糧中添加5.0×108CFU/kg丁酸梭菌提高了21～42日齡肉雞的平均日增重。Svejstil等[19]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加5×108CFU/kg的丁酸梭菌可提高1～20日齡、36～49日齡肉雞的平均日增重，同時降低了1～20日齡、36～49日齡肉雞的的料重比。對于丁酸梭菌在反芻動物上的應用，李文茜等[20]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶期犢牛在基礎飼糧的基礎上飼喂2×108CFU/kg丁酸梭菌可顯著提高犢牛平均日增重，有提高動物飼料轉(zhuǎn)化效率的趨勢，丁酸梭菌組犢牛腹瀉率降低了3.62%。本試驗得到相似的結(jié)果，在試驗期內(nèi)，飼糧中添加4和8 g/d丁酸梭菌分別提高犢牛終末體重2.7和3.5 kg，分別提高平均日增重90和120 g，分別降低腹瀉率0.20和0.52個百分點，但各組犢牛開食料平均日采食量和平均日增重無顯著差異，這可能與動物種類、年齡階段、試驗重復數(shù)和丁酸梭菌的添加量等因素有關。

3.2 丁酸梭菌對犢牛血清生化指標的影響

血清生化指標可作為預測犢牛健康的關鍵指數(shù)。血清TP含量主要反映了機體的營養(yǎng)狀況及蛋白質(zhì)的代謝水平。反芻動物采食含氮飼糧后，瘤胃微生物迅速將蛋白質(zhì)分解成氨，一部分作為微生物氮的來源，另一部分吸收至體內(nèi)，經(jīng)肝臟代謝生成UN；然后一部分隨尿液排出，一部分經(jīng)尿素循環(huán)進入瘤胃供動物利用，同時動物機體自身的蛋白質(zhì)降解也會產(chǎn)生UN[21]。本試驗中，CB4和CB8組的血清TP含量較對照組顯著升高，這與前人在肉雞[22]、鴨[23]、乳鴿[24]和豬[25]上的研究結(jié)果一致，表明機體蛋白質(zhì)代謝旺盛，蛋白質(zhì)的吸收利用提高，肝臟的蛋白質(zhì)合成能力及組織蛋白質(zhì)的沉淀作用增強[26]。同時，CB4組和CB8組的血清UN含量較對照組有升高的趨勢，可能是丁酸梭菌進入瘤胃代謝增殖，促進了瘤胃微生物對含氮飼糧的分解代謝，產(chǎn)生更多的氨，經(jīng)瘤胃壁吸收，隨血液循環(huán)進入肝臟生成UN，導致血清UN含量升高。AST和ALT是動物體重要的氨基酸轉(zhuǎn)移酶，在正常范圍內(nèi)，這2種酶對動物體蛋白質(zhì)代謝起關鍵性作用，能減少蛋白質(zhì)分解，促進蛋白質(zhì)合成[27-28]。

血清TC含量可以反映動物機體的脂類代謝是否異常，TC主要由低密度脂蛋白(LDL)攜帶運輸出肝臟，高密度脂蛋白(HDL)有助于清除細胞中的TC，它們的含量具有相關性。本試驗中雖然CB8組血清HDL-C含量較對照組有降低的趨勢，但各組血清TC和LDL-C含量沒有顯著差異，表明犢牛脂類代謝正常。

幼齡反芻動物血清中GLU主要從消化道吸收獲得，但隨著動物的生長發(fā)育，肝臟的糖異生作用逐漸增強，血清中的GLU變成主要來源于肝臟合成。而肝臟合成GLU的前體物是丙酸，飼糧添加丁酸梭菌能增加瘤胃中丙酸和丁酸的含量。本試驗中，CB8組的血清GLU含量較對照組和CB4組顯著升高，可能是由于丁酸梭菌提高了犢牛瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸含量，進而通過肝臟的糖異生作用產(chǎn)生了更多的GLU。

血清生化指標是分析動物體內(nèi)物質(zhì)代謝情況和機體生理情況的重要依據(jù)。本試驗血清生化指標大部分結(jié)果與李文茜等[20]在犢牛斷奶階段上的研究并不一致，但與丁酸梭菌在單胃動物上的研究結(jié)果[29]基本一致。目前，丁酸梭菌的研究主要集中在雞、豬等單胃動物上，在反芻動物上的研究還很少，因此需要更多的試驗去探究丁酸梭菌對犢牛血清生化指標及機體健康的影響。

3.3 丁酸梭菌對犢牛血清抗氧化和免疫指標的影響

動物在健康狀態(tài)下，機體氧化應激和抗氧化狀態(tài)維持在一種良好的動態(tài)平衡。犢牛在氧化應激狀態(tài)下，機體內(nèi)自由基過量，氧化物過量，會對機體造成氧化損傷，MDA作為脂質(zhì)過氧化反應的產(chǎn)物，可以反映機體的氧化應激程度。而抗氧化相關指標反映機體清除自由基的能力，SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化物酶，T-AOC是衡量抗氧化功能的綜合指標，GSH-Px是機體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物。廖秀冬[30]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2.5×108～10.0×108CFU/kg的丁酸梭菌可顯著增加血清和組織中SOD、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性和谷胱甘肽(GSH)含量，提高21和42日齡肉雞十二指腸、空腸、回腸黏膜及肝臟和血清的抗氧化能力。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加丁酸梭菌對犢牛血清MDA含量沒有顯著影響，但CB8組的血清GSH-Px活性較對照組顯著升高，CB4組的血清SOD活性較對照組顯著升高，T-AOC有升高的趨勢。這與前人的研究結(jié)果[31-32]一致。這表明飼糧中添加丁酸梭菌能夠提高犢牛的抗氧化水平，更好地清除氧化自由基，改善機體健康。丁酸梭菌的主要代謝產(chǎn)物丁酸和氫氣也具有抗氧化的作用。丁酸及丁酸鹽能夠增強動物體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性，降低MDA含量，緩解皮質(zhì)酮誘導的氧化應激[33]。氫氣是具有還原性質(zhì)的物質(zhì)，能選擇性地清除細胞中羥自由基，起到抗氧化作用[34]。

血清免疫球蛋白是機體抗感染的重要物質(zhì)，含有特異和非特異性抗體，具有抗菌、抗病毒、抗外毒素等多種功能[26]。丁酸梭菌能激活動物機體免疫系統(tǒng)，機理尚不明確，但丁酸梭菌及其產(chǎn)生的物質(zhì)能夠刺激腸道黏膜的免疫活性，提高動物免疫力[35-36]。本試驗中，飼糧中添加丁酸梭菌后，CB8組的血清IgG含量顯著升高，CB4組有升高的趨勢，與上述文獻中的研究結(jié)果[35-36]一致，表明飼糧中添加丁酸梭菌及其代謝物能提高犢牛機體的免疫功能。

3.4 丁酸梭菌對犢牛糞便腸道微生物數(shù)量的影響

反芻動物胃腸道存在大量的微生物，在一定生長階段飼糧不變的情況下，微生物區(qū)系處于一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)。這些微生物包括有益菌、有害菌和條件致病菌，有益菌可促進胃腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，有害菌會釋放內(nèi)毒素等有害物質(zhì)，造成動物感染和炎癥反應。研究表明，丁酸梭菌可有效地促進胃腸道中有益菌糞鏈球菌、糞桿菌等的增殖和代謝，抑制腸道內(nèi)產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、幽門螺桿菌、沙門氏菌等病原菌的黏附和生長[37]。王遠霞等[38]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能改善斷奶仔豬空腸的微生物多樣性，提高有利于腸道健康的有益菌瘤胃球菌屬、糞球菌屬、布勞特氏菌屬、羅斯氏菌屬等菌屬的相對豐度，降低條件致病菌假單胞菌屬和腸桿菌科等有害菌的相對豐度，有效改善動物的腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)。本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，CB4組和CB8組的糞便中丁酸梭菌數(shù)量分別提高了5.3倍和7.4倍，糞便中大腸桿菌數(shù)量顯著降低；CB4組的糞便中沙門氏菌數(shù)量顯著降低，CB8組有降低的趨勢。其原因可能是丁酸梭菌通過了犢牛的前胃到達腸道，丁酸梭菌及其代謝物丁酸等可有效抑制有害菌的生長，同時產(chǎn)生的消化酶把多聚糖轉(zhuǎn)化為低聚糖，給腸道有益微生物提供必需生長物質(zhì)，利于有益菌的生長和繁殖。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加丁酸梭菌能一定程度上提高犢牛的生長性能，降低腹瀉率；提高血清GLU和IgG含量；增強機體抗氧化能力和免疫功能，改善犢牛健康。

② 本試驗中，飼糧中添加8 g/d丁酸梭菌(活菌數(shù)為5×108CFU/g)的效果優(yōu)于4 g/d。