齊敬宇 鄭亞光 郝 穎 趙艷麗 郭曉宇 郭詠梅 史彬林 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，呼和浩特 010018)

奶牛泌乳期高強度的代謝以及泌乳早期能量負平衡引起的脂肪動員加強均會導致體內(nèi)自由基蓄積過多，從而造成免疫和抗氧化應激功能及生產(chǎn)性能下降，尤其是高產(chǎn)奶牛[1]。本課題組前期研究結(jié)果得出高產(chǎn)奶牛的抗氧化指標如總抗氧化能力(T-AOC)和總超氧化歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性顯著降低[2]。一氧化氮(NO)是具有簡單結(jié)構(gòu)和小分子量的活性氮簇(RNS)自由基，其在機體中具有雙向調(diào)節(jié)的功能。研究表明，巨噬細胞產(chǎn)生的NO在體內(nèi)和體外均有神經(jīng)信號傳遞功能、抗菌和免疫作用。然而，NO的過量產(chǎn)生對細胞具有毒害作用，使奶牛乳腺上皮細胞產(chǎn)生明顯的氧化應激反應[3]。外周血單個核細胞(PBMC)是一類重要的免疫效應細胞，能夠反映機體感染及疾病的發(fā)生，其抗氧化應激能力與奶牛的抗氧化和免疫功能密切相關[4]。鄭亞光等[5]研究表明，NO過量會明顯引起奶牛PBMC的氧化應激。因此，抑制奶牛PBMC中NO的蓄積是提高奶?？寡趸芰Α⒔档脱趸瘬p傷的主要途徑之一。

殼寡糖(COS)是一種由β-(1→4)-糖苷鍵連接的二氨基葡萄糖低聚物，具有水溶性、無細胞毒性、易被腸道吸收等特點，它是通過將殼聚糖進行酸水解和酶降解得到的[6]。COS具有許多生物學活性，如抗炎、抗氧化和免疫刺激等，而且COS與殼聚糖具有相似的生物學活性和理化特性[7]。研究表明，COS對脂多糖(LPS)誘導的炎癥反應具有抑制作用，可以減少炎癥因子白細胞介素-6(IL-6)及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和NO的釋放和表達[8]。本課題組前期研究表明，COS對過量NO誘導的PBMC氧化應激具有減緩作用[9]；COS對PBMC抗氧化功能的促進作用以及對炎癥因子白細胞介素-1β(IL-1β)生物學活性的抑制作用呈劑量依賴性，可降低iNOS的含量和基因表達，進而降低NO的生成[10]，但其確切機制尚不清楚。iNOS在正常細胞中表達量極少，但在IL-1β等炎癥因子刺激下持續(xù)表達，進而使NO過量生成，因此使機體產(chǎn)生氧化應激[11]。白細胞介素-1(IL-1)是多種器官炎癥和組織損傷的重要介導劑，IL-1家族主要由2種刺激劑[白細胞介素-1α(IL-1α)、IL-1β]、2種受體[Ⅰ型白細胞介素-1受體(IL-1RⅠ)、Ⅱ型白細胞介素-1受體(IL-1RⅡ)]以及1種特異性受體拮抗劑[白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)]組成[12]。當IL-1α或IL-1β與白細胞介素-1受體(IL-1R)結(jié)合可以激活相關信號通路。LPS是一種來源于革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素，是IL-1β等炎癥介質(zhì)的誘導劑[13]。研究表明，由LPS引起的小鼠氧化應激反應，通過注射IL-1ra進行治療，成功減少了IL-1β表達，進而顯著降低了炎癥反應[14]。Pang等[15]的研究也表明，0.1 mg/kg的IL-1ra可以顯著減少由LPS誘導的成年大鼠的炎癥反應。這些研究結(jié)果說明IL-1ra可以通過阻斷IL-1信號通路保護細胞免受氧化損傷。因此推斷COS對PBMC氧化應激損傷的預保護作用可能與其降低了IL-1β的表達進而降低了NO的生成有關，但確切研究尚未見報道。為了進一步探究COS減緩奶牛PBMC氧化損傷機制是否與IL-1β有關，本文以LPS作為外源誘導劑，刺激細胞氧化應激，以IL-1ra阻斷IL-1β的生物學活性，探討COS對LPS誘導的奶牛PBMC氧化應激損傷的預保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PBMC通過采集奶牛外周血分離培養(yǎng)制備；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；COS購自濟南海得貝海洋生物工程有限公司，脫乙酰度90.27%，相對分子質(zhì)量<3 000；IL-1ra(貨號AF-480-SP)購自RD公司；臺盼藍、牛PBMC分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司；LPS購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國HyClone公司。

1.2 試劑配制

LPS工作液的配制方法：取1 mg LPS粉末溶于1 mL超純水中，配制成濃度為1 mg/mL的LPS一級母液，繼續(xù)用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋10倍配制成濃度為100 μg/mL的LPS二級母液。試驗開始前，吸取1 mL二級母液溶解于9 mL RPMI-1640培養(yǎng)基配制成終濃度為10 μg/mL的LPS工作液。

IL-1ra工作液的配制方法：取25 μg IL-1ra溶于250 μL高壓超純水中，配制成濃度為100 μg/mL的一級母液，繼續(xù)按照試驗要求用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋一級母液，配制成終濃度為1 ng/mL的IL-1ra工作液。

COS工作液的配制方法：準確稱取0.16 g COS溶解于10 mL高壓超純水中，配制成濃度為16 mg/mL的COS一級母液。將COS一級母液按照試驗要求用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，配制成終濃度為160 μg/mL的COS工作液。

上述LPS、IL-1ra、COS工作液均通過0.22 μm的過濾器過濾，并避光保存。

1.3 PBMC的分離與培養(yǎng)

本試驗采用單次密度梯度離心分離法培養(yǎng)PBMC，分離培養(yǎng)方法參照鄭亞光等[9]報道的方法進行。對健康奶牛尾靜脈采血后12 h內(nèi)進行PBMC分離，簡要步驟如下：將血液樣本緩慢加入到盛有牛PBMC分離液的離心管中，血液在上方，血液與分離液比例為1∶1，400×g離心40 min(離心機溫度要低于25 ℃，細胞獲得率高低與室溫有關，超過25 ℃時細胞獲得率降低)，離心后由上至下分為4層，依次為血漿層、環(huán)狀乳白色PBMC層、透明分離液層和紅細胞層。吸取PBMC層，并用PBS重懸清洗細胞，250×g離心10 min后棄上清，重復清洗細胞2次后，將細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)68 h后將250×g離心15 min后收集細胞進行后續(xù)試驗。在細胞培養(yǎng)結(jié)束前4 h取部分細胞用臺盼藍進行染色并計數(shù)活細胞數(shù)(應在95%以上)。

1.4 試驗設計

采用完全隨機試驗設計，將上述分離培養(yǎng)得到的PBMC以6×106個/mL的密度接種于24孔板中，并隨機分為8個組，每組6個重復。第1組為對照組(CON組，-COS-IL-1ra-LPS)，利用不含LPS、COS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞72 h；第2組為COS組(+COS-IL-1ra-LPS)，利用只含COS、不含LPS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞72 h；第3組為LPS組(-COS-IL-1ra+LPS)，先利用不含LPS、COS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48 h，后添加LPS工作液繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h；第4組IL-1ra組(-COS+IL-1ra-LPS)，先利用不含LPS、COS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞42 h，后添加IL-1ra工作液繼續(xù)培養(yǎng)細胞30 h；第5組COS+IL-1ra組(+COS+IL-1ra-LPS)，先利用只含COS工作液、不含LPS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞42 h，后添加IL-1ra工作液繼續(xù)培養(yǎng)細胞30 h；第6組COS+LPS組(+COS-IL-1ra+LPS)，先利用只含COS工作液、不含LPS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48 h，后添加LPS工作液繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h；第7組IL-1ra+LPS組(-COS+IL-1ra+LPS)，先利用不含LPS、COS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞42 h，后添加IL-1ra工作液培養(yǎng)細胞6 h，最后添加LPS工作液繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h；第8組COS+IL-1ra+LPS組(+COS+IL-1ra+LPS)，先利用只含COS工作液、不含LPS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞42 h，后添加IL-1ra工作液繼續(xù)培養(yǎng)細胞6 h，最后添加LPS工作液繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h。試驗設計詳見圖1。COS、LPS和IL-1ra工作液濃度參照本課題組前期研究結(jié)果分別確定為160 μg/mL、10 μg/mL和1 ng/mL，培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞和培養(yǎng)液，測定相關指標。

LPS：脂多糖 lipopolysaccharide；IL-1ra：白細胞介素-1受體拮抗劑 interleukin-1 receptor antagonist；COS：殼寡糖 chitosan。

1.5 樣品采集與處理

細胞培養(yǎng)液：將分離培養(yǎng)得到的PBMC以6×106個/mL的密度接種于96孔板中(200 μL/孔)，按照試驗設計要求處理結(jié)束后，反復吹打混勻每組的細胞培養(yǎng)液，分別收集到1.5 mL Eppendorf離心管中，4 ℃、1 000×g離心10 min，收集上清液用于NO、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量與iNOS、活性氧簇(ROS)、硫氧化蛋白還原酶(TrxR)活性和T-AOC的測定。

細胞裂解液：將分離培養(yǎng)得到的PBMC以6×106個/mL的密度接種于24孔板中(1.5 mL/孔)，按照試驗設計要求處理結(jié)束后，反復吹打混勻收集細胞懸浮液到1.5 mL Eppendorf離心管中，加1 mL PBS清洗2遍，加入細胞裂解液，置于4 ℃冰箱中裂解30 min，4 ℃、10 000×g離心10 min，收集上清液于新的離心管中，用于T-SOD、GPx、過氧化氫酶(CAT)活性和MDA含量的測定。

細胞RNA提取樣品：將分離培養(yǎng)得到的PBMC以6×106個/mL的密度接種于24孔板中(1.5 mL/孔)，按照試驗設計要求處理結(jié)束后，反復吹打混勻收集細胞懸浮液到1.5 mL Eppendorf離心管中，250×g離心10 min后棄上清，加1 mL PBS重懸細胞，離心棄上清，清洗2遍，加1 mL Trizol Plus于冰上反復吹打裂解細胞，用于后續(xù)RNA提取。

1.6 測定指標與方法

1.6.1 抗氧化指標、iNOS與ROS活性以及NO與炎癥因子含量

T-SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定、CAT活性采用比色法測定、GPx活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測定，T-AOC采用鉬酸銨顯色法測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量與iNOS、ROS、TrxR活性均采用雙抗體夾心法測定，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，試劑盒均購自R&D公司。

1.6.2 抗氧化酶、炎癥因子及核因子-κB(NF-κB)p65和核因子-E2相關因子2(Nrf2)的mRNA相對表達量

抗氧化酶TrxR和GPx1，炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS及Nrf2、NF-κBp65的mRNA相對表達量采用TB Green實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)進行測定。以18S、β-肌動蛋白(β-actin)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，對RT-qPCR的結(jié)果進行標準化，使用2-△△Ct計算目的基因的mRNA相對表達量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序?qū)λ刑幚磉M行顯著性檢驗和多重比較(Duncan氏法)。以P≤0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 抗氧化指標、iNOS與ROS活性以及NO與炎癥因子含量

由表1可知，與CON組相比，PBMC的GPx、T-SOD、CAT和TrxR活性及T-AOC在LPS組均顯著降低(P≤0.05)，而在COS組、COS+IL-1ra組均顯著升高(P≤0.05)，但COS組與COS+IL-1ra組、IL-1ra組與CON組之間無顯著差異(P>0.05)。與LPS組相比，IL-1ra+LPS組和COS+LPS組的上述抗氧化指標均顯著升高(P≤0.05)，但這些指標在IL-1ra+LPS組與COS+LPS組、COS+IL-1ra+LPS組與COS+LPS組間均無顯著差異(P>0.05)。

表1 COS和IL-1ra對LPS損傷的PBMC抗氧化酶指標、iNOS與ROS活性以及炎癥因子與NO含量的影響Table 1 Effects of COS and IL-1ra on antioxidant indexes, iNOS and ROS activities， inflammatory factors and NO contents in PBMC damaged by LPS

炎癥因子含量與上述抗氧化指標的變化規(guī)律呈相反的趨勢。與CON組相比，LPS組的IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高(P≤0.05)，COS組與IL-1ra組間上述指標均無顯著差異(P>0.05)。與LPS組相比，IL-1ra+LPS和COS+LPS組的上述指標均顯著降低(P≤0.05)，但IL-1ra+LPS組與COS+LPS組間無顯著差異(P>0.05)。COS+IL-1ra組與IL-1ra組相比，COS+IL-1ra+LPS組與COS+LPS組相比，上述指標均無顯著差異(P>0.05)。MDA和NO含量、iNOS和ROS活性的變化趨勢與上述指標呈相似的變化規(guī)律。

2.2 抗氧化酶、炎癥因子及NF-κB p65和Nrf2的mRNA相對表達量

由表2可知，與CON組相比，COS組GPx1和TrxR的mRNA相對表達量顯著升高(P≤0.05)，LPS組則顯著降低(P≤0.05)，而IL-1ra組與CON組間無顯著差異(P>0.05)。與LPS組相比，IL-1ra+LPS組和COS+LPS組GPx1和TrxR的mRNA相對表達量均顯著升高(P≤0.05)，而IL-1ra+LPS組與COS+LPS組間無顯著差異(P>0.05)。COS+IL-1ra+LPS組與COS+LPS組相比，上述基因的mRNA相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。與CON組相比，LPS組Nrf2的mRNA相對表達量顯著降低(P≤0.05)，但COS組、IL-1ra組無顯著變化(P>0.05)。與LPS組相比，IL-1ra+LPS組和COS+LPS組Nrf2的mRNA相對表達量均顯著升高(P≤0.05)，而IL-1ra+LPS組較COS+LPS組顯著降低(P≤0.05)。COS+IL-1ra組與IL-1ra組相比，Nrf2的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。COS+IL-1ra+LPS組與COS+LPS組相比，Nrf2的mRNA相對表達量顯著降低(P≤0.05)。

表2 COS和IL-1ra對LPS損傷的PBMC抗氧化酶、炎癥因子、NF-κB p65和Nrf2的mRNA相對表達量的影響Table 2 Effects of COS and IL-1ra on mRNA relative expression levels of antioxidant enzymes, inflammatory factors, NF-κB p65 and Nrf2 in PBMC damaged by LPS

炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA相對表達量與抗氧化酶呈相反的變化規(guī)律。與CON組相比，LPS組IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA相對表達量顯著升高(P≤0.05)，但COS組、IL-1ra組無顯著變化(P>0.05)。與LPS組相比，IL-1ra +LPS組、COS+LPS組上述基因的mRNA相對表達量顯著降低(P≤0.05)，但IL-1ra+LPS組與COS+LPS組間無顯著差異(P>0.05)。COS+IL-1ra組與IL-1ra組相比，COS+IL-1ra+LPS組與COS+LPS組相比，上述指標均無顯著差異(P>0.05)。NF-κBp65的mRNA相對表達量的變化與上述炎癥因子呈相似的變化規(guī)律。

3 討 論

3.1 COS對LPS誘導的奶牛PBMC氧化應激損傷具有減緩作用

抗氧化酶活性和炎癥因子含量的變化是反映細胞是否受到氧化損傷的重要指標[16]。在一定范圍內(nèi)，抗氧化酶活性越高，說明機體抗氧化能力越強；炎癥因子含量在一定范圍內(nèi)升高，免疫功能增強，但過度升高則表現(xiàn)為免疫功能紊亂，炎癥反應增強。LPS是一種來源于革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素，是IL-1β等炎癥介質(zhì)的誘導劑，例如，LPS會誘導鼠產(chǎn)生炎癥因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，進而引發(fā)機體發(fā)生氧化應激[13]。IL-1β等炎癥因子也刺激細胞中iNOS持續(xù)表達，進而使NO過量生成，使機體產(chǎn)生氧化應激[11]。研究表明，LPS可刺激奶牛乳腺上皮細胞中IL-1β含量顯著增加，進而導致氧化應激[17]。因此本試驗利用LPS在體外損傷模型中誘導IL-1β產(chǎn)生。COS是自然界中唯一天然存在的帶正電荷的堿性多糖，并因其強大的抗氧化能力可以作為天然的抗氧化劑。研究表明，給大鼠飼喂COS可以通過顯著提高抗氧化酶活性減緩由LPS引起的氧化損傷[18]。本試驗結(jié)果表明，LPS誘導了IL-1β等炎癥因子的釋放，引起iNOS的表達與NO含量的升高，因此降低了抗氧化酶的活性，升高了MDA含量，誘導了奶牛PBMC的氧化應激；COS逆轉(zhuǎn)了LPS引起的抗氧化酶活性及其基因表達的降低，即COS對LPS引起的奶牛PBMC氧化應激損傷具有緩解作用。

3.2 COS通過抑制IL-1β的生物學活性減緩LPS誘導的奶牛PBMC氧化應激損傷

IL-1是典型的促炎細胞因子，在先天免疫反應中起著重要作用，參與一些炎性疾病的發(fā)病機制[19]。在機體處于健康狀態(tài)下，IL-1在血液單核細胞中的含量很低或者不存在，但在疾病狀態(tài)下其含量顯著增加[20]。IL-1β是IL-1家族重要的促炎細胞因子，可誘導刺激iNOS的基因和蛋白大量表達，進而催化生成過量的NO[11]。IL-1β主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，還可以由中性粒細胞產(chǎn)生，可以被IL-1ra所拮抗[21]。IL-1ra已在臨床醫(yī)學上廣泛用于治療多種自發(fā)性免疫性疾病[12]。IL-1ra是第1個被發(fā)現(xiàn)的特異性抑制劑，它不能直接與IL-1結(jié)合，而是通過與IL-1R結(jié)合后具有很強的親和力，從而無法激活細胞活性，抑制IL-1的生物學活性[12]。本研究表明，IL-1ra單獨處理PBMC并未對細胞的抗氧化酶活性和炎癥因子含量產(chǎn)生顯著影響，說明其對PBMC沒有副作用。IL-1ra作為炎癥因子的受體拮抗劑，對新生大鼠由LPS引起的氧化應激和促炎效應有保護作用[14]。LPS可誘導PBMC發(fā)生氧化應激，細胞內(nèi)氧化還原遭到破壞，而抑制IL-1β的生物學活性對減緩細胞氧化損傷至關重要[4]。本研究得出了類似的結(jié)果，結(jié)果顯示，單一添加LPS誘導了IL-1β產(chǎn)生，引起iNOS活性以及NO含量升高，導致氧化應激，降低了抗氧化酶GPx、TrxR、SOD和CAT的活性及GPx1、TrxR的表達；但IL-1ra+LPS處理逆轉(zhuǎn)了上述指標的變化，減緩了細胞氧化應激的發(fā)生，進一步說明了IL-1β是LPS誘導細胞發(fā)生氧化應激的關鍵因素；與LPS處理相比，COS+LPS處理降低了IL-1β、NO含量以及iNOS活性，升高了抗氧化酶GPx、TrxR、SOD和CAT的活性及GPx1、TrxR的表達量，緩解了細胞的氧化應激損傷，說明COS處理與IL-1ra處理對LPS誘導的氧化應激損傷具有相似的預保護作用。因此，本試驗進一步得出，COS通過抑制IL-1β的生物學活性對LPS誘導的氧化應激損傷發(fā)揮預保護作用，進而減緩了氧化應激的發(fā)生。

研究指出，誘導NF-κB信號通路的活化可以促進下游基因iNOS以及炎癥因子的表達，進而導致NO等自由基大量釋放[10]。COS可以顯著抑制MIN6細胞中NF-κBp65的基因與蛋白的表達，降低iNOS的活性及其基因表達，抑制NO的生成[22]。在人乳腺癌細胞中的研究表明，GPx1可以抑制NF-κB的上游激酶核因子-κB抑制蛋白(IκB)，使NF-κB p65磷酸化[23]。蘇芮[24]研究報道，在奶牛乳腺上皮細胞中沉默GPx1基因的表達，會激活NF-κB信號通路，增加下游促炎細胞因子的活性及基因表達，刺激iNOS的活性及其基因表達與NO含量增加，使細胞抗氧化能力下降。石惠宇等[17]研究表明，通過激活Nrf2信號通路可增強奶牛乳腺上皮細胞GPx1基因的表達，進而顯著抑制NF-κB信號通路的活性。研究表明，激活的Nrf2增加其下游抗氧化系統(tǒng)中GPx、TrxR和SOD等基因表達，進而引起NF-κB信號通路磷酸化水平的降低，減少了自由基生成并減弱了脂質(zhì)過氧化反應程度，從而增加細胞的抗氧化功能[25]。本研究結(jié)果表明，LPS誘導奶牛PBMC氧化應激的同時，Nrf2及其靶基因GPx的活性降低，NF-κB p65及其下游炎癥因子IL-1β和iNOS基因的表達均上調(diào)，當添加COS或IL-1ra處理后會引起了上述指標呈相反的變化，提示COS可能通過上調(diào)Nrf2的活性，增強GPx活性，對NF-κB信號通路產(chǎn)生抑制作用，減少IL-1β的釋放，進而降低NO的生成，減緩細胞的氧化應激損傷。COS減緩LPS誘導的奶牛PBMC氧化應激損傷的作用機制如圖2所示。然而，目前相關研究甚少，確切機制有待進一步探討。

虛線代表需要進一步驗證的內(nèi)容?！?”代表促進作用，“-”代表抑制作用。The dotted lines represent content that requires further validation.“+” represents promotion, and “-” represents inhibition.

4 結(jié) 論

LPS誘導的奶牛PBMC氧化應激引起IL-1β含量增加，COS通過抑制NF-κB信號通路活性來減少IL-1β的釋放，進而降低NO的生成，從而發(fā)揮其減緩氧化應激損傷的功能。