唐文濤，李圣凱，王 昚，陳 龍，陳 卓

（1.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,分子科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,長沙410082；2.澳門大學(xué)科技學(xué)院,澳門999078）

痕量目標(biāo)分析物的特異性檢測(cè)在生化分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域具有重要意義［1~3］.目前，已開發(fā)出多種光譜技術(shù)用于痕量待測(cè)物的分析，其中表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）技術(shù)被認(rèn)為是最有前途的技術(shù)之一［4，5］.SERS技術(shù)具有眾多優(yōu)勢(shì)［6~8］：（1）能夠反映待測(cè)物內(nèi)在的分子指紋信息；（2）對(duì)待測(cè)樣品的損傷小，檢測(cè)靈敏度高，甚至可以實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)；（3）抗光漂白和抗碳化能力強(qiáng)；（4）基于拉曼光譜帶寬窄的特點(diǎn)，在單一波長光激發(fā)下能夠?qū)崿F(xiàn)多目標(biāo)物的分析；（5）水的拉曼散射信號(hào)極其微弱，不會(huì)造成大的背景干擾.根據(jù)電磁場(chǎng)增強(qiáng)機(jī)理，SERS信號(hào)強(qiáng)度與增強(qiáng)基底電磁場(chǎng)熱點(diǎn)附近的待測(cè)物分子數(shù)量呈正相關(guān)，因而實(shí)現(xiàn)SERS基底附近待測(cè)物分子的有效富集是實(shí)現(xiàn)痕量分析的關(guān)鍵［9，10］.

研究者開發(fā)了多種待測(cè)物分子的有效富集方法以實(shí)現(xiàn)靈敏的SERS分析，主要有靶標(biāo)誘導(dǎo)捕獲法［11~13］、超疏水界面誘導(dǎo)濃縮法［14~17］和吸附劑輔助濃縮法［18，19］.其中，靶標(biāo)誘導(dǎo)捕獲法需要特定的靶標(biāo)以選擇性地捕獲分子，但是引入的拉曼標(biāo)簽會(huì)造成背景干擾；超疏水界面誘導(dǎo)濃縮法利用不潤濕的底物來濃縮水溶性分析物，但是超疏水界面的構(gòu)建方法復(fù)雜且昂貴；而吸附劑輔助濃縮法在富集待測(cè)物時(shí)，使用的吸附劑會(huì)導(dǎo)致待測(cè)物難以靠近電磁場(chǎng)熱點(diǎn)附近.上述3種方法都屬于被動(dòng)的分子吸附方式，捕獲效率低且耗時(shí)長.近年發(fā)展起來的液滴蒸發(fā)自組裝濃縮法有利于主動(dòng)富集待測(cè)物，然而當(dāng)蒸發(fā)液滴濃縮到較小時(shí)會(huì)發(fā)生Cassie-Wenzel轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致“咖啡環(huán)效應(yīng)”［20~22］.因此，有必要提出一種能主動(dòng)高效富集待測(cè)物，同時(shí)能有效避免“咖啡環(huán)效應(yīng)”的策略，以實(shí)現(xiàn)痕量待測(cè)物的可靠SERS分析.

本文構(gòu)建了一種新的激光介導(dǎo)的待測(cè)物富集策略，實(shí)現(xiàn)了水溶液中9，10-雙苯乙炔基蒽（BPEA）分子的痕量SERS分析.基于石墨烯隔離的金納米晶（GIAN）顆粒良好的SERS性能以及能夠在水-二氯甲烷（DCM）兩相界面自組裝的特點(diǎn)，將少量GAIN顆粒和DCM加入到含有待測(cè)物BPEA的水溶液中并充分振蕩，在溶液底部形成含有GIAN顆粒的DCM小油滴.利用BPEA分子在DCM中的分配系數(shù)大于其在水中的分配系數(shù)以及富含π電子體系的GIAN外殼與BPEA的π-π相互作用［23，24］，在激光的照射下具有優(yōu)異的光熱升溫能力的GAIN［25］大量產(chǎn)熱使得小油滴上下往復(fù)運(yùn)動(dòng)，在34 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了BPEA分子的高效富集，最后通過SERS測(cè)試證明該策略能夠?qū)崿F(xiàn)痕量分析物的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)原理如Scheme 1所示.

Scheme 1 Mechanism of laser?mediated analyte enrichment and detection of BPEA

本文構(gòu)建的激光介導(dǎo)的痕量待測(cè)物富集策略的整個(gè)富集過程均在液相體系中進(jìn)行，在一定程度上避免了因“咖啡環(huán)效應(yīng)”帶來的SERS信號(hào)波動(dòng)，且利用GIAN位于拉曼靜默區(qū)（1800~2800 cm?1區(qū)間［7］）的特征峰作為內(nèi)標(biāo)可以提高拉曼定量分析的準(zhǔn)確性，因而在生化分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氣相SiO2購于上海麥克林生化科技有限公司；結(jié)晶紫（CV）、羅丹明6G（R6G）、孔雀石綠（MG）和羅丹明B（RhB）購于西格瑪奧德里奇生物試劑公司；9，10-雙苯乙炔基蒽（BPEA）購于上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O）和氫氧化鈉（NaOH）購于上海國藥試劑公司；氫氟酸（HF）、二氯甲烷（DCM）、環(huán)己烷（CH）、甲醇（MeOH）和乙酸乙酯（EA）均購于長沙化學(xué)試劑公司.所用試劑均為分析純且未經(jīng)處理直接使用；實(shí)驗(yàn)用水為電阻率18.2 MΩ·cm的二次蒸餾水（ddH2O）.

JEOL 2010型透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；Zeta sizer Nano ZS90型激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；inVia reflex型激光共聚焦拉曼光譜儀（英國雷尼紹公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 GIAN的合成參考文獻(xiàn)［25］報(bào)道的化學(xué)氣相沉積法制備石墨烯隔離的金納米晶（GIAN）.稱量1.0 g氣相SiO2加入到盛有80 mL甲醇的250 mL圓底燒瓶中，超聲1.5 h；加入6 mL 1%HAuCl4甲醇溶液和80 mL甲醇，繼續(xù)超聲0.5 h；通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除上述混合溶液中的甲醇，將獲得的淡黃色粉末置于45°C烘箱中干燥過夜；然后將干燥的粉末充分研磨，置于管式爐中進(jìn)行CVD生長（實(shí)驗(yàn)條件：加熱溫度為1000°C，升溫時(shí)間為50 min，恒溫時(shí)間為25 min，CH4和H2流量分別為150和20 cm3/min）；將得到的粗產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至HF中以刻蝕SiO2模板；最后用超純水將GIAN產(chǎn)物洗滌至中性，置于烘箱中干燥得到GIAN粉末.

1.2.2 GIAN的穩(wěn)定性測(cè)試分別稱量0.6 mg GIAN置于2 mL DCM，H2O，CH，MeOH和EA溶劑中浸泡0，3，6，12或24 h后，測(cè)量GIAN顆粒相應(yīng)的拉曼光譜（532 nm激光，強(qiáng)度為50 mW）.

1.2.3 GIAN的SERS效應(yīng)探究將不同濃度的CV和R6G與1 mg GIAN粉末共孵育30 min，然后將其轉(zhuǎn)移至載玻片上，自然風(fēng)干，最后測(cè)量相應(yīng)的拉曼光譜.

1.2.4 稱量瓶的處理將稱量瓶放置在0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡10 min，使其內(nèi)壁親水性增強(qiáng)，然后用ddH2O進(jìn)行多次洗滌，最后置于通風(fēng)處自然晾干.

1.2.5 “水包油”結(jié)構(gòu)SERS基底的構(gòu)建及運(yùn)動(dòng)能力探究將含有50 μg GIAN顆粒的50 μL DCM溶液加入到盛有15 mL ddH2O的稱量瓶中，充分振蕩10 min，靜置.將稱量瓶轉(zhuǎn)移至超聲儀中進(jìn)行超聲處理，并用相機(jī)記錄超聲前后溶液中小油滴的位置變化.

1.2.6 超聲介導(dǎo)的相界面待測(cè)物富集體系的構(gòu)建將含有50 μg GIAN顆粒的50 μL DCM溶液加入到盛有15 mL 100 nmol/L BPEA水溶液的稱量瓶中，充分振蕩10 min，靜置.將稱量瓶轉(zhuǎn)移至超聲儀中進(jìn)行超聲處理，用相機(jī)記錄超聲前后溶液中小油滴的顏色變化.

1.2.7 激光介導(dǎo)的相界面待測(cè)物富集與檢測(cè)體系的構(gòu)建將含有50 μg GIAN顆粒的50 μL DCM溶液加入到盛有15 mL不同濃度BPEA水溶液的稱量瓶中，充分振蕩10 min，靜置.用655 nm激光（強(qiáng)度為2 W/cm2）對(duì)準(zhǔn)油滴加熱34 min，用相機(jī)記錄超聲前后溶液中小油滴的顏色變化，最后將油滴轉(zhuǎn)移至載玻片表面，自然風(fēng)干后測(cè)量其拉曼光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 GIAN的表征

由圖1（A）所示透射電子顯微鏡（TEM）照片可見，GIAN的微觀形貌為球型，平均粒徑約為53 nm.從圖1（B）所示高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）照片可以觀察到GIAN內(nèi)部Au核外面包覆有少層石墨烯，石墨烯殼層厚度約為1.5 nm，晶格間距約為0.34 nm.如圖1（C）所示，GIAN的ζ電勢(shì)約為?4.76 mV.在圖1（D）所示紫外-可見吸收（UV-Vis）光譜圖中GIAN有2個(gè)特征吸收峰，其中位于~560 nm處的峰來源于內(nèi)部Au核的局域表面等離子體共振吸收，位于~265 nm處的峰來源于外層石墨烯殼的特征吸收.

Fig.1 TEM image(A)and HRTEM image(B)of GIAN,zeta potential(C)and UV?Vis spectrum(D)of GIAN aqueous solution

2.2 GIAN的穩(wěn)定性

如圖2（A）所示，GIAN顆粒有3個(gè)來源于石墨烯外殼的拉曼散射特征峰，分別為D（1350 cm?1），G（1590 cm?1）和2D（2700 cm?1）峰，與前文報(bào)道結(jié)果一致［26，27］.為了進(jìn)一步探究GIAN顆粒在不同溶劑中的穩(wěn)定性，將GIAN顆粒分別在DCM，H2O，CH，MeOH和EA中浸泡0，3，6，12和24 h，然后分別測(cè)量其拉曼光譜.如圖2（B）所示，GIAN顆粒在不同溶液中浸泡不同時(shí)間，其2D峰強(qiáng)度始終無明顯變化，證明GIAN在不同有機(jī)溶劑中具有優(yōu)異的穩(wěn)定性.

Fig.2 Stability study of GIAN

2.3 GIAN的SERS效應(yīng)

分別以CV和R6G為模型分子，探究了GIAN作為SERS基底的增強(qiáng)效果.如圖3所示，100 μmol/L CV，1 mmol/L R6G，10 μmol/L MG和1 mmol/L RhB水溶液的本征拉曼信號(hào)非常微弱，而1 μmol/L CV，10 μmol/L R6G，1 μmol/L MG和10 μmol/L RhB在GIAN基底的作用下均檢測(cè)到非常強(qiáng)的SERS信號(hào).上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GIAN顆粒具有良好的SERS效應(yīng)，能夠作為良好的SERS分析平臺(tái).

Fig.3 Raman spectra of CV(A),R6G(B),MG(C)and RhB(D)with or without GIAN incubation under 633 nm(17 mW)laser excitation

2.4 GIAN的液-液界面自組裝

如圖4（A）~（C）所示，未經(jīng)任何修飾的GIAN沉積于盛有H2O和有機(jī)溶劑的玻璃瓶底部，說明GIAN在H2O和有機(jī)溶劑中的溶解度有限.然而，GIAN能夠自發(fā)地組裝于H2O和有機(jī)溶劑兩相界面處，這可能因?yàn)镠2O和有機(jī)溶劑界面處的界面能很低且熱波動(dòng)與自由能之間相對(duì)平衡，從而促使GIAN在兩相界面處自組裝［28，29］.如圖4（D）和（E1）所示，本工作構(gòu)建的“水包油”體系中形成的小油滴沉于稱量瓶的底部，然后將構(gòu)建的“水包油”體系進(jìn)行超聲處理（實(shí)驗(yàn)步驟見1.2.5節(jié)）.由于超聲波空化作用，小油滴附近產(chǎn)生氣泡，油滴的浮力變大從而向上移動(dòng)［圖4（E2）］，超聲停止一段時(shí)間后油滴再次下沉，循環(huán)往復(fù)數(shù)次后小油滴的體積縮?。蹐D4（E3）］，說明在超聲作用下有部分DCM揮發(fā).此外，由于稱量瓶經(jīng)NaOH溶液處理后其內(nèi)壁親水性較好，小油滴不會(huì)黏附在瓶底和瓶壁，從而不會(huì)阻礙小油滴的運(yùn)動(dòng).上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文構(gòu)建的“水包油”體系在外力作用下能夠自由移動(dòng)并促使小油滴濃縮，基于GIAN優(yōu)異的SERS效應(yīng)，有望構(gòu)建高效的待測(cè)物濃縮體系以實(shí)現(xiàn)靈敏的SERS分析.

Fig.4 Self?assembly of GIAN in immiscible two?phase interfaces

2.5 激光介導(dǎo)的待測(cè)物富集與檢測(cè)體系的構(gòu)建

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲有助于“水包油”體系中小油滴的濃縮，以微溶于水的BPEA分子為模型，進(jìn)一步探究了該策略的富集效率（實(shí)驗(yàn)步驟見1.2.6節(jié)）.實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，小油滴附近產(chǎn)生氣泡且上下往復(fù)運(yùn)動(dòng)，超聲130 min后無色的小油滴濃縮成極其微小的黃綠色油滴（圖5），證明小油滴能夠富集BPEA，且GIAN密集分布在油滴表面，沒有產(chǎn)生明顯的咖啡環(huán)效應(yīng).然而，這一通過超聲富集BPEA的方法耗時(shí)太長，在實(shí)際的分析檢測(cè)中可行性較差.

Fig.5 Enrichment of BPEA in oil?in?water treated with ultrasound

前文［25］已報(bào)道GIAN具有良好的光熱轉(zhuǎn)換效果，且熱能夠加速分子的運(yùn)動(dòng).后續(xù)實(shí)驗(yàn)利用激光誘導(dǎo)油滴內(nèi)部的GIAN顆粒升溫（實(shí)驗(yàn)步驟見1.2.6節(jié)）.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小油滴的運(yùn)動(dòng)狀況與超聲處理相類似，小油滴附近產(chǎn)生氣泡并上下往復(fù)運(yùn)動(dòng)，隨著時(shí)間的延長小油滴的體積縮小，且在34 min后無色的小油滴濃縮成極其微小的黃綠色油滴（圖6），說明激光加熱的方式對(duì)BPEA的富集效率高于超聲處理.我們推測(cè)導(dǎo)致上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能原因如下：BPEA分子在DCM中的分配系數(shù)大于其在H2O中的分配系數(shù)，富含π電子體系的GIAN外殼能夠通過π?π相互作用與BPEA結(jié)合，激光介導(dǎo)GAIN產(chǎn)生大量的熱使得油滴快速地上下往復(fù)運(yùn)動(dòng)，并伴隨著部分DCM的蒸發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)BPEA分子的高效富集和濃縮.

Fig.6 Enrichment of BPEA in oil?in?water under laser irradiation

通過拉曼測(cè)試進(jìn)一步證實(shí)了激光介導(dǎo)的高效富集效率.如圖7（A）所示，未觀察到單獨(dú)BPEA以及BPEA/GIAN混合體系的拉曼信號(hào)；而BPEA/GIAN混合體系經(jīng)激光照射后，可明顯觀察到位于2180 cm?1處（紅色方框標(biāo)注）的拉曼散射特征峰，此峰來源于BPEA分子中C≡C的伸縮振動(dòng)，證明激光加熱的方式能夠提高SERS分析的靈敏度.基于此，進(jìn)一步利用構(gòu)建的富集方法實(shí)現(xiàn)了BPEA分子的定量分析.如圖7（B）和（C）所示，BPEA在30~1000 nmol/L范圍內(nèi)與其拉曼強(qiáng)度呈一定的線性關(guān)系，其檢出限低至10 nmol/L.值得注意的是，利用GIAN位于拉曼靜默區(qū)的2D峰作為內(nèi)標(biāo)時(shí)［圖7（C）］，相關(guān)系數(shù)由0.739提升至0.975，這充分說明利用內(nèi)標(biāo)可以提高拉曼定量分析的準(zhǔn)確性.此外，本工作構(gòu)建的富集方法具有優(yōu)異的重現(xiàn)性（見圖8），在實(shí)際的SERS分析應(yīng)用中具有一定的應(yīng)用潛力.

Fig.7 Laser?mediated enrichment and detection of analytes

Fig.8 Reproducibility of the laser?mediated enrichment strategy

3 結(jié) 論

基于兼具有光熱和SERS效應(yīng)的GIAN顆粒能夠在H2O-DCM兩相界面自組裝的特點(diǎn)，構(gòu)建了激光介導(dǎo)的待測(cè)物富集策略，實(shí)現(xiàn)了微溶于水的BPEA分子的痕量SERS分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激光介導(dǎo)策略實(shí)現(xiàn)了BPEA的有效富集，因?yàn)锽PEA分子在DCM中的分配系數(shù)大于其在H2O中的分配系數(shù)，GIAN能夠通過π?π相互作用與BPEA結(jié)合以及在激光的照射下GAIN大量產(chǎn)熱使得油滴上下往復(fù)運(yùn)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)BPEA分子的高效富集.SERS分析結(jié)果表明，利用此富集策略可實(shí)現(xiàn)100 nmol/L BPEA的檢測(cè)，而將同濃度的BPEA分子與GIAN直接混合則檢測(cè)不到任何信號(hào).基于此，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了BPEA的定量分析檢測(cè)，利用GIAN位于拉曼靜默區(qū)的2D峰作為內(nèi)標(biāo)提高了拉曼定量分析的準(zhǔn)確性，且證實(shí)了該富集方法具有良好的重現(xiàn)性.值得一提的是，同一體系中通過超聲的方式介導(dǎo)BPEA的富集需用時(shí)130 min，遠(yuǎn)高于本工作構(gòu)建的激光介導(dǎo)的富集方法.此外，本工作構(gòu)建的激光介導(dǎo)的富集方式在一定程度上避免了因“咖啡環(huán)效應(yīng)”帶來的信號(hào)波動(dòng)，有望實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中痕量分析物的高效富集與靈敏的SERS檢測(cè).