丁 鑫，師紅東，劉揚(yáng)中

（1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院化學(xué)系,合肥230026；2.深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,深圳518060）

癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命健康的主要疾病之一，跟據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥報告預(yù)估，全球每年新增癌癥患者1929萬例，因癌癥死亡996萬例，而我國每年新增457萬例，因癌癥死亡300萬例［1］.在這些死亡病例中，超過90%患者是由于腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡［2，3］，而目前治療腫瘤的化療藥物主要是針對原發(fā)性腫瘤，對轉(zhuǎn)移病灶治療效果較弱，這些藥物雖然能夠一定程度抑制腫瘤生長，但對于患者生存期沒有顯著提高，因此開發(fā)具有優(yōu)異抗腫瘤轉(zhuǎn)移效果的藥物，才能夠有效增長患者生存期，對癌癥治療具有重要意義［4~6］.

目前，已有超過500多種相關(guān)抗腫瘤轉(zhuǎn)移試劑被研究報道，研究最多的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物主要包括血管增生抑制劑和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑兩類，美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于臨床的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物也屬于這兩類.然而，這些抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物由于無選擇性的分子抑制和對患者生存期無顯著提高，特別對于晚期患者幾乎沒有療效，導(dǎo)致目前使用的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移效果較弱［7，8］，因此新型高效抗腫瘤轉(zhuǎn)移試劑的研發(fā)迫在眉睫.［ImH］［trans-RuCl4（DMSO）（Im）］（NAMI-A）是咪唑和二甲基亞砜配位的Ru（Ⅲ）配合物，因其具有低的毒副作用和優(yōu)異的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，被廣泛用于科研臨床抗腫瘤研究［9，10］，然而由于沒有顯著改善患者生存期而在二期臨床試驗(yàn)階段被淘汰，但其優(yōu)異的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用仍被廣泛研究.NAMI-A在生理環(huán)境下不穩(wěn)定，易發(fā)生水解和被體內(nèi)還原劑還原，其水解產(chǎn)物易與血清蛋白等體內(nèi)分子反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)NAMI-A與血清蛋白的反應(yīng)產(chǎn)物仍具有良好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用［11，12］.

全反式維甲酸（ATRA）是維生素A酸在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，能夠促進(jìn)細(xì)胞分化，具有低毒性，并可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的可塑性和運(yùn)動性，具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，被廣泛用于鱗狀細(xì)胞癌及黑色素瘤等癌癥治療［13］；然而ATRA具有水溶性低（生理?xiàng)l件下只有0.21 μmol/L）、穩(wěn)定性較差和半衰期短等缺陷，極大限制其了應(yīng)用［14，15］.目前，常采用納米載體運(yùn)輸增加其水溶性和穩(wěn)定性，顯著增加了其體內(nèi)循環(huán)時間，而且因?qū)嶓w瘤的高通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)），納米藥物可被動靶向富集到腫瘤組織［16，17］，迄今已有使用脂質(zhì)體、聚合物和人血清蛋白納米顆粒負(fù)載ATRA用于癌癥治療的相關(guān)報道［18~21］.

人血清蛋白（HSA）是血漿中含量最多的蛋白（35~50 g/L），因其具有疏水性結(jié)構(gòu)域，在體內(nèi)常用于疏水性分子運(yùn)輸，HSA表現(xiàn)出高度的水溶性、穩(wěn)定性、生物安全性和可降解性，被廣泛用作藥物運(yùn)輸載體［22，23］.

本文使用HSA納米顆粒共運(yùn)輸Ru（Ⅲ）和ATRA，構(gòu)建了可用于抗腫瘤轉(zhuǎn)移的納米藥物.在生理?xiàng)l件下，NAMI-A中的氯、DMSO和咪唑配體逐漸解離，然后與HSA氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)，而RuCl4（DMSO）2更易水解，其水解產(chǎn)物和NAMI-A水解產(chǎn)物類似，也能與HSA反應(yīng)［11，12，24］.因此，通過去溶劑法制備HSA納米顆粒時，加入RuCl4（DMSO）2和ATRA，RuCl4（DMSO）2水解后與HSA反應(yīng)，一方面使Ru（Ⅲ）負(fù)載到HSA上，另一方面Ru（Ⅲ）共價鍵結(jié)合HSA，可以充當(dāng)交聯(lián)劑以穩(wěn)定HSA納米顆粒；同時ATRA通過納米顆粒的包覆作用及負(fù)載到HSA疏水結(jié)構(gòu)域中，穩(wěn)定地負(fù)載到HSA納米顆粒中，從而制備出Ru（Ⅲ）和ATRA共運(yùn)輸?shù)腍SA納米顆粒.通過Ru（Ⅲ）和ATRA的雙重抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，得到了具有高效抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的納米藥物.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及儀器

三氯化釕水合物（RuCl3·3H2O）、全反式維甲酸（ATRA）、人血清白蛋白（HSA）、戊二醛、二氯亞砜（DMSO）和氫氧化鈉購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；異硫氰酸熒光素（FITC）和噻唑藍(lán)（MTT）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和雙抗試劑購自Hyclone公司；所用試劑均為分析純.

BIO-RAD imark型酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）；NexIon300X型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，美國Perkin Elmer公司；IX73P2F型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；FS5型熒光光譜儀（英國Edinburgh Instruments有限公司；UV-8000S型紫外分光光度計(jì)（中國上海元析儀器有限公司）；CytoFLEX型流式細(xì)胞分析儀（美國貝克曼）；JEM-F200型場發(fā)射透射電子顯微鏡（TEM，日本JEOL公司）；JSM-7800F型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，日本JEOL公司）.

1.2 RuCl4(dmso)2的制備

參照文獻(xiàn)［25］方法制備RuCl4（DMSO）2.將200 mg RuCl3·3H2O分散于6 mL乙醇中，于80°C回流攪拌3 h，冷卻至室溫，抽濾去除不溶物.將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10，然后加入200 μL HCl（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%）和400 μL DMSO，于80°C回流攪拌15 min，冷卻至室溫，加入冷丙酮溶液，產(chǎn)生橙紅色沉淀，抽濾得到沉淀.將沉淀依次用冷丙酮和乙醚洗滌，干燥得到RuCl4（dmso）2.

1.3 Ru-ATRA-HSANP的制備

參照文獻(xiàn)［26］方法，采用去溶劑法合成Ru-ATRA-HSANP1-2［n（Ru）∶n（ATRA）=1∶2］.在800 μL HSA溶液（20 mg/mL）中加入100 μL RuCl4（DMSO）2溶液（20 mmol/L），混合均勻，然后加入18 μL NaOH溶液（1 mol/L），攪拌均勻，加入400 μL ATRA乙醇溶液（10 mmol/L），然后加入1.74 mL乙醇，室溫下攪拌反應(yīng)4 h以上，以15000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，去除上層清液，得到納米顆粒.將所得顆粒超聲分散于1 mL水中，再次離心洗滌，最終將顆粒分散于1 mL水中，得到Ru-ATRA-HSANP1-2.

采用相同方法，改變Ru和ATRA的用量合成Ru-ATRA-HSANP1-1和Ru-ATRA-HSANP1-4顆粒.

在800 μL HSA溶液（20 mg/mL）中加入100 μL RuCl4（DMSO）2溶液（20 mmol/L），混合均勻，然后加入18 μL NaOH溶液（1 mol/L），攪拌均勻后加入4 mL乙醇，室溫下攪拌4 h以上，以15000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，去除上層清液，得到納米顆粒.將所得顆粒超聲分散于1 mL水中，再次離心洗滌，最終將顆粒分散于1 mL水中，得到Ru-HSANP顆粒，作為對照.

在800 μL HSA溶液（20 mg/mL）中加入9 μL NaOH溶液（1 mol/L），攪拌均勻，加入400 μL ATRA的乙醇溶液（10 mmol/L），再加入2 mL乙醇，攪拌15 min后加入10 μL戊二醛溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%），室溫下攪拌4 h以上，以15000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，去除上層清液，得到納米顆粒.將所得顆粒超聲分散于1 mL水中，再次離心洗滌，最終將顆粒分散于1 mL水中，得到ATRA-HSANP顆粒，作為對照.

1.4 顆粒藥物濃度的測定

通過紫外分光光型計(jì)檢測了ATRA-HSANP和Ru-ATRA-HSANP中ATRA的濃度.首先測定ATRA在350 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算出制備顆粒時2次離心產(chǎn)生的上層清液中殘留的ATRA摩爾量（n殘留，μmol），通過制備顆粒時加入的ATRA總摩爾量（n總量，μmol）減去n殘留，得到顆粒中的ATRA含量（n，μmol），即n=n總量?n殘留，測量顆粒溶液的總體積V（L），即可計(jì)算出顆粒中的ATRA濃度cATRA=n/V.

利用ICP-MS測定了Ru-HSANP和Ru-ATRA-HSANP中Ru的濃度.取50 μL顆粒，用王水加熱處理，蒸干溶液，殘留物加入超純水溶解，定容到5 mL，用ICP-MS測定其中的Ru濃度，經(jīng)計(jì)算得到顆粒中Ru的濃度.

1.5 Ru-ATRA-HSANP穩(wěn)定性研究

將100 μL Ru-ATRA-HSANP顆粒加入到含有體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的DMEM中，采用動態(tài)光散射法監(jiān)測顆粒粒徑隨時間的變化.

1.6 Ru-ATRA-HSANP細(xì)胞攝取研究

首先使用FITC標(biāo)記Ru-ATRA-HSANP1-2顆粒，即在制備Ru-ATRA-HSANP時，將HSA先與FITC攪拌反應(yīng)30 min，再加入其它試劑制備顆粒，將顆粒離心水洗后得到FITC-Ru-ATRA-HSANP1-2顆粒.將HeLa細(xì)胞以800 cell/孔接種到48孔板中，培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度的FITC-Ru-ATRA-HSANP1-2（Ru：10，20，30和40 μmol/L）孵育8 h，或在相同顆粒濃度下（Ru：30 μmol/L）孵育不同時間（2，4，6和8 h），通過流式細(xì)胞儀檢測顆粒在細(xì)胞中的攝取情況，同時用熒光顯微鏡拍攝不同孵育時間（1，2，4和8 h）下FITC-Ru-ATRA-HSANP1-2（Ru：30 μmol/L）的細(xì)胞熒光成像，觀察顆粒的細(xì)胞攝取情況.

1.7 Ru-ATRA-HSANP細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將A549細(xì)胞以3000 cell/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)過夜，細(xì)胞用不同濃度的藥物（Ru，ATRA，Ru-HSANP，ATRA-HSANP和Ru-ATRA-HSANP1-2）孵育，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入25 μL 5 mg/mL的MTT試劑，繼續(xù)孵育4 h，去除培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上振蕩15 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸收值，處理數(shù)據(jù)后得到細(xì)胞存活率曲線.

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)

將4T1細(xì)胞以2×105cell/孔接種到6孔板中培養(yǎng)24 h，用10 μL槍頭劃痕，輕微吹打去除懸浮細(xì)胞，換上新鮮培養(yǎng)基，分別加入ATRA（10 μmol/L），Ru-HSANP（10 μmol/L），ATRA-HSANP（10μmol/L），Ru-ATRA-HSANP1-2（Ru：10 μmol/L，ATRA：15 μmol/L）和Ru-ATRA-HSANP1-4（Ru：10 μmol/L，ATRA：30 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，通過熒光顯微鏡拍攝劃痕愈合情況.

2 結(jié)果與討論

2.1 合成與表征

采用去溶劑法制備HSA納米顆粒，該方法是在HSA溶液中加入乙醇，由于HSA在乙醇中不溶，加入乙醇能使HSA蛋白聚集成顆粒，可以通過控制溶液pH值和鹽濃度等調(diào)控蛋白質(zhì)顆粒的大小，此時形成的蛋白質(zhì)顆粒是由于乙醇所致，蛋白質(zhì)分子間不形成共價鍵，在水中會再次解離成蛋白質(zhì)分子，因此加入乙醇形成蛋白質(zhì)顆粒后需要加入交聯(lián)劑以交聯(lián)蛋白質(zhì)分子，形成共價鍵穩(wěn)定的HSA納米顆粒，實(shí)驗(yàn)中通過Ru（Ⅲ）和HSA表面基團(tuán)反應(yīng)來交聯(lián)蛋白質(zhì)顆粒，形成穩(wěn)定的Ru-HSANP和Ru-ATRAHSANP顆粒.圖1（A）和（B）給出Ru-ATRA-HSANP1-2的TEM和SEM圖片，可見Ru-ATRA-HSANP1-2呈粒徑為（80±20）nm的球狀結(jié)構(gòu)，動態(tài)光散射檢測其平均水合粒徑為100 nm［圖1（C）］，ζ電勢為?24 mV.實(shí) 驗(yàn) 中 制 備 了Ru-HSANP，ATRA-HSANP，Ru-ATRA-HSANP1-1，Ru-ATRA-HSANP1-2和Ru-ATRAHSANP1-4顆粒，圖1（D）給出其水溶液照片，可見含有Ru的顆粒溶液顯示棕色，含有ATRA的顆粒溶液顯示黃色，這些顆粒在水中均勻分散，長時間穩(wěn)定.圖1（E）給出Ru-HSANP，ATRA-HSANP，Ru-ATRA-HSANP1-1，Ru-ATRA-HSANP1-2和Ru-ATRA-HSANP1-4顆粒的水合粒徑，可見5種顆粒的水合粒徑為別為75，85，97，100和130 nm，隨著ATRA加入量增加，顆粒粒徑增大.圖1（F）給出DMEM/FBS中Ru-ATRA-HSANP1-2顆粒粒徑隨時間的變化情況，可見72 h內(nèi)顆粒粒徑變化很小，說明顆粒在生理?xiàng)l件下具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，DMEM/FBS常用于細(xì)胞培養(yǎng)基溶液和模擬血漿環(huán)境，顆粒在DMEM/FBS中穩(wěn)定說明顆?？捎糜谏矬w內(nèi)藥物運(yùn)輸.

Fig.1 Characterization of Ru?ATRA?HSANP

2.2 Ru-ATRA-HSANP1-2細(xì)胞攝取研究

用FITC標(biāo)記Ru-ATRA-HSANP1-2顆粒，通過熒光光譜儀檢測FITC是否成功標(biāo)記到顆粒上，結(jié)果如圖2（A）所示，通過495 nm光激發(fā)，可以檢測到FITC-Ru-ATRA-HSANP1-2顆粒在525 nm處有熒光發(fā)射，而Ru-ATRA-HSANP1-2顆粒則無熒光，說明FITC已標(biāo)記到顆粒上.

Fig.2 Cellular uptake of Ru?ATRA?HSANP1-2

通過流式細(xì)胞儀檢測了不同濃度和不同孵育時間下FITC-Ru-ATRA-HSANP1-2顆粒在HeLa細(xì)胞中的攝?。蹐D2（B）和（C）］，可見隨著顆粒濃度增加和孵育時間的增長，顆粒在細(xì)胞中的攝取逐漸增加，說明FITC-Ru-ATRA-HSANP1-2可以有效被細(xì)胞攝取.通過熒光顯微鏡檢測了FITC-Ru-ATRA-HSANP1-2顆粒在細(xì)胞中的攝?。蹐D2（D）］，可見隨著孵育時間的增長，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光逐漸增強(qiáng)，說明該顆?？梢杂行П患?xì)胞攝取，且攝取量隨著時間增加而增大.攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Ru-ATRA-HSANP1-2可有效用于細(xì)胞內(nèi)藥物運(yùn)輸.

2.3 Ru-ATRA-HSANP1-2細(xì)胞毒性研究

利用MTT試劑檢測了RuCl4（DMSO）2，ATRA，Ru-HSANP，ATRA-HSANP和Ru-ATRA-HSANP1-2對A549細(xì)胞的毒性（圖3）.由圖3可見，RuCl4（DMSO）2直接加入DMEM/FBS培養(yǎng)基中會發(fā)生水解與FBS反應(yīng)，幾乎沒有細(xì)胞毒性；載體HSANP幾乎無細(xì)胞毒性［圖3（C）］，說明HSANP載體具有優(yōu)異的生物相容性；而Ru-HSANP具有微弱的細(xì)胞毒性，同時負(fù)載了Ru和ATRA的Ru-ATRA-HSANP1-2具有一定的細(xì)胞毒性（IC50＞100 μmol/L），其毒性與ATRA-HSANP相當(dāng)，說明Ru-ATRA-HSANP1-2的細(xì)胞毒性主要受ATRA影響.由圖3（B）可見，ATRA-HSANP和Ru-ATRA-HSANP1-2的細(xì)胞毒性比ATRA弱，說明該納米藥物可進(jìn)一步減弱ATRA的毒性，且可以通過HSANP負(fù)載有效提高ATRA的水溶性和穩(wěn)定性，更有利于生物體系應(yīng)用.實(shí)驗(yàn)檢測了Ru-ATRA-HSANP1-2對肝正常細(xì)胞LO2的細(xì)胞毒性［圖3（D）和（E）］，可見Ru-ATRA-HSANP1-2對LO2具有更低的細(xì)胞毒性，說明該納米藥物對正常細(xì)胞的毒性更低，是理想的納米藥物.

Fig.3 Inhibition effect of Ru?ATRA?HSANP1-2 on A549（A—C)and L02 cells(D—E)

2.4 Ru?ATRA?HSANP1-2抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用研究

使用具有高轉(zhuǎn)移的乳腺癌4T1細(xì)胞，通過劃痕實(shí)驗(yàn)研究了ATRA，Ru-HSANP，ATRA-HSANP，Ru-ATRA-HSANP1-2和Ru-ATRA-HSANP1-4的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用.由圖4可見，無藥物處理時劃痕在48 h后會鋪滿細(xì)胞：經(jīng)Ru-HSANP處理的細(xì)胞其劃痕間隔會縮小，但仍沒有愈合，說明Ru-HSANP具有一定的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，但效果較弱；ATRA表現(xiàn)出優(yōu)異的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，細(xì)胞沒有向劃痕方向生長；負(fù)載了ATRA的ATRA-HSANP，Ru-ATRA-HSANP1-2和Ru-ATRA-HSANP1-4顆粒都具有優(yōu)異的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，細(xì)胞劃痕不愈合.以上結(jié)果說明通過Ru交聯(lián)且ATRA負(fù)載的HSA納米顆粒（Ru-ATRA-HSANP）具有優(yōu)異的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，可作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移試劑.

Fig.4 The results of wound?healing assay of 4T1 cells treated without(A)and with Ru?HSANP(B),ATRA(C),ATRA?HSANP(D),Ru?ATRA?HSANP1-2(E)and Ru?ATRA?HSANP1-4(F)

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)合成了一種以HSANP為載體的Ru（Ⅲ）和ATRA共運(yùn)輸體系，得到低毒性具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的納米藥物（Ru-ATRA-HSANP）.通過去溶劑法，一步合成了Ru（Ⅲ）交聯(lián)HSA及ATRA負(fù)載的穩(wěn)定納米藥物，該納米顆粒尺寸合適（約80 nm）且在水中和生理?xiàng)l件下具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，適用于生物體系應(yīng)用；Ru-ATRA-HSANP可以有效被細(xì)胞攝取，且攝取量隨顆粒濃度增加和孵育時間增長而增加，Ru-ATRA-HSANP表現(xiàn)出較弱的細(xì)胞毒性（IC50＞100 μmol/L），但其具有優(yōu)異的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用.因此，本文構(gòu)建了一種穩(wěn)定低毒的抗腫瘤轉(zhuǎn)移納米藥物，有望用于腫瘤抗轉(zhuǎn)移治療.