劉浩瀚，江 帆，許諾然，徐 華，華 龍，朱 玉

(皖南醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

癌癥作為一種疾病，病死率高，預(yù)后差，在全世界范圍造成巨大的健康和經(jīng)濟(jì)損失。肝癌作為癌癥相關(guān)死亡的第二大原因嚴(yán)重影響世界人民的健康[1]，我國(guó)肝細(xì)胞癌每年新發(fā)病例數(shù)、死亡數(shù)分別占全球54.6%、53.9%[2]。目前，對(duì)肝癌的致病原因仍然處于探索階段，研究結(jié)果表明肝癌是基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。在我國(guó)，與肝癌密切相關(guān)的原因有很多，包括乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、長(zhǎng)期酗酒、非酒精脂肪性肝病、進(jìn)食黃曲霉毒素B1污染的食物、肝硬化等[3]。肝癌的預(yù)后效果也并不樂(lè)觀，3年生存率為12.7%，中位生存期僅為9個(gè)月[4]。但隨著二代測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，更多的基因功能及信號(hào)通路被挖掘，為探究肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)，基因在肝癌中的預(yù)后研究也為臨床實(shí)驗(yàn)提供方向。

本研究利用生物信息學(xué)方法，通過(guò)對(duì)公共癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)(The Cancer Genome Atlas，TCGA)的RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)及病人臨床病理信息處理，探索人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒組MER61成員1(LncRNA ERVMER61-1)的功能，LncRNA ERVMER61-1與核糖核苷酸還原酶調(diào)節(jié)亞基M2(ribonucleotide reductase regulatory subunit M2,RRM2)在肝癌中的表達(dá)狀況、共表達(dá)關(guān)系以及預(yù)后作用，并探索LncRNA ERVMER61-1與RRM2在不同肝癌患者中表達(dá)特征以及對(duì)肝癌患者預(yù)后的價(jià)值，為探索抗腫瘤治療提供新的預(yù)后標(biāo)志物及潛在靶點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 資料來(lái)源 利用官方提供的gdc-client軟件從TCGA下載肝癌組織樣本和對(duì)照組織樣本的RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)及患者臨床病理信息，通過(guò)生物信息學(xué)方法處理數(shù)據(jù)。得到數(shù)據(jù)包含共有371例肝癌患者，其中319例患者提供了一份癌組織，50例患者提供了一對(duì)癌與癌旁組織，1例患者提供了一份癌組織和兩份復(fù)發(fā)癌組織，1例患者提供了一份癌組織和一份復(fù)發(fā)組織，用于后續(xù)分析。數(shù)據(jù)截止日期為2019年8月19日。

1.2 研究方法 對(duì)之前已得肝癌的臨床數(shù)據(jù)整理，并從基因表達(dá)譜中提取LncRNA ERVMER61-1和RRM2表達(dá)量，基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。利用標(biāo)化后的50對(duì)癌與癌旁組織數(shù)據(jù)，分析LncRNA ERVMER61-1和RRM2基因表達(dá)差異情況，利用371例癌組織數(shù)據(jù)分析LncRNA ERVMER61-1和RRM2共表達(dá)情況以及對(duì)患者預(yù)后的影響。使用K-M曲線法通過(guò)“survminer”包繪制RRM2和LncRNA ERVMER61-1的生存曲線，觀察分析RRM2以及LncRNA ERVMER61-1和肝癌的預(yù)后生存關(guān)系。使用R軟件“clusterProfiler”包對(duì)LncRNA ERVMER61-1共表達(dá)的基因做基因本體(geneontology，GO)富集分析,以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)得到LncRNA ERVMER61-1共表達(dá)基因的相關(guān)功能。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)分析和繪圖均在R 3.6.1中完成。肝癌與癌旁組織中LncRNA ERVMER61-1和RRM2表達(dá)差異分析采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，肝癌組織LncRNA ERVMER61-1和RRM2共表達(dá)分析采用Pearson直線相關(guān)分析，LncRNA ERVMER61-1和RRM2對(duì)患者預(yù)后分析采用單因素以及多因素Cox回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA ERVMER61-1和RRM2在肝癌組織中表達(dá)水平上調(diào) 通過(guò)對(duì)TCGA中得到的50例包含一對(duì)癌與癌旁組織患者中LncRNA ERVMER61-1和RRM2基因表達(dá)含量的分析(圖1)，結(jié)果表明LncRNA ERVMER61-1在肝癌組織中高表達(dá)，且與癌旁組織的表達(dá)含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。RRM2在肝癌組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

圖1 LncRNA ERVMER61-1和RRM2表達(dá)水平在肝癌組織中上調(diào)

2.2 LncRNA ERVMER61-1 GO功能富集分析 使用“clusterProfiler”包對(duì)LncRNA ERVMER61-1,共表達(dá)的基因做GO富集以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)得到LncRNA ERVMER61-1共表達(dá)基因的相關(guān)功能(圖2)。

圖2 LncRNA ERVMER61-1的GO富集分析

2.3 LncRNA ERVMER61-1和RRM2的表達(dá)相關(guān)性以及在肝癌患者不同特征間表達(dá)分析 對(duì)肝癌組織中LncRNA ERVMER61-1和RRM2表達(dá)的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)LncRNA ERVMER61-1和RRM2表達(dá)存在正相關(guān)(r=0.316，P=0.000，圖3)，驗(yàn)證了LncRNA ERVMER61-1可調(diào)控基因RRM2的表達(dá)。分析兩基因表達(dá)水平在不同特征患者間的差異，發(fā)現(xiàn)LncRNA ERVMER61-1在不同性別間表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，RRM2在不同種族、腫瘤分期間表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖3 LncRNA ERVMER61-1和RRM2共表達(dá)情況

表1 LncRNA ERVMER61-1和RRM2表達(dá)水平與肝癌患者特征情況的關(guān)系

2.4 LncRNA ERVMER61-1和RRM2表達(dá)水平評(píng)價(jià)肝癌患者預(yù)后的價(jià)值 取兩基因表達(dá)水平的中位數(shù)為節(jié)點(diǎn)，分為高表達(dá)與低表達(dá)，單因素Cox回歸發(fā)現(xiàn)LncRNA ERVMER61-1高表達(dá)組患者死亡風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)組患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的2.324倍(95%CI：1.500～3.603)、RRM2高表達(dá)組患者死亡風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)組患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的1.597倍(95%CI：1.138～2.243)。結(jié)合患者特征進(jìn)行多因素Cox回歸，結(jié)果顯示LncRNA ERVMER61-1和RRM2表達(dá)和腫瘤分期影響肝癌患者的生存時(shí)間，LncRNA ERVMER61-1高表達(dá)是影響肝癌患者預(yù)后的因素，見(jiàn)表2。

表2 LncRNA ERVMER61-1和RRM2表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)

利用R軟件的“survminer”包，分別畫(huà)出LncRNA ERVMER61-1和RRM2的Kaplan-Meier曲線曲線(P<0.05)(圖4)。

圖4 LncRNA ERVMER61-1和RRM2不同表達(dá)水平肝癌患者的生存曲線

3 討論

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一類非編碼RNA分子，不具有編碼蛋白質(zhì)的潛力，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸[5]。LncRNA通過(guò)許多調(diào)控機(jī)制[6-7]被確定為各種細(xì)胞、生理和病理過(guò)程的參與者。人類基因組中LncRNA的確切數(shù)量仍不明確，但目前至少已經(jīng)提出了60 000個(gè)LncRNA[8]。lncRNA作為一種潛在的生物學(xué)活性調(diào)節(jié)因子，廣泛參與細(xì)胞活動(dòng)。lncRNA幾乎可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的各個(gè)方面，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老、耐藥性等[9]。因此，lncRNA成為抑制腫瘤及其致癌基因的調(diào)控靶點(diǎn)[10-12]。研究報(bào)道lncRNA可以在肝癌組織中發(fā)揮腫瘤抑制或致癌作用[13]，但lncRNA在肝癌的機(jī)制和功能仍在很大程度上未知，探究lncRNA的功能及在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，有助于支撐肝癌發(fā)生機(jī)制的探索。

Salmena等[14]在2011年首次提出競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)假說(shuō)。ceRNA極大地?cái)U(kuò)展了人類基因組中的功能遺傳信息，并豐富了對(duì)腫瘤發(fā)生潛在機(jī)制的理解。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，ceRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡及藥物反應(yīng)[15]等生物過(guò)程，為癌癥相關(guān)研究、早期診斷及愈后治療提供了新的研究途徑。

LncRNA ERVMER61-1位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)1號(hào)帶1亞帶。目前研究證明LncRNA ERVMER61-1為肝癌ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的一部分[16]，但其功能及在肝癌中的表達(dá)及預(yù)后的研究仍處于空白階段。本研究表明LncRNA ERVMER61-1在肝癌中高表達(dá)，GO富集表現(xiàn)LncRNA ERVMER61-1可能與近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合、GTP酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、RNA聚合酶特異性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、底物特異性通道活性、金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、小GTP酶結(jié)合有關(guān)。分析LncRNA ERVMER61-1表達(dá)水平在不同特征患者間差異情況時(shí)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與性別差異有關(guān)，同時(shí)單因素生存分析發(fā)現(xiàn)LncRNA ERVMER61-1高表達(dá)患者死亡風(fēng)險(xiǎn)高，預(yù)后效果差，體現(xiàn)出癌基因特征。

RRM2又名R2、RR2、RR2M、C2orf48，位于2號(hào)染色體短臂2區(qū)5帶1亞帶，含有14個(gè)外顯子。該基因編碼核糖核苷酸還原酶的兩個(gè)不同亞基之一，該還原酶催化從核糖核苷酸形成脫氧核糖核苷酸。以細(xì)胞周期依賴性方式調(diào)節(jié)編碼的蛋白質(zhì)(M2)合成。核糖核苷酸還原酶是一種參與細(xì)胞周期的酶，由兩個(gè)亞基組成，調(diào)節(jié)亞基RRM1和催化亞基RRM2[17-18]，這對(duì)DNA復(fù)制和修復(fù)至關(guān)重要[12]。已有研究證明異常上調(diào)的RRM2表達(dá)可通過(guò)增加dNTP積累來(lái)促進(jìn)快速細(xì)胞分裂，并且因此涉及多種癌癥，包括大腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、頭頸癌[19-24]，RRM2還與宮頸癌的不良預(yù)后有關(guān)[25]。但RRM2在肝癌中的表達(dá)及預(yù)后研究仍未被提及。

本研究發(fā)現(xiàn)RRM2在肝癌中高表達(dá)，分析LncRNA ERVMER61-1表達(dá)在不同特征患者間差異情況時(shí)發(fā)現(xiàn)LncRNA ERVMER61-1的表達(dá)與種族及腫瘤分期差異有關(guān)，且單因素和多因素生存分析均發(fā)現(xiàn)LncRNA ERVMER61-1高表達(dá)患者預(yù)后效果差。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LncRNA ERVMER61-1和RRM2表達(dá)存在正相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了LncRNA ERVMER61-1可調(diào)控基因RRM2的表達(dá)。

綜上所述，LncRNA ERVMER61-1與RRM2在肝癌中高表達(dá)，且患者高表達(dá)時(shí)預(yù)后效果差。LncRNA ERVMER61-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)RRM2在肝癌進(jìn)展中發(fā)揮作用，為探索抗腫瘤治療提供一個(gè)新的預(yù)后標(biāo)志物及潛在靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義。