吳興偉，呂 坤，耿 彪

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 1.中心實驗室；2.呼吸內科，安徽 蕪湖 241001)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常見的癌癥，其侵襲性強，治療困難，近年來死于肺癌的人數(shù)在世界范圍內一直呈指數(shù)級增長[1-2]，其中NSCLC約占所有肺癌病例的85%[3-5]，肺癌的主要誘因是環(huán)境污染和吸煙[6]，NSCLC的治療技術包括手術、靶向治療、化療等[7-8]。盡管在過去的20年內，NSCLC的治療取得了重大進展，但NSCLC患者的5年生存率仍然小于15%[9]，患者局部復發(fā)、轉移和耐藥等常見[10-12]。因此，目前迫切需要探明NSCLC的致病機理，以便尋找準確的腫瘤標志物和治療靶點。Syntaxin2(STX2)是突觸融合家族的重要成員，并且高度保守。STX2通過其C末端域錨定到細胞膜上，并通過其N末端域起作用，在幾種癌癥的腫瘤發(fā)生或轉移中，STX2參與通過調節(jié)幾個關鍵癌基因的表達水平，如β-catenin和MMP9的表達[13-15]。然而，STX2在腫瘤中，特別是NSCLC中的臨床和生物學作用尚不清楚。在本研究中，我們旨在探討STX2在NSCLC增殖、遷移和侵襲中的作用及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和轉染 肺癌細胞系來源于中國科學院(上海)細胞庫。細胞在含有10%胎牛血清(Gibco，USA)的RPMI-1640(Gibco,USA)中于37℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設計并合成抗STX2的siRNA(si-STX2)。根據(jù)GenMute轉染試劑盒(SignaGen，USA)的協(xié)議，在大約60%的匯合處用siRNA轉染細胞。

1.2 實時定量PCR 用TRIzol(Ambion，life technologied，Carlsbad，CA，USA)從細胞和組織中提取的總RNA(1 μg)，在cDNA合成試劑盒(Thermol-scientific)反轉錄成cDNA。定量實時PCR(RT-PCR)用QuantiNovaTMSYBR? Green PCR Kit(Qiagen,Hilden,Germany)。STX2的引物，正向：ATTCGGTGCTGTCTCGGAAGTTTG；反向：TCGTCGTCTGTGGTGGTTCTCC。用ΔΔCt法估計STX2表達的差異。si-STX2的引物，si-STX2-1:GGATCTTCGGATACGA-AGA;si-STX2-2:GCATCCGAGAGTTGCATGA;si-STX2-3:GGTGCTGTCTCGGAAGTTT。

1.3 Western blot 整個細胞在裂解緩沖液中裂解(KeyGen，China)。用BCA蛋白檢測試劑盒(Beyotime，China)測定蛋白濃度。蛋白質樣品(30 μg)用SDS-PAGE分離，蛋白質轉移到NC膜上(PALL)。在室溫下用5%脫脂牛奶(Bio-Rad，美國)將膜封閉1h，然后在4℃下用稀釋的一級抗體孵育過夜。然后在室溫下用HRP結合的次級抗體孵育1h。用ECL溶液(Bio-Rad，USA)觀察印跡。本研究中使用的CDK2、E-cadherin、MMP-2、MMP-9、p-JNK、JNK、β-actin兔單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology(CST)。

1.4 CCK-8實驗 根據(jù)制造商的指南，使用CCK-8試劑盒檢測肺癌細胞株的細胞活性。簡單的說，細胞以5×103/孔的密度接種于96孔板中，轉染24、48、72 h后，將CCK-8分別加入每孔孵育2 h后。450 nm處的OD吸光度由多檢測微板閱讀器(美國Bio-Tek)檢測，每次重復3次。

1.5 平板克隆實驗 在6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)2 000個/孔轉染處理后的細胞，隨后在新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周。4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min。PBS洗滌，結晶紫染色20 min，結果用Image,J 1.52版軟件進行分析。

1.6 Transwell實驗 用微孔膜過濾器(8 μm孔徑，微孔)進行侵入實驗。簡單地說，將50 μL基質凝膠(BD)加入上腔，37℃孵育1h，在上腔中接種5×104個體積為200 μL的細胞。然后在24孔板的孔中放置Transwell室，在下室中加入600 μL RPIM 1 640培養(yǎng)基(含10%FBS)。孵育24 h后，用棉簽去除未遷移的細胞。移行細胞用4% PFA固定30 min，結晶紫溶液染色20 min，用磷酸鹽緩沖液沖洗后，對5個隨機場進行拍照。

1.7 STX2的TCGA驗證 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一個有效的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘網(wǎng)站，主要是基于TCGA的相關癌癥數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)庫中進行分析。我們驗證了STX2在UALCAN肺癌數(shù)據(jù)庫中的表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析 使用GraphPad Prism 5.0進行統(tǒng)計學分析。采用單因素方差分析或者t檢驗進行組間分析比較，所有值至少代表3個獨立實驗。用t檢驗分析平均數(shù)之間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺癌細胞系中的STX2低表達 本課題組在TCGA數(shù)據(jù)庫中分析了肺癌和癌旁組織中STX2的表達。與癌旁組織相比，癌組織中STX2的表達水平均下降(LUAD：Tumorvs.NormalP=0.034，LUSC：Tumorvs.NormalP=0.026，圖1A)。本課題組用RT-qPCR檢測了STX2在正常人支氣管上皮細胞株(16HBE)和兩種肺癌細胞株(A549和H1299)中的表達。結果表明，肺癌細胞株A549和H1299中STX2的表達低于人支氣管上皮細胞株16HBE(16HBEvs.A549P=0.006；16HBEvs.H1299P=0.004，圖1B)。

**P<0.01。

2.2 下調STX2可以促進NSCLC細胞的增殖和遷移 為了研究STX2對NSCLC的增殖和遷移的影響，本課題組將STX2特異性小干擾RNA(si-STX2)轉染到A549和H1299中。本課題組證實轉染后，STX2的表達水平降低(A549:si-STX2-1vs.si-NCP=0.000,si-STX2-2vs.si-NCP=0.003,si-STX2-3vs.si-NCP=0.034;H1299：si-STX2-1vs.si-NCP=0.000,si-STX2-2vs.si-NCP=0.000,si-STX2-3vs.si-NCP=0.034，圖2A)。接下來，本課題組研究了表達低水平STX2在NSCLC細胞增殖和遷移中的作用。本課題組發(fā)現(xiàn)下調的STX2可以促進A549和H1299細胞的活性和增殖能力。用CCK8檢測細胞活性，與對照組相比，STX2下調顯著促進A549和H1299細胞的細胞活性(A549：24 h，si-NCvs.si-STX2P=0.047,48 h，si-NCvs.si-STX2P=0.003,72 h，si-NCvs.si-STX2P=0.003;H1299:24 h，si-NCvs.si-STX2P=0.039,48 h，si-NCvs.si-STX2P=0.003,72 h，si-NCvs.si-STX2P=0.000，圖2B)。平板克隆實驗結果表明STX2下調可以促進A549和H1299的細胞增殖(A549:si-NCvs.si-STX2P=0.005;H1299:si-NCvs.si-STX2P=0.005，圖2C)。用Transwell檢測其遷移和侵襲能力，與對照組相比，STX2下調顯著促進A549和H1299細胞的遷移和侵襲能力(A549 Migration:si-NCvs.si-STX2P=0.000，Invasion:si-NCvs.si-STX2P=0.043;H1299 Migration:si-NCvs.si-STX2P=0.000，Invasion:si-NCvs.si-STX2P=0.000，圖2D)。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.3 下調STX2可以促進增殖相關蛋白CDK2的表達、促進MMP-2、MMP-9的表達水平和上皮細胞間質化 CDK2是經(jīng)典的增殖相關蛋白；基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)是降解IV型膠原的主要酶，它被證明與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關；上皮間充質轉化(EMT)在腫瘤細胞轉移過程中起著重要作用，已被廣泛認識。因此，本課題組用si-STX2處理A549和H1299細胞，用Western blot檢測CDK2、MMP2、MMP9和E-cadherin的蛋白水平。本課題組發(fā)現(xiàn)與對照組相比，下調STX2組可以顯著促進CDK2、MMP-2、MMP-9的表達水平以及降低E-cadherin的表達水平(A549，E-cadherin：si-NCvs.si-STX2P=0.006，MMP2:si-NCvs.si-STX2P=0.000，MMP9：si-NCvs.si-STX2P=0.000，CDK2:si-NCvs.si-STX2P=0.029;H1299，E-cadherin:si-NCvs.si-STX2P=0.000，MMP2:si-NCvs.si-STX2P=0.000，MMP9:si-NCvs.si-STX2P=0.000，CDK2：si-NCvs.si-STX2P=0.000，圖3)。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.4 下調STX2影響JNK信號分子的磷酸化水平 JNK信號分子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著很重要的作用，與腫瘤的惡性增殖、侵襲和遷移密切相關。因此，本課題組研究了si-STX2能否影響JNK的磷酸化水平。結果顯示在A549和H1299細胞中si-STX2與si-NC相比，si-STX2組顯著促進JNK的磷酸化水平。此外，JNK的總蛋白水平變化差異無統(tǒng)計學意義(A549，P-JNK:si-NCvs.si-STX2P=0.000;H1299，P-JNK:si-NCvs.si-STX2P=0.005，圖4)。這些結果提示si-STX2可以通過激活JNK的磷酸化水平促進NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲。

**P<0.01,***P<0.001。

3 討論

STX2是突觸融合家族的重要成員，并且高度保守。已有報道STX2在癌癥中的作用[16]。然而，這些發(fā)現(xiàn)并沒有深入地去探討STX2所參與的分子機制，這表明STX2在腫瘤發(fā)生和癌癥發(fā)展中的作用仍然知之甚少。因此，在本研究中本課題組主要探究STX2對肺癌的生物學功能的影響和其所參與的分子機制。抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲是腫瘤治療的重要策略。因此在本研究中，本課題組主要探討了STX2對NSCLC增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其可能的分子機制。

本研究中，本課題組從TCGA和GEO 數(shù)據(jù)庫中分析NSCLC中的基因差異性表達，并且發(fā)現(xiàn)STX2在肺癌組織中的表達與正常組織相比表達下調。RT-qPCR結果表明STX2在NSCLC細胞與正常支氣管上皮細胞相比是低表達的。本課題組還發(fā)現(xiàn)將STX2在NSCLC細胞系中表達下調后，促進了NSCLC細胞增殖，同時促進了NSCLC細胞的遷移、侵襲能力。實驗結果說明STX2可以影響NSCLC的增殖、遷移和侵襲等生物學功能。CDK2是重要的細胞增殖相關蛋白，與腫瘤的發(fā)生密切相關[17]?；|金屬蛋白酶(MMPs)已被認為與癌癥的增殖、侵襲等生物學功能密切相關[18]。E-cadherin在癌癥中表達改變標志著癌細胞的惡性特性，比如侵襲行為[19]。為了研究STX2對NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲的影響機制，本課題組將STX2在NSCLC細胞系A549和H1299中下調處理后，Western blot檢測NSCLC細胞系A549和H1299中CDK2、MMP-2、MMP-9以及E-cadherin的表達，本課題組發(fā)現(xiàn)STX2下調后CDK2表達水平升高，MMP-2和MMP-9表達水平也上升，EMT標志物中的E-cadherin表達水平降低。

JNK信號分子(c-Jun氨基末端激酶，c-Jun N-terminal kinase)又被稱為應激活化蛋白激酶，是哺乳類細胞中絲裂原活化蛋白激酶信號通路的一類。它在細胞增殖、凋亡和應激等多種生理和病理過程中起重要作用，也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著很重要的作用[20-21]。為了確定STX2是否影響NSCLC細胞的JNK信號分子，本課題組檢測了其表達這種信號分子的磷酸化水平，將siRNA-STX2轉染到細胞內，用Western blot檢測JNK總蛋白和磷酸化水平，觀察到STX2的敲低可以通過JNK信號分子的激活，促進JNK的磷酸化的表達，但是JNK總蛋白水平?jīng)]有變化。JNK及其家族其他信號分子是否參與STX2對NSCLC細胞的抑癌作用我們尚不清楚。下一步，我們將進一步分析研究STX2/JNK信號分子對NSCLC的影響。

綜上所述，本研究結果表明，敲低STX2可以激活JNK信號分子促進NSCLC細胞的CDK2以及MMPs和EMT標志物的表達，從而促進NSCLC細胞的增殖和遷移，為其抗腫瘤活性提供了新的見解，為STX2可能作為肺癌治療的生物標記物和治療靶點提供了理論支持。