周 歡，王冬梅，路 勇，葉長(zhǎng)江，陳祥祥，黃浩宇，孫恩濤，浦 春

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 檢驗(yàn)科,安徽 蕪湖 241001)

腎臟在調(diào)節(jié)血容量和毒素及藥物的排出方面起著關(guān)鍵作用，具有很高的藥物吸收能力，也使得它們?nèi)菀资艿剿幬锒拘杂绊憣?dǎo)致腎臟損傷。四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)是一種環(huán)境污染相關(guān)的肝毒性物質(zhì)，在氧化應(yīng)激過程中，腎臟是其另一個(gè)重要靶器官[1]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)是一種在細(xì)胞保護(hù)中具有重要作用的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子，在應(yīng)激條件下ROS過量時(shí)Nrf2就會(huì)被激活[2]。丹酚酸B(salvianolic acid B，SalB)是中藥丹參的水溶性成分，具有抗氧化、抗炎、腎臟保護(hù)等多種生物活性[3]。最新研究表明SalB參與了多種疾病中Nrf2信號(hào)通路的激活，并且發(fā)現(xiàn)SalB通過激活Nrf2信號(hào)通路保護(hù)缺血再灌注引起的腎損傷[4]。然而，目前尚無證據(jù)表明SalB是否通過Nrf2通路保護(hù)CCl4引起的急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)。因此，本研究探討CCl4誘導(dǎo)的大鼠模型中SalB的潛在作用，并探討與Nrf2通路相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)[SCXK(浙)2019-000]。主要試劑包括丹酚酸B(上海麥克林)，MDA及SOD檢測(cè)試劑盒(南京建成生物研究所)，RNA抽提劑TRIZOL(美國Invitrogen公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Servicebio)，SYBR Green熒光染料(Servicebio)。

1.2 方法

1.2.1 50只大鼠平均分為正常對(duì)照組，模型組，SalB低、高劑量組，SalB對(duì)照組。正常對(duì)照組生理鹽水灌胃7 d，模型組生理鹽水灌胃6 d，第7天給予3 mL/kg CCl4和橄欖油1∶1腹腔注射，SalB低、高劑量組分別給予SalB(80、160 mg/kg)灌胃7 d[8]，3 h后給予3 mL/kg CCl4和橄欖油1∶1腹腔注射，SalB對(duì)照組給予SalB(160 mg/kg)灌胃7 d，CCl4腹腔注射后24 h，處死所有大鼠留取血清、腎組織。

1.2.2 血清SCr、BUN測(cè)定 腹主動(dòng)脈采血，進(jìn)行肌酐(SCr)，尿素氮(BUN)檢測(cè)。

1.2.3 HE病理染色 取左側(cè)腎組織，于多聚甲醛中保存24 h后石蠟包埋，常規(guī)HE染色，觀察大鼠腎組織病理變化。

1.2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 依照試劑盒說明書，化學(xué)比色法測(cè)定腎組織總SOD活力、丙二醛(MDA)含量。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) 采用Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)GAPDH、Nrf2、HO-1基因引物序列，上海生物工程有限公司合成，GAPDH：5′-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′，5′-GGTGGA-AGAATGGGAGTTGCT-3′；Nrf2：5′-GACAAGCCACA-GGACTACAAGAA-3′，5′-CGTATCCACCAGAGTGAA-AAGAA-3′；HO-1：5′-CAGCATGTCCCAGGATTTGTC-3′，5′-TTCTCTGTGGAGCTGAAGCA-3′。取大鼠腎臟組織100 mg，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR方法檢測(cè)Nrf2、HO-1基因mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)改變 光鏡下正常對(duì)照組及SalB對(duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)均正常。各實(shí)驗(yàn)組大鼠可見不同程度的腎損傷，腎小球結(jié)構(gòu)大體正常，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，刷狀緣脫落，部分腎小管管腔擴(kuò)張，模型組偶可見炎性細(xì)胞。見圖1。

A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.SalB低劑量組；D.SalB高劑量組；E.SalB對(duì)照組。

2.2 大鼠腎功能 與正常對(duì)照組比較，CCl4模型組，SalB低、高劑量組大鼠血清SCr、BUN均升高(P<0.05)，而與SalB對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與CCl4模型組比較，SalB高劑量組和SalB對(duì)照組SCr、BUN均降低(P<0.05)；與SalB高劑量組比較，SalB低劑量組SCr升高(P<0.05)，SalB對(duì)照組SCr、BUN均降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠SCr、BUN水平的比較

2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo) 與正常對(duì)照組比較，CCl4模型組，SalB低、高劑量組大鼠腎組織SOD含量均降低(P<0.05)，而與SalB對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與CCl4模型組比較，SalB高劑量組和SalB對(duì)照組SOD均升高(P<0.05)；與SalB高劑量組比較，SalB對(duì)照組SOD升高(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，CCl4模型組，SalB低、高劑量組大鼠腎組織MDA含量均升高(P<0.05)，而與SalB對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與CCl4模型組比較，SalB高劑量組和SalB對(duì)照組MDA均降低(P<0.05)，與SalB高劑量組比較，SalB低劑量組MDA升高(P<0.05)，SalB對(duì)照組MDA降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠SOD、MDA水平的比較

2.4 Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)水平 與正常對(duì)照組比較，CCl4模型組大鼠腎組織Nrf2含量降低，SalB對(duì)照組大鼠腎組織Nrf2含量升高(P<0.05)；與CCl4組比較，SalB高劑量組和SalB對(duì)照組Nrf2均升高(P<0.05)，與SalB高劑量組比較，SalB低劑量組Nrf2降低(P<0.05)，SalB對(duì)照組Nrf2升高(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，CCl4模型組和SalB低劑量組大鼠腎組織HO-1含量降低(P<0.05)，SalB高劑量組大鼠腎組織HO-1含量升高(P<0.05)，而與SalB對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與CCl4組比較，SalB高劑量組和SalB對(duì)照組HO-1均升高(P<0.05)，與SalB高劑量組比較，SalB低劑量組和SalB對(duì)照組HO-1降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠Nrf-2和HO-1的mRNA表達(dá)水平的比較

3 討論

急性腎損傷與各種腎臟疾病密切相關(guān)，腎臟在調(diào)節(jié)血容量和毒素及藥物的排出方面起著關(guān)鍵作用，也使它們?nèi)菀资艿剿幬锒拘杂绊憦亩鴮?dǎo)致腎臟損傷。本研究結(jié)果表明，在CCl4模型中氧化應(yīng)激增加，SalB治療后氧化應(yīng)激指標(biāo)下降，腎功能改善，表明氧化應(yīng)激的增加可能在CCl4所致的腎臟損傷中有重要作用。

在造模成功的前提下，SalB低、高劑量組和SalB對(duì)照組SCr和BUN與CCl4組相比均降低，提示SalB對(duì)腎臟有保護(hù)作用。HE結(jié)果表明CCl4組大鼠在SalB治療后小管病變明顯改善，小管損傷減少，說明SalB能緩解CCl4所致的腎損傷。不同劑量SalB對(duì)大鼠的治療作用，高劑量組的治療效果比低劑量組好，提示SalB的作用可能有不同劑量的依賴性。

氧化應(yīng)激是指CCl4自由基衍生物產(chǎn)生和積累的病理過程，內(nèi)源性抗氧化酶(CAT、SOD等)代表機(jī)體對(duì)抗ROS的第一道防線[6]。本研究中，暴露于CCl424 h后，SOD的抗氧化防御酶活性降低，正如其他研究結(jié)果所示[7]，說明CCl4能引起腎臟的氧化損傷。SalB各組大鼠腎組織MDA均低于CCl4模型組，SOD高于CCl4模型組，前期的研究也發(fā)現(xiàn)SalB可以保護(hù)組織躲避氧化劑的損傷[8]，表明SalB可顯著抑制CCl4所致大鼠腎臟的脂質(zhì)過氧化，降低MDA水平、增加SOD等抗氧化產(chǎn)物的生成。而本研究中SalB高劑量組抗氧化能力最強(qiáng)，一定的濃度范圍內(nèi)SalB對(duì)ROS清除能力增強(qiáng)，之前的報(bào)道[9]也提示SalB在ROS的清除上有不同劑量的依賴性。

Nrf2是在抗氧化防御系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠在ROS的產(chǎn)生和內(nèi)源性細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)之間保持平衡[10]。氧化應(yīng)激條件下Nrf-2進(jìn)入細(xì)胞核，然后激活各種抗氧化劑酶，如HO-1、GST等。本研究中腎組織實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示，CCl4模型組中Nrf-2和HO-1的mRNA表達(dá)量受到抑制，與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，說明Nrf-2和HO-1參與了CCl4模型大鼠的氧化應(yīng)激過程。與CCl4模型組比較，SalB低、高劑量組和SalB對(duì)照組Nrf-2和HO-1的mRNA表達(dá)量均升高，表明SalB能夠增加Nrf-2和HO-1的mRNA表達(dá)，與前期研究一致[12]。AKI是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，本研究結(jié)果提示SalB具有抗氧化反應(yīng)的作用，這可能只是腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)眾多機(jī)制中的一種，后續(xù)我們還將繼續(xù)完善動(dòng)物模型研究及體外氧化應(yīng)激細(xì)胞增殖等經(jīng)典通路的探索。此外，本研究結(jié)果提示SalB高劑量組的抗氧化應(yīng)激的作用優(yōu)于低劑量組，后續(xù)也將重點(diǎn)探討SalB的最佳劑量及其可能機(jī)制。

綜上所述，本研究觀察SalB作用下CCl4模型大鼠血清、腎組織相關(guān)指標(biāo)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SalB能夠減輕CCl4大鼠腎臟組織中氧化應(yīng)激水平，并對(duì)腎功能起到相當(dāng)程度的保護(hù)作用。SalB已被證實(shí)在多種疾病中有較好療效，其在腎臟損傷及保護(hù)作用仍然需要進(jìn)一步研究，為基礎(chǔ)研究向臨床及產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化提供有力的理論支持。