侯婧瑛，吳雅嫻，金小巖，凌 輝，于霆峰，王凌云

（1.中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院臨床研究中心，廣東廣州510120；2.中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510120；3.中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院綜合科，廣東廣州510120；4.深圳市人民醫(yī)院，廣東深圳518020）

研究表明長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要調(diào)控作用［1-2］。漿細胞瘤變異易位基因1（plasmacy?toma variant translocation 1，PVT1）作為lncRNA家族的成員之一，在多種惡性腫瘤中呈高表達，并與不良預(yù)后相關(guān)［3］。證據(jù)顯示PVT1在胃癌中呈異常表達并參與了腫瘤的發(fā)展進程和不良預(yù)后［4-5］。不僅如此，PVT1高表達與胃癌生存及化療耐藥等密切相關(guān)，可作為胃癌患者早期診斷和預(yù)測預(yù)后的標記物［6］。目前PVT1在胃癌中的具體調(diào)控機制仍未完全明確。B細胞特異性莫洛氏鼠白血病病毒插入位點-1（B cell specific murrow mouse leukemia vi?rus insertion site-1，Bmi-1）是多梳基因家族中的重要成員，在細胞增殖、分化及自我更新中起到了調(diào)節(jié)作用［7］。研究表明，Bmi-1是胃癌發(fā)生發(fā)展的一個重要調(diào)控因子。Bmi-1過表達能夠在體外誘導(dǎo)胃上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化［8］，而敲除Bmi-1能夠顯著促進胃癌細胞衰老、抑制胃癌的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移［9-10］。然而，PVT1是否通過調(diào)控Bmi-1影響胃癌的生物學(xué)行為及具體中間機制如何，仍未見報道。現(xiàn)已證實除lncRNA外，微小RNA（microRNAs，miRNAs）也參與了對腫瘤的調(diào)控［2］。miR-15a被報道與胃癌的發(fā)生發(fā)展、生存和不良預(yù)后相關(guān)［11］。miR-15a可作為Bmi-1的一個抑制因子，通過靶向下調(diào)Bmi-1影響胃癌的臨床病理進程包括分化，腫瘤侵襲性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等［12］。lncRNA作為競爭性內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與miRNA發(fā)生相互作用進而調(diào)節(jié)靶基因的表達，是促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制之一［1］。最新的一項研究顯示，由PVT1介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)在胃癌的發(fā)病機制及生存預(yù)后中發(fā)揮重要作用［13］。故PVT1是否可作為ceRNA通過靶向抑制miR-15a進而上調(diào)Bmi-1，值得進一步探討。在本研究中，我們在體外觀察PVT1對胃癌細胞體外增殖的影響，并探討ln?cRNA-PVT1/miR-15a/Bmi-1通路是否在其中起到調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系和試劑

胃癌細胞株HGC-27（上海細胞庫），293T細胞（中國科學(xué)院細胞庫）；DMEM高糖培養(yǎng)液（Hy?clone），胎 牛 血 清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Hy?clone），胰 蛋 白 酶（Hyclone），轉(zhuǎn) 染 試 劑Lipo?fectamine2000（Invitrogen），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?RNAi MAX（Invitrogen），cellTiter96AQ單溶液細胞增殖檢測試劑（Promega），酶標儀（Thermo Fisher Scientific），F(xiàn)ACS流式細胞儀（BD公司），96孔板細胞培養(yǎng)板（NEST），巴氏吸管（JET BIOFIL），Bmi-1鼠單克隆抗體（Abcam），辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（Southern biotech），Ⅱ抗及I抗稀釋液（中杉金橋），BCA法蛋白含量檢測試劑盒（Abcam），TRIzol RNA提取試劑盒（Santa Cruz），PVDF膜和發(fā)光液（Millipore），PVT1小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）1#、PVT1siRNA2#，PVT1siRNA NC對照、Bmi-1siRNA1#、Bmi-1siRNA2#，Bmi-1siR?NA NC對照，miR-15a模擬物和抑制劑及對照序列合成（廣州銳博生物科技有限公司），QuickMutation?基因定點突變試劑盒（碧云天），DpnI酶（Pro?mega），psiCHECK-2雙螢光素酶報告基因載體、螢光素酶檢測試劑盒和Dual-Luciferase ReporterAs?say System（Promega）。本研究所有實驗操作程序獲得中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

以5×104cells/well的密度接種細胞，充分搖勻，次日細胞融合度達40%再進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法詳見課題組前期已發(fā)表文獻［2，14］。

1.3 MTS細胞增殖檢測

MTS法檢測細胞增殖，獲取OD490值并計算細胞增殖率，具體檢測及計算方法詳見課題組前期已發(fā)表文獻［2，14］。

1.4 qRT-PCR檢測

提取總RNA并進行分析。RNA提取、后續(xù)具體檢測及計算方法詳見課題組前期已發(fā)表文獻［2，14］，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The sequence of primersfor qRT-PCR

1.5 PVT1表達載體及其突變載體構(gòu)建

分析PVT1和Bmi-1基因序列，采用Reg RNA 2.0預(yù)測PVT1與miR-15a以及miR-15a與Bmi-1之間的結(jié)合位點，在PVT1和Bmi-1合成片段的上下游分別引入酶切位點XhoI和NotI，以及XhoI和PmeI（表2下劃線部分所示）。具體合成、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、PCR擴增條件、酶切鑒定及質(zhì)粒測序等參照課題組前期已發(fā)表文獻［2］。測序結(jié)果進行Blast比對確認目的基因（PVT1和Bmi-1）及突變體已成功克隆至psiCHECK-2載體中［2］。擴增引物序列及測序序列見表2和表3。

表2 引物序列Table2 Thesequencesoftheprimers

表3 測序引物序列Table3 Thesequencesoftheprimersforsequencing

1.6 雙螢光素酶報告實驗

采用293T細胞，陽離子脂質(zhì)體法進行細胞轉(zhuǎn)染，具體細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法詳見課題組前期參考文獻［2］。螢光素酶活性檢測采用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System（E1910），具體操作及數(shù)據(jù)采集方法詳見課題組前期參考文獻［2，14］。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，經(jīng)檢驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，計量資料以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示。細胞增殖、mRNA和蛋白表達、以及螢光素酶的結(jié)果比較，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法，以P<0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PVT1siRNA和Bmi-1siRNA篩選

本研究中，為明確PVT1和Bmi-1的調(diào)控功能，我們采用兩條不同的siRNA，分別進行不同濃度的篩選，結(jié)果顯示，PVT1siRNA篩選中，總體差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1082.00，P<0.001）；PVT1siR?NA1#在濃度為100nmol/L時，轉(zhuǎn)染后mRNA表達最低，具有最大的抑制效率（P<0.001，圖1A）。Bmi-1siRNA篩選中，總體差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1049.38，P<0.001）Bmi-1siRNA1#在濃度為100nmol/L時，轉(zhuǎn)染后mRNA表達最低，具有最大的抑制效率（P<0.001，圖1B）。因此，我們采用PVT1siRNA1#（100nmol/L）和Bmi-1siRNA1#（100 nmol/L）進行后續(xù)研究。

圖1 PVT1 siRNA和Bmi-1篩選Fig.1 PVT1 siRNA and Bmi-1 siRNA screening

2.2 PVT1、miR-15a和Bmi-1對胃癌細胞增殖的影響

MTS結(jié)果顯示：在0h以后的不同時間點，抑制PVT1后，各組OD490值在總體差異上均具有統(tǒng)計學(xué)意義（24h：F=279.29，P<0.001；48h：F=1796.31，P<0.001；72h：F=328.91，P<0.001）；si-PVT1組OD490值和細胞增殖率均低于si-PVT1NC組和空白對照組（n=3，P<0.001，圖2B）。轉(zhuǎn)染miR-15a后，各組OD490值在總體差異上均具有統(tǒng)計學(xué)意義（24h：F=65.14，P<0.001；48h：F=132.50，P<0.001；72h：F=971.42，P<0.001）；miR-15a組OD490值和細胞增殖率均低于miR-15a NC組和空白對照組（n=3，P<0.001，圖2C；n=3，P<0.001，圖2D）。抑制Bmi-1后，各組OD490值在總體差異上均具有統(tǒng)計學(xué)意義（24 h：F=41.60，P<0.001；48 h：F=103.69，P<0.001；72 h：F=291.15，P<0.001）；si-Bmi-1組的OD490值和細胞增殖率均低于si-Bmi-1NC組和空白對照組（n=3，P<0.001，圖2E；n=3，P<0.001，圖2F）。

圖2 各組胃癌細胞的增殖情況Fig.2 Detection of gastric cancer cell proliferation in each group

2.3 PVT1對Bmi-1表達的影響

我們采用siRNA轉(zhuǎn)染抑制PVT1的表達后，檢測各組PVT1和Bmi-1的表達水平，結(jié)果顯示：各組PVT1的mRNA表達水平總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2 929.50，P<0.001），各組Bmi-1的mRNA和蛋白表達水平總體差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 238.36，P<0.001；F=224.84，P<0.001）。si-PVT1組PVT1的mRNA表達量較si-PVT1NC組和空白對照組明顯降低（P<0.001，圖3A）。si-PVT1組Bmi-1的mRNA和蛋白表達量較si-PVT1NC組和空白對照組明顯下降（P<0.001，圖3B；P<0.001，圖3C、D）。

圖3 PVT1對Bmi-1表達的影響Fig.3 The effect of PVT1 on the expression of Bmi-1

2.4 螢光素酶報告基因載體的酶切鑒定和測序

psiCHECK-2-PVT1野生型和突變型酶切鑒定及測序、psiCHECK-2-Bmi-1野生型和突變型酶切鑒定及測序結(jié)果均顯示，目的基因PVT1和其突變型、Bmi-1和其突變型均已成功構(gòu)建到psiCHECK-2載體中。酶切結(jié)果分析可見，PVT1（圖4A）、Bmi-1（圖4B）在相應(yīng)的位置切出一條目的條帶，psi?CHECK-2-PVT1和psiCHECK-2-Bmi-1雙熒光素酶報告基因載體構(gòu)建成功。

圖4 重組質(zhì)粒酶切鑒定和測序Fig.4 Endonuclease digestion and sequence analysis of the constructed recombinant plasmid

2.5 miR-15a對Bmi-1表達的影響

我們采用miR-15a模擬物轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-15a后，檢測各組miR-15a和Bmi-1的表達水平。結(jié)果顯示：各組miR-15a的mRNA表達水平總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6895.93，P<0.001），與miR-15a NC組和空白對照組相比較，miR-15a組miR-15a的mRNA表達量明顯升高（P<0.001，圖5A）。各組Bmi-1的mRNA和蛋白表達水平總體差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 110.17，P<0.001；F=1 291.23，P<0.001）。miR-15a組Bmi-1的mRNA和蛋白表達量較NC組和空白對照組明顯下降（P<0.001，圖5B~D）。雙螢光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，miR-15a模擬物與Bmi-1野生型或突變型報告基因共轉(zhuǎn)染293T細胞后，在Bmi-1野生型中，各組總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 976.55，P<0.001）。miR-15a模擬物組的雙熒光素酶活性與空白對照和NC相比明顯降低，下調(diào)約32%（P<0.001，圖6）；在Bmi-1突變型中，miR-15a模擬物組的螢光素酶活性與其陰性對照和空白對照相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=1.00，P=0.99，圖6），并且miR-15a抑制劑組的螢光素酶活性與其陰性對照和空白對照相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=1.00，P=1.00；圖6）。

圖5 miR-15a對Bmi-1表達的影響Fig.5 The effect of miR-15a on the expression of Bmi-1

圖6 miR-15a與Bmi-1靶向關(guān)系的雙螢光素酶報告基因檢測結(jié)果Fig.6 The relationship between miR-15a and Bmi-1 tested by promega dual luciferase reporter gene test

2.6 PVT1競爭性結(jié)合并抑制miR-15a

我們在采用siRNA轉(zhuǎn)染抑制PVT1的表達后，檢測了各組miR-15a的表達水平，結(jié)果顯示：各組總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 611.92，P<0.001）。si-PVT1組miR-15a的mRNA表達量較si-PVT1NC組和空白對照組明顯增高（P<0.001，圖7）。雙螢光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，在PVT1野生型中，各組總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=708.55，P<0.001），miR-15a模擬物組的熒光素酶活性與空白對照和NC相比出現(xiàn)明顯降低，下調(diào)約56%（P<0.001；圖8）；而在PVT1突變型中，miR-15a模擬物組的螢光素酶活性與空白對照和其陰性對照相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=1.00，P=1.00；圖8），miR-15a抑制劑組的螢光素酶活性與空白對照和其陰性對照相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=1.00，P=1.00；圖8）。由此說明，miR-15a可以結(jié)合預(yù)測的PVT1位點。

圖7 PVT1對miR-15a表達的影響Fig.7 The effect of PVT1 on the expression of miR-15a

圖8 PVT1與miR-15a靶向關(guān)系的雙螢光素酶報告基因檢測結(jié)果Fig.8 The relationship between PVT1 and miR-15a tested by promega dual luciferase reporter gene test

2.7 PVT1、miR-15a和Bmi-1三者關(guān)系的逆向驗證試驗

在抑制PVT1的同時加入miR-15a或者miR-15a的抑制劑，再觀察Bmi-1的表達變化情況，結(jié)果顯示：各組PVT1的mRNA表達總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=984.56，P<0.001），miR-15a的mRNA表達總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5 433.56，P<0.001），Bmi-1的mRNA和蛋白表達量總體差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2 773.18，P<0.001；F=693.01，P<0.001）。與si-PVT1NC組和空白對照組相比，si-PVT1組PVT1的mRNA表達量下降（P<0.001；圖9C），miR-15a的mRNA表達量增高（P<0.001；圖9D），Bmi-1的mRNA和蛋白表達量均下降（P<0.001；圖9A、B、E）。與si-PVT1和si-PVT1+miR-15a inhibitor NC對照組相比較，si-PVT1+miR-15a inhibitor組PVT1的mRNA表達量出現(xiàn)回升（P<0.001；圖9A），miR-15a的mRNA表達量下降（P<0.001；圖9B），而Bmi-1的mRNA和蛋白表達量均有所回升（P<0.001；圖9A、B、E）。與si-PVT1和si-PVT1+miR-15a NC對照組相比較，si-PVT1+miR-15a組PVT1的mRNA表達量進一步降低（P<0.001；圖9A），miR-15a的mRNA表達量增加（P<0.001；圖9B），而Bmi-1的mRNA和蛋白表達量均出現(xiàn)進一步下降（P<0.001；圖9A、B、E）。

圖9 PVT1/miR-15a/Bmi-1調(diào)控通路的逆向驗證Fig.9 The reverse validation of PVT1/miR-15a/Bmi-1 regulatory network

3 討 論

既往研究顯示，PVT1參與對胃癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控，其與胃癌的進展程度、淋巴結(jié)侵犯及不良預(yù)后相關(guān)［5］，有學(xué)者提出PVT1是胃癌患者診斷和預(yù)后的一個潛在生物學(xué)標記物［6］。PVT1不僅在體內(nèi)外促進胃癌生長和擴增，還通過激活STAT3/VEGFA信號通路誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)部的血管形成［15］。PVT1可通過激活凋亡相關(guān)基因抑制胃癌細胞凋亡，進而造成胃癌對化療藥物如5-氟尿嘧啶及紫杉醇等產(chǎn)生耐藥［16］。在本研究中，我們在體外采用兩種不同的siRNA，并進行不同濃度的篩選，在篩選出具有最大抑制效率的siRNA后，我們采用對應(yīng)的siRNA進行轉(zhuǎn)染抑制PVT1的表達并檢測不同組別mRNA表達水平，結(jié)果顯示si-PVT1組PVT1的mRNA表達水平呈現(xiàn)顯著下降，表明PVT1被成功抑制。我們檢測不同組別的細胞擴增情況，與既往研究相一致，我們的結(jié)果顯示，在PVT1被抑制后，OD490值以及細胞增殖率均出現(xiàn)顯著下降。以上說明，PVT1能夠促進胃癌細胞的體外增殖。于是，我們進一步探索PVT1的具體作用機制。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Bmi-1參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，其在胃癌組織中呈高表達并與臨床病理分期密切相關(guān)［10］。此外，循環(huán)血中Bmi-1的mRNA表達水平與患者年齡、病理分型、臨床分期、分化程度及轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)［17］。鑒于Bmi-1在調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中的重要作用，PVT1是否通過調(diào)控Bmi-1以及中間分子機制如何，引起了我們的關(guān)注。在本研究中，我們體外采用兩種不同的siRNA，并進行不同濃度的篩選，在篩選出具有最大抑制效率的siRNA后，我們采用對應(yīng)的siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞，并檢測OD490值以及細胞增殖率。結(jié)果表明，Bmi-1被抑制后，OD490值以及細胞增殖率均出現(xiàn)顯著下降。以上說明，Bmi-1能夠促進胃癌細胞的體外增殖。我們在PVT1被抑制后，檢測Bmi-1的表達，結(jié)果顯示，Bmi-1的表達水平亦出現(xiàn)顯著下調(diào)，說明PVT1能夠通過正向調(diào)控Bmi-1在體外促進胃癌細胞的擴增。于是，我們進一步探索PVT1通過何種機制上調(diào)了Bmi-1。

目前已有報道一些miRNAs能夠通過下調(diào)Bmi-1來抑制腫瘤細胞擴增、侵襲及遷移等。miR-15a在胃癌的發(fā)病機制中有潛在作用，且其與晚期腫瘤分級和轉(zhuǎn)移相關(guān)［18］。因此，有人提出，臨床上可將miR-15a作為胃癌新的治療靶點和預(yù)后標記物［11］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，miR-15a能夠負向調(diào)控Bmi-1。miR-15a能夠通過直接下調(diào)Bmi-1來削弱胃癌細胞的擴增和侵襲性，而通過轉(zhuǎn)染miR-15a抑制Bmi-1的表達后胃癌細胞的生存力和遷移能力出現(xiàn)明顯減弱［12］。在本研究中，為驗證miR-15a的調(diào)節(jié)作用，我們在體外培養(yǎng)的HGC-27胃癌細胞株中轉(zhuǎn)染miR-15a的模擬物，觀察細胞增殖情況，并進一步檢測Bmi-1的表達變化。與既往研究相一致，我們發(fā)現(xiàn)，與空白對照及NC對照相比，轉(zhuǎn)染miR-15a后細胞增殖顯著下降，而Bmi-1的表達明顯下降，表明在胃癌細胞中，miR-15a可下調(diào)Bmi-1抑制細胞增殖。我們進一步通過生物信息學(xué)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫預(yù)測Bmi-1和miR-15a的結(jié)合位點，在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建含Bmi-1野生型和突變型質(zhì)粒的雙熒光素酶報告載體，并用雙螢光素酶報告基因檢測分析Bmi-1與miR-15a之間的靶向關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，miR-15a轉(zhuǎn)染組Bmi-1野生型報告基因的螢光素酶活性顯著降低，miR-15a抑制劑組Bmi-1野生型報告基因的熒光素酶活性則較miR-15a和空白對照及NC組明顯增加；而miR-15a模擬物、miR-15a抑制劑以及陰性對照對Bmi-1突變型的表達均無明顯影響，以上充分說明了miR-15a能夠在胃癌細胞中直接結(jié)合并下調(diào)Bmi-1。

lncRNA作為ceRNA來調(diào)控靶基因的表達，是腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的一個重要調(diào)控機制［1-2］。PVT1作為ceRNA參與對胃癌進行調(diào)控的系列研究顯示，PVT1可通過吸附miR-186解除后者對HIF-1α的抑制作用，進而增強胃癌細胞的擴增能力和侵襲性［19］；另外，一項新近的研究報道，PVT1的同型轉(zhuǎn)錄本PVT1-214可通過抑制miR-128來上調(diào)TrkC進而促進胃癌的進展［20］。然而到目前為止，PVT1是否在胃癌中通過ceRNA作用調(diào)控miR-15a，進而引起B(yǎng)mi-1表達上調(diào)，以此進一步影響胃癌細胞的增殖等，現(xiàn)仍未見報道。在本研究中，為了明確PVT1與miR-15a之間的調(diào)控關(guān)系，我們在體外對胃癌細胞轉(zhuǎn)染PVT1的siRNA抑制其表達，并以空白細胞組和NC為對照，在轉(zhuǎn)染后檢測了不同組別PVT1和miR-15a的表達情況，結(jié)果顯示在采用siR?NA抑制PVT1的表達后，PVT1表達明顯下調(diào)，而miR-15a表達顯著上調(diào)，表明PVT1能夠抑制miR-15a的表達。我們進一步通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測PVT1和miR-15a的潛在結(jié)合位點，在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建含PVT1野生型和突變型質(zhì)粒的雙熒光素酶報告載體，并用雙螢光素酶報告基因檢測分析PVT1與miR-15a之間的靶向關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，miR-15a轉(zhuǎn)染組PVT1野生型報告基因的螢光素酶活性顯著降低，miR-15a抑制劑組PVT1野生型報告基因的螢光素酶活性則較miR-15a和空白對照及NC組明顯增加；而miR-15a模擬物、miR-15a抑制劑以及陰性對照對PVT1突變型的表達均無明顯影響，以上充分說明了PVT1能夠靶向結(jié)合并下調(diào)miR-15a。

在對上述3個因子進行兩兩關(guān)系的驗證后，我們進一步采用逆向驗證實驗明確PVT1/miR-15a/Bmi-1這一調(diào)控通路。通過采用siRNA抑制PVT1，并在此基礎(chǔ)上加入miR-15a的模擬物或者抑制劑及相應(yīng)的陰性對照，觀察3個指標的表達變化情況。我們發(fā)現(xiàn)，在抑制PVT1的基礎(chǔ)上同時加入miR-15a的抑制劑后，PVT1和Bmi-1的表達量均出現(xiàn)回升，而miR-15a的表達量則進一步下降；在抑制PVT1的基礎(chǔ)上同時加入miR-15a的模擬物后，miR-15a的表達量回升，而PVT1和Bmi-1的表達量出現(xiàn)了進一步降低。綜合以上充分表明，PVT1通過靶向下調(diào)miR-15a，從而進一步上調(diào)了Bmi-1。

綜合以上，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-PVT1能夠通過靶向結(jié)合并抑制miR-15a上調(diào)Bmi-1的表達，進而促進胃癌細胞的體外增殖。對lncRNA-PVT1/miR-15a/Bmi-1調(diào)控通路的進一步研究，將為胃癌的臨床治療提供新的靶點和突破口。