李 澤，宋禎彥，李富周，賀春香，楊 苗，于文靜，成紹武

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410208）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的老年神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為記憶和認(rèn)知障礙的進(jìn)行性喪失［1］。隨著社會(huì)發(fā)展和人類(lèi)飲食結(jié)構(gòu)的豐富，肥胖逐漸成為全球性健康問(wèn)題［2］。研究表明，肥胖與慢性全身性炎癥有關(guān)，且與認(rèn)知能力下降的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)［3］。中年肥胖會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)長(zhǎng)期處于慢性炎癥狀態(tài)，影響大腦的認(rèn)知功能，也是癡呆發(fā)病率和嚴(yán)重程度的一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子［4］。長(zhǎng)期慢性神經(jīng)炎癥促進(jìn)AD疾病發(fā)展［5］，過(guò)多激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞可以導(dǎo)致突觸喪失，并分泌傷害神經(jīng)元的炎癥因子［6］。目前已有研究表明高脂飲食能夠引起野生型小鼠炎性反應(yīng)增強(qiáng)和APP/PS1小膠質(zhì)細(xì)胞炎性激活［3，7-8］，提示炎癥反應(yīng)可能是高脂飲食導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵因素。細(xì)胞焦亡通路為AD的主要病理改變之一，是一種新型的促炎細(xì)胞死亡程序，特征為依賴(lài)半胱氨酸蛋白酶（caspase）的程序性細(xì)胞死亡途徑［9］，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，進(jìn)而腫脹、破裂和死亡，釋放促炎癥的胞內(nèi)細(xì)胞因子［10］。高脂飲食和炎性反應(yīng)以及阿爾茲海默病之間的病理關(guān)系尚不明確，本文分別對(duì)C57BL/6J普通小鼠和APP/PS1癡呆小鼠喂食高脂飼料后，觀察其腦內(nèi)海馬區(qū)病理變化情況、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡變化，探究高脂飲食、神經(jīng)炎癥和阿爾茲海默病之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄鼠12只，6月齡，體質(zhì)量（20±5）g：購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2014－0004，C57BL/6J雄鼠12只，6月齡，體質(zhì)量（20±5）g：購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK（湘）2015－0010，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)繁育培育至12月齡。室內(nèi)溫度20℃～24℃，相對(duì)濕度35%～45%，室內(nèi)光線12 h明暗交替，所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)動(dòng)物處置符合湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理學(xué)要求（倫理編號(hào)：LLBH-20191231003）。

1.2 藥物及試劑

尼氏染色液（Nissol stain，焦油紫法）、DAPI染色液（C0065）、Triton X-100（T8200）購(gòu)自中國(guó)索萊寶公司；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1088）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（SDS-PAGE Sample Loading Buffer，5×，P0015L）購(gòu)自中國(guó)Beyo?time公司；RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer，01408/504074）、蛋白酶抑制劑混合物（CW2200）購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；BCA蛋白定量分析試劑盒（BCA Protein Assay Kit，NCI3227CH）、熒光二抗驢抗兔（A21206）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；一抗caspase-1（bs-10442R）、NALP3（bs-10021R）和βactin（bs-0061R）購(gòu)自北京博奧森生物有限公司；一抗Iba-1（SAF5299）購(gòu)自日本W(wǎng)ako公司；山羊抗兔二抗（SA00001-2）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；通用二步法檢測(cè)試劑盒（小鼠/兔增強(qiáng)聚合物法檢測(cè)系統(tǒng)）（PV9000），購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（NovoScript?Plus All-inone 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix，gDNA Purge，E047-01B）購(gòu)自中國(guó)近岸蛋白質(zhì)科技有限公司。高脂飼料D12492，能量來(lái)源：60%豬油脂肪，20%蛋白質(zhì)，20%碳水化合物，購(gòu)自美國(guó)Research Diets公司。

1.3 儀 器

ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；石蠟切片機(jī)（Thermo Scientific，美國(guó)）；Axio Vert.A1倒置熒光顯微鏡（德國(guó)ZEISS）公司）；Medifuge?小型臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)ThermoFisher公司）；Cytation3多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；顯微成像系統(tǒng)（Motic，中國(guó)）；TissueFAXS成像系統(tǒng)（Tissue Gnostics GmbH，奧地利）；A1+共聚焦激光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.4 方 法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 12月齡C57BL/6J小鼠和APP/PS1雄性小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，正常組（普通C57BL/6J小鼠n=6）、普通高脂組（C57BL/6J+高脂飼料n=6）、癡呆組（APP/PS1小鼠n=6）、癡呆高脂組（APP/PS1小鼠+高脂飼料n=6）4組；正常組和癡呆組，普通飼料喂養(yǎng)6周；普通高脂組和癡呆高脂組，高脂飼料喂養(yǎng)6周。每周記錄小鼠體質(zhì)量變化情況。

1.4.2 動(dòng)物組織處理 麻醉給予100 mL/L水合氯醛腹腔注射后，常規(guī)消毒開(kāi)胸，用預(yù)冷的生理鹽水從心臟左心室灌注，排空血液后斷頭取腦。于冰板上分離小鼠左右腦，右腦用40 mL/L多聚甲醛固定48 h，依次經(jīng)750、850、950 mL/L，無(wú)水乙醇脫水，再用二甲苯透明處理后浸蠟，石蠟包埋切片。左腦分離大腦皮質(zhì)、海馬，液氮速凍，-80℃保存。

1.4.3 尼氏染色海馬神經(jīng)元尼氏小體檢測(cè) 選取備用石蠟切片，各組6只小鼠，每只選擇3張切片，65℃烘烤3 h后依次放入二甲苯Ⅰ15 min、二甲苯Ⅱ15 min、無(wú)水乙醇5 min、950 mL/L乙醇5 min、850 mL/L乙醇5 min、750 mL/L乙醇5 min和純水清洗。用尼氏染色試劑盒進(jìn)行焦油紫尼氏體染色，焦油紫試劑染色56℃，1 h。純水清洗后滴加分色液5 s，后經(jīng)無(wú)水乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。

1.4.4 免疫組化小膠質(zhì)細(xì)胞激活檢測(cè) 腦組織切片脫蠟處理同上述尼氏染色，后續(xù)用30 mL/L H2O2內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷后，加入90 mL/L蟻酸修復(fù)處理5 min。50 mL/L馬血清封閉30 min后滴加Iba-1Ⅰ抗（1：100），4℃過(guò)夜孵育，通用二步法檢測(cè)試劑盒滴加滴加100μL反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min；繼續(xù)滴加100μL增強(qiáng)酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育20 min。加入100μL DAB顯色液，室溫孵育5～8 min，自來(lái)水沖洗，蘇木素染色液孵育20 s，分化、沖洗返藍(lán)后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)脂封片。顯微鏡下觀察海馬區(qū)Iba-1小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況，每只小鼠選擇3張海馬區(qū)切片染色，每張切片選取均勻同等大小5個(gè)視野，Im?ageJ軟件計(jì)算分析每只小鼠海馬區(qū)Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.4.5 RT-PCR檢測(cè)海馬區(qū)IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子表達(dá)水平 取小鼠腦組織分離海馬，Trizol法提取海馬區(qū)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后-20℃保存。伯樂(lè)CFX96 Real-time PCR系統(tǒng)SYBR熒光染料法進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，IL-1β正向引物（5’→3’）為T(mén)CG?CAGCAGCACATCAACAAGAG，反向引物（3’→5’）為T(mén)GCTCATGTCCTCATCCTGGAAGG；IL-6正向引物（5’→3’）為CTCCCAACAGACCTGTCTATAC，反向引物（3’→5’）為CCATTGCACAACTCTTTTCT?CA；TNF-α正 向 引 物（5’→3’）為GTCT?CAGCCTCTTCTCATTCC，反向引物（3’→5’）為CTACAGGCTTGTCACTCGAA。β-Actin正向引物（5’→3’）為AAGTGTGACGTTGACATCCG，反向引物（3’→5’）為T(mén)CTGCATCCTGTCAGCAATG。反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃，15 s；58℃，15 s，40次循環(huán)。以2-??ct定量分析IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)水平。

1.4.6 免疫熒光TUNEL、caspase-1染色檢測(cè)細(xì)胞焦亡 腦組織切片脫蠟處理同上述尼氏染色，30 mL/L H202孵育10 min后，2.5 mL/L胰酶消化10 min。50 mL/L馬血清封閉1 h后滴加caspase-1Ⅰ抗（1：100），4℃過(guò)夜孵育，一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒避光孵育TUNEL染液37℃1 h，熒光Ⅱ抗Alexa Flour 488避光復(fù)染室溫1 h，DAPI染液孵育5 min，抗熒光淬滅劑封片。共聚焦激光顯微鏡成像，觀察癡呆小鼠海馬區(qū)TUNEL、caspase-1共染色情況，每只小鼠選擇3張海馬區(qū)切片染色，每張切片選取相同區(qū)域同等大小5個(gè)視野，ImageJ軟件計(jì)數(shù)每只小鼠海馬區(qū)TUNEL、caspase-1共染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.4.7 Western blot檢測(cè)海馬NLRP3、caspase-1表達(dá)情況 分離海馬組織用RIPA法裂解，超聲斷裂DNA后12 000 r/min（r=5 cm），4℃離心15 min，取上清BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白上樣量20μg/孔，100 V電壓電泳80 min，0.45μm PVDF膜200 mA，轉(zhuǎn)膜90 min，50 mL/L脫脂牛奶封閉1 h后孵育一抗：TBST（1：1 000），β-Actin為內(nèi)參蛋白，4℃孵育過(guò)夜。孵育二抗：TBST（1：10 000），37℃1 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)成像計(jì)算灰度值統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0、Stata 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)量資料滿足正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用2×2析因設(shè)計(jì)析對(duì)多因素交互作用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，二因素方差分析多組間差異，對(duì)不同時(shí)間結(jié)果進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，后用Bonferroni法多重比較；對(duì)單因素兩組間差異應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高脂飲食小鼠體質(zhì)量變化

監(jiān)測(cè)各組小鼠體質(zhì)量周變化如圖1所示，重復(fù)測(cè)量方差分析，不同時(shí)間體質(zhì)量變化F=9.131，P=0.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；時(shí)間與組別P>0.05，二者無(wú)交互作用。不同組別間體質(zhì)量變化P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 高脂飲食對(duì)各組小鼠體質(zhì)量影響Fig.1 Effects of high fat diet on body weight of mice in each group

2.2 高脂飲食增強(qiáng)癡呆小鼠海馬區(qū)炎性小膠質(zhì)細(xì)胞激活

各組小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)Iba-1免疫組化小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況如圖2所示，各組小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1染色數(shù)量經(jīng)2×2析因設(shè)計(jì)分析和Bonferroni多重比較分析，高脂飲食主效應(yīng)（F=13.969，P=0.005），APP/PS1基因主效應(yīng)（F=57.657，P=0.000），高脂與APP/PS1基因交互作用（F=8.290，P=0.018），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。癡呆小鼠和普通小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞激活會(huì)因使用高脂飼料而有顯著的差異，食用高脂飼料的癡呆小鼠，比正常飼料的癡呆小鼠均值高43.717（P=0.009），95%置信區(qū)間為（11.247，76.186）；食用高脂飼料的癡呆小鼠，比正常飼料的普通小鼠均值高74.867（P=0.000），95%置信區(qū) 間 為（42.397，107.336 ）。

圖2 高脂飲食增強(qiáng)癡呆小鼠海馬區(qū)Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目Fig.2 High fat diet enhanced the number of Iba-1 positive cells in the hippocampus of dementia mice

2.3 高脂飲食增強(qiáng)小鼠海馬炎性因子表達(dá)

對(duì)各組小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)水平進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)分析，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)2×2析因設(shè)計(jì)和Bonferroni多重比較分析，IL-1β高脂飲食主效應(yīng)（F=39.553，P=0.000），APP/PS1基 因 主 效 應(yīng)（F=24.289，P=0.000），高脂與APP/PS1基因交互作用（F=6.993，P=0.023），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。癡呆小鼠和普通小鼠IL-1βmRNA水平會(huì)因使用高脂飼料而有顯著的差異，食用高脂飼料的癡呆小鼠，比正常飼料的癡呆小鼠均值高0.997（P=0.001），95%置信區(qū)間為（0.440，1.553）；食用高脂飼料的癡呆小鼠，比正常飼料的普通小鼠均值高1.255（P=0.000），95%置信區(qū)間為（0.757，1.753）。IL-6高脂飲食主效應(yīng)（F=10.267，P=0.008），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，APP/PS1基因主效應(yīng)（P>0.05），高脂與APP/PS1基因交互作用（P>0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。喂食高脂飼料較普通飼料IL-6均值高0.455，95%置信區(qū)間為（0.146，0.764）。TNF-α高脂飲食主效應(yīng)（F=15.956，P=0.003），APP/PS1基因主效應(yīng)（F=62.339，P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高脂與APP/PS1基因交互作用（P>0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。喂食高脂飼料較普通飼料TNF-α均值高0.515，95%置信區(qū)間為（0.223，0.806）。癡呆小鼠較普通小鼠TNF-α均值高1.017，95%置信區(qū)間為（0.726，1.308）。

圖3 高脂飲食上調(diào)癡呆小鼠海馬區(qū)炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)Fig.3 High fat diet up-regulated the mRNA levels of inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-αin thehippocampus of dementia mice

2.4 高脂飲食對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的影響

各組小鼠腦部海馬CA1區(qū)尼氏染色如圖4所示，正常組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊緊密，細(xì)胞分布均勻，胞內(nèi)尼氏體充盈豐富；普通高脂組神經(jīng)元排列較為紊亂，胞內(nèi)尼氏體明顯減少，著色較淺，胞體腫脹擴(kuò)張，呈空泡狀，神經(jīng)元損傷，代謝功能減弱；癡呆組和普通組相比，神經(jīng)元排列稀疏，胞內(nèi)尼氏體染色淺，尼氏體數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)大小不一，可見(jiàn)不同程度神經(jīng)元損傷；癡呆高脂組較癡呆組神經(jīng)細(xì)胞稀疏，胞體邊界不清，尼氏小體更為稀少，表明神經(jīng)元損傷進(jìn)一步加劇。

圖4 高脂飲食對(duì)不同小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞組織病理學(xué)的改變Fig.4 Histopathological changes of hippocampal nerve cells in different miceinduced by high fat diet

2.5 高脂飲食對(duì)海馬區(qū)NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)的影響

Western blot測(cè)定各組小鼠海馬NLRP3、cas?pase-1蛋白表達(dá)如圖5所示，各組蛋白表達(dá)相對(duì)值經(jīng)2×2析因設(shè)計(jì)和Bonferroni多重比較分析，NLRP3高脂飲食主效應(yīng)F=25.256，P=0.001；APP/PS1基因主效應(yīng)F=38.629，P=0.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高脂與APP/PS1基因交互作用P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。喂食高脂飼料較普通飼料NLRP3相對(duì)表達(dá)量均值高0.074，95%置信區(qū)間為（0.40，0.108）。癡呆小鼠較普通小鼠NLRP3相對(duì)表達(dá)量均值高0.092，95%置信區(qū)間為（0.058，0.126）。

圖5 高脂飲食對(duì)不同小鼠海馬區(qū)NLRP3、caspase-1蛋白水平的影響Fig.5 Effects of high fat diet on NLRP3 and caspase-1 protein levels in hippocampus of different mice

caspase-1高脂飲食主效應(yīng)P>0.05；APP/PS1基因主效應(yīng)F=24.935，P=0.001，高脂與APP/PS1基因交互作用P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。癡呆小鼠較普通小鼠caspase-1相對(duì)表達(dá)量均值高0.937，95%置信區(qū)間為（0.504，1.369）。

2.6 高脂飲食影響癡呆小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞焦亡

對(duì)癡呆組和癡呆高脂組腦部海馬區(qū)進(jìn)行TU?NEL、caspase-1共定位熒光染色結(jié)果如圖6所示，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，癡呆高脂組較癡呆組小鼠腦內(nèi)caspase-1和細(xì)胞凋亡增加，且共定位表達(dá)顯著增強(qiáng)（t=-3.780，P=0.019），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 高脂飲食對(duì)癡呆小鼠海馬區(qū)TUNEL和caspase-1陽(yáng)性信號(hào)的影響Fig.6 Effects of high fat diet on TUNEL and caspase-1 co-positivity in hippocampus of dementia mice

3 討 論

肥胖被認(rèn)為是AD的重要危險(xiǎn)因素，研究支持高脂飲食引起的肥胖癥會(huì)加速AD小鼠模型中與AD相關(guān)的病理生理和記憶障礙［11-12］，能夠引起嚙齒類(lèi)動(dòng)物血外周炎癥增強(qiáng)［13］，目前認(rèn)為肥胖引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致癡呆病理?yè)p傷的主要原因。為探究高脂飲食誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥加重AD病理?yè)p傷的具體機(jī)制。本研究采用C57BL/6J小鼠和APP/PS1小鼠為動(dòng)物模型，給予高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)6周，觀察其體質(zhì)量增長(zhǎng)變化、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞焦亡、神經(jīng)元病理影響等，結(jié)果表明，高脂飲食能引起小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，加重癡呆小鼠腦內(nèi)神經(jīng)損傷和功能障礙。

3.1 高脂飲食增強(qiáng)小鼠海馬炎癥反應(yīng)，引起神經(jīng)功能障礙

本研究結(jié)果顯示，高脂飲食能夠引起普通小鼠和癡呆小鼠體質(zhì)量升高，引起肥胖。與New?combe［14］、Medrano-Jiménez［15］、Jena［16］等研究結(jié)果相符，高脂飲食能夠增強(qiáng)小鼠腦內(nèi)病理炎癥反應(yīng)。本研究表明高脂飲食能夠增加普通小鼠和癡呆小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)IL-1β、IL-6、TNF-α炎性因子表達(dá)，激活癡呆小鼠海馬區(qū)更多小膠質(zhì)細(xì)胞活化，改變神經(jīng)元形態(tài)，減少胞內(nèi)尼氏體，影響神經(jīng)元正常生理功能。對(duì)比癡呆小鼠和普通小鼠，癡呆模型小鼠自身腦內(nèi)具有慢性炎性反應(yīng)，此結(jié)果反映了慢性炎癥是引起阿爾茲海默病發(fā)病的重要原因之一［17］。Reilly等研究表明HFD喂養(yǎng)5×FAD小鼠加劇海馬小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)和炎性反應(yīng)［11］。本研究表明高脂飲食能夠進(jìn)一步激活A(yù)PP/PS1癡呆小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，引發(fā)更高水平炎性因子表達(dá)，進(jìn)一步加劇神經(jīng)元損傷，證明相較普通小鼠，高脂飲食對(duì)癡呆小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活負(fù)擔(dān)更重，釋放更多炎性因子，破壞腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)加劇，進(jìn)一步損傷神經(jīng)功能。

3.2 高脂飲食增強(qiáng)癡呆小鼠NLRP3/caspase-1、caspase-1/TUNEL表達(dá)，提示誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞焦亡

為探究炎癥反應(yīng)在高脂飲食誘發(fā)癡呆過(guò)程的具體機(jī)制，本文研究了高脂飲食對(duì)Nod樣受體蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體激活及caspase-1釋放變化情況。NLRP3炎性小體是先天性免疫應(yīng)答依賴(lài)的模式識(shí)別受體（pattern-rec?ognition receptors，PRR），炎性小體的激活是一組主要的炎性途徑［18］。在免疫和炎癥細(xì)胞中表達(dá)。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)固有免疫細(xì)胞，而神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞都能夠表現(xiàn)強(qiáng)烈的NLRP3炎癥反應(yīng)。NLRP3炎性小體由NLRP3蛋白、銜接蛋白凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和半胱氨酸蛋白酶前體（pro caspase-1）組成［19］。病原相關(guān)分子模式（PAMPs）或危險(xiǎn)相關(guān)分子模式（DAMP）被Toll樣受體（TLR）識(shí)別后激活NLRP3炎癥小體，一些細(xì)胞因子如TNF-α也能夠引起NLRP3炎性小體的激活［20］。將NLRP3、ASC和pro caspase-1組裝成復(fù)合物，進(jìn)而觸發(fā)pro cas?pase-1蛋白水解向caspase-1的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生和分泌成熟IL-1β和IL-18炎癥因子，作用后續(xù)持久的炎癥反應(yīng)［21］。caspase-1能夠介導(dǎo)細(xì)胞炎性程序性壞死即細(xì)胞焦亡［22］。本研究表明高脂飼料能夠增強(qiáng)癡呆小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，加劇激活NL?RP3炎性小體使caspase-1分泌增加。癡呆小鼠海馬NLRP3和caspase-1明顯高于普通小鼠，高脂飼料喂食癡呆小鼠caspase-1和TUNEL共定位染色增多，進(jìn)一步說(shuō)明高脂飲食促進(jìn)癡呆小鼠神經(jīng)細(xì)胞焦亡，加重腦內(nèi)神經(jīng)損傷。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討神經(jīng)細(xì)胞焦亡途徑中caspase-1前體、IL-1β前體、IL-1β、IL-18表達(dá)變化，為探究神經(jīng)細(xì)胞焦亡途徑奠定研究基礎(chǔ)。

3.3 結(jié) 論

本文初步探討了高脂飲食誘發(fā)神經(jīng)炎性反應(yīng)、影響神經(jīng)功能、加重癡呆的機(jī)制，驗(yàn)證了高脂飲食能夠增強(qiáng)小鼠腦內(nèi)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，加重癡呆小鼠神經(jīng)細(xì)胞焦亡進(jìn)而加重腦內(nèi)神經(jīng)損傷。