程潔鴻，張桂梁，郭寶劍，孫業(yè)偉，張高小，王玉強，張在軍

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405；2.暨南大學藥學院新藥研究所，廣東廣州510632）

阿爾茨海默病是一類在老年人群中病率非常高的神經(jīng)退行性疾病，主要的臨床病理特征是在大腦中出現(xiàn)淀粉樣斑塊沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)，臨床表現(xiàn)為認知能力出現(xiàn)障礙并伴隨記憶能力衰退［1］。截止到2020年，全球大約有5 000萬名AD患者，到2050年，AD患者的人數(shù)將達到1.5億左右，不斷加重社會與家庭的經(jīng)濟負擔；臨床上目前應(yīng)用于治療AD的藥物主要包括NMDA受體拮抗劑（美金剛）和乙酰膽堿酯酶抑制劑（多奈哌齊、加蘭他敏）兩類藥物，但是這兩類藥物只能延緩疾病的癥狀，并不能逆轉(zhuǎn)疾病的進程［2］。因此，尋找有效治療AD的藥物迫在眉睫。J147是姜黃素的衍生物（圖1），是美國Salk研究所研發(fā)的一個多功能神經(jīng)保護藥物［3］，在AD動物模型中展現(xiàn)出非常好的療效，通過調(diào)控線粒體，降低Aβ淀粉樣斑塊沉積，減輕小鼠的認知障礙，并延緩衰老［4-5］，目前正在人體中進行臨床Ⅰ期的試驗；TMP是從中藥川芎中提取出來的活性成分，易通過血腦屏障系統(tǒng)，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療。基于前期對化合物J147和四甲基吡嗪（TMP）的研究，我們設(shè)想利用TMP穿過血腦屏障的特點，將J147結(jié)構(gòu)中的苯氧甲基替換成TMP，合成了目標化合物T-006（圖1）［6］，希望能夠進一步提高腦組織與血漿中的藥物比，又能保持J147的生物活性，進而在治療神經(jīng)退行性疾病發(fā)揮作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，T-006具有較好的神經(jīng)保護作用，在PD模型中能夠改善模型小鼠的行為學表現(xiàn)，提高陽性酪氨酸羥化酶的數(shù)量，促進α-syn蛋白清除［7］，但是在AD模型中的療效及作用機制有待于進一步的探究。APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)既有淀粉樣蛋白沉積，同時也會在神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)纖維纏結(jié)，該模型最大程度的模擬AD病人的動態(tài)病理變化，是目前研究AD疾病最常用的動物研究［8］；AD疾病在人群中存在性別差異，女性患病的概率是高于男性的。因此，在本次研究中選用雌性的APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對象，結(jié)合前期J147的作用機制，本研究以主要圍繞淀粉樣蛋白、突觸蛋白以及BDNF/CREB信號通路等方面開展探究，為AD疾病的防治提供有效的實驗依據(jù)。

圖1 姜黃素、J147、TMP和T-006結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of Curcumin，J147，TMPand T-006

1 材料與方法

1.1 實驗用動物及分組

8月齡的APP/PS1/Tau（3×Tg）轉(zhuǎn)基因小鼠（雌性，22～25 g），飼養(yǎng)于深圳市疾病預(yù)防控制中心毒理科實驗動物中心SPF級環(huán)境動物房（實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2015-0068），室內(nèi)溫度維持在（22±2）oC，濕度在50%～80%，12 h/12 h循環(huán)光照，小鼠可以自由進食和飲水。實驗動物使用過程中嚴格遵循3R原則，本實驗的所有流程均符合深圳市疾病預(yù)防控制中心實驗動物倫理委員會的要求。

WT和3×Tg轉(zhuǎn)基因小鼠共分為8組，分組如下：WT組、WT＋T-006（10 mg/kg）組、3×Tg組、T-006低、中、高劑量組（1，3和10 mg/kg）、多奈哌齊組（1.3 mg/kg）、美金剛（5 mg/kg）。

T-006溶解于橄欖油中，多奈哌齊和美金剛?cè)芙庥?.9%的生理鹽水中；T-006和多奈哌齊1 d給藥1次，美金剛1 d給藥2次。模型組小鼠給予等體積的橄欖油，WT組小鼠給予等體積的生理鹽水。

1.2 實驗用主要儀器與試劑

電子天平（梅特勒斯，德國）；曠場實驗裝置、Morris水迷宮實驗裝置、黑白箱實驗裝置、ZHMGY型新物體識別系統(tǒng)（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；超純水系統(tǒng)（Merck Millipore Corpora?tion）；倒置熒光顯微鏡（Olympus Corporation）；圖像自動采集軟件、軟件分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技公司）。

T-006由實驗室合成（批號：MC10790-123-T-006A），多奈哌齊和美金剛購買于京東大藥房；載玻片購買于江蘇世泰公司；50×檸檬酸抗原修復(fù)液、RIPA裂解液、一抗稀釋液等購買于上海碧云天生物科技有限公司；鼠兔通用型免疫組化顯色試劑盒購自于基因科技有限公司；PSD95、BDNF、synapto?physin、p-CREB、CREB、β-actin等一抗購自于CST公司；synapseⅠ、synapseⅡ、APP、BACE-1等一抗購自于Abcam公司；免疫印跡二抗均購自于CST公司；ECL發(fā)光液購自于杭州弗德生物科技有限公司。

1.3 水迷宮實驗

水迷宮實驗參考文獻［9］，步驟簡要如下：本實驗分為定位航行訓練和空間探索兩部分。訓練期（隱藏平臺于水下），小鼠隨機的從N、E、SE、NW四個方位面壁放入水池中，在60 s以內(nèi)記錄小鼠找到平臺的時間，超過60 s尚未找到平臺的小鼠，則人工引導(dǎo)小鼠找到平臺，并在平臺待10～15 s。每只小鼠按四個方位起始點一共測試4次，分別記錄其找到平臺的時間，沒有找到平臺則記為60 s，連續(xù)訓練5 d后，將隱藏在水中的平臺撤掉，從平臺對角線方位（NE）將小鼠放入水池中，記錄2 min內(nèi)小鼠第1次找到平臺的時間以及穿越平臺次數(shù)等指標。

1.4 電跳臺實驗

電跳臺實驗參考文獻［10］，步驟簡要如下：在跳臺裝置中心設(shè)置一個可以通電的鐵網(wǎng)，將小鼠放在鐵網(wǎng)適應(yīng)5 min，期間給鐵網(wǎng)通電（恒壓為35 V），小鼠受到電擊時會本能的跳上平臺，經(jīng)過多次訓練后，記憶能力好的小鼠會停留在平臺上。在測試期，將小鼠放在平臺上，記錄小鼠第一次找到碰觸鐵網(wǎng)時間以及小鼠跳下平臺的次數(shù)（犯錯次數(shù)）。

1.5 新物體識別實驗

新物體識別實驗步驟簡要如下［11］：在曠場兩個角落各放置一個相同的長方體，將小鼠面壁放入裝置中，自由探索5 min。連續(xù)訓練3 d后，將其中的一個長方體換成圓柱體，使用攝像頭記錄小鼠5 min的運動軌跡。小鼠探索舊物體和新物體的時間分別記為T1和T2，作為評價小鼠記憶能力的指標。小鼠對新舊物體的辨別能力用DI表示，具體計算算式為：DI=（T2-T1）/（T1+T2）。

1.6 免疫組化

小鼠腹腔注射10 g/L水合氯醛麻醉，打開小鼠胸腔，暴露心臟，依次灌注生理鹽水和40 g/L多聚甲醛溶液，待小鼠尾巴僵硬，結(jié)束灌流。小鼠頭部剪下，取出腦組織浸泡于40 g/L多聚甲醛中。

采用石蠟包埋腦組織并切片（厚度為5μm），石蠟切片置于60℃烘箱中，烘片1 h，脫蠟至水，檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，通透，10%FBS封閉非特異性結(jié)合位點，一抗孵育過夜，PBS洗片，二抗室溫孵育，PBS洗片，DAB顯色，蘇木素核染，脫水透明，封片，使用倒置顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.7 Western blotting

提取海馬組織蛋白，BCA蛋白定量，變性。按照15μg上樣量進行電泳實驗，經(jīng)10%SDS-PAGE膠，恒壓條件下分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，常溫使用5%的脫脂牛奶封閉90 min。4℃冰箱過夜孵育PSD95（1：2 000）、BDNF（1：1 000）、synapto?physin（1：2 000）、synapseⅠ（1：2 000）、synapseⅡ（1：2 000）、p-CREB（1：1 000）、CREB（1：1 000）、APP（1：2 000）、BACE-1（1：2 000）、β-actin（1：2 000）等抗體。TBST洗膜（10 min×3次），二抗（An?ti-Rabbit，Anti-Mouse）室溫孵育90 min。TBST洗膜（5 min×3次）。利用ECL發(fā)光液，凝膠成像儀觀察目的蛋白表達情況，Image J進行圖像灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計分析

采用Graphpad 8.0進行數(shù)據(jù)分析處理，均以均值±標準差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差分析差異有統(tǒng)計學意義時采用LSD（Least Significant Differ?ence）法進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 T-006提高APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因小鼠的行為學表現(xiàn)

如圖2所示，經(jīng)單因素方差分析，8組間辨別指數(shù)DI差異無統(tǒng)計學意義（F=1.849，P=0.088）。

圖2 T-006對APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因小鼠行為學的影響Fig.2 The effect of T-006 on the behavior test of APP/PS1/Tau transgenic mice

經(jīng)單因素方差分析，八組間潛伏期（step down latency）差異有統(tǒng)計學意義（F=6.082，P=0.000）；采用LSD法進行兩兩比較，與WT相比，模型組小鼠會顯著性地降低小鼠在電跳臺實驗中的潛伏期（103.70±34.66vs.268.70±18.28，P=0.000）；與模型相比，T-006可以增加小鼠在電跳臺實驗中的潛伏期，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），多奈哌齊和美金剛顯著性地提高小鼠在電跳臺實驗中的潛伏期（274.70±20.20vs.103.70±34.66，P=0.000；206.40±31.82vs.103.70±34.66，P=0.018）。

經(jīng)單因素方差分析，8組間犯錯次數(shù)（number of errors）差異有統(tǒng)計學意義（F=2.923，P=0.008）；采用LSD法進行兩兩比較，與WT相比，模型組小鼠會增加電跳臺實驗中犯錯的次數(shù)（1.909±0.768vs.0.270±0.140，P=0.014）；與模型相比，T-006（3 mg/kg）減少小鼠在電跳臺中的犯錯次數(shù)（0.231±0.121vs.1.909±0.768，P=0.009），多奈哌齊也可以減少小鼠犯錯的次數(shù)（0.308±0.133vs.1.909±0.768，P=0.012），但美金剛不影響小鼠的犯錯次數(shù)（P>0.05）。

經(jīng)單因素方差分析，8組間穿越平臺次數(shù)（number of platform-site crossovers）差異無統(tǒng)計學意義（F=1.989，P=0.066）。

2.2 T-006降低APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因小鼠APP蛋白的表達

如圖3A所示，通過免疫組化染色觀察發(fā)現(xiàn)，與WT相比，模型組中Aβ淀粉樣斑塊沉積顯著增加；與模型相比，T-006（3 mg/kg）可以減少斑塊沉積。

Western blotting結(jié)果顯示（圖3B、C），經(jīng)單因素方差分析，六組間APP表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=5.669，P=0.003）；采用LSD法進行兩兩比較，與WT相比，模型組中APP表達量顯著增加（2.108±0.175vs.1.000±0.041，P=0.000）；與模型相比較，T-006（10 mg/kg）可以顯著性降低APP的表達量（1.315±0.097vs.2.108±0.175，P=0.004）。

圖3 T-006對APP/PS1/Tau小鼠海馬區(qū)APP剪切過程及Aβ淀粉樣蛋白斑塊的影響Fig.3 The effects of T-006 on the expression of on APPcleavage process and Aβplaques in the hippocampusof APP/PS1/Tau mice

經(jīng)單因素方差分析，6組間BACE-1表達量差異無統(tǒng)計學意義（F=2.112，P=0.114）。

2.3 T-006增加APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因小鼠突觸相關(guān)蛋白的表達

Western blotting結(jié)果顯示（圖4），經(jīng)單因素方差分析，六組間PSD95表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=5.987，P=0.002）；采用LSD法進行兩兩比較，與模型相比較，T-006（1 mg/kg）可以提高PSD95表達量（1.445±0.070vs.0.760±0.062，P=0.000）。

圖4 T-006對APP/PS1/Tau小鼠海馬區(qū)突觸相關(guān)蛋白的影響Fig.4 The effects of T-006 on synapse-associated proteins in the hippocampus of APP/PS1/Tau mice

經(jīng)單因素方差分析，6組間synaptophysin表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=3.511，P=0.022）；采用LSD法進行兩兩比較，與模型相比較，T-006（1 mg/kg）可以 提 高synaptophysin表 達 量（1.189±0.034vs.0.869±0.053，P=0.005）。

經(jīng)單因素方差分析，6組間synapsinⅠ表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=11.79，P=0.000）；采用LSD法進行兩兩比較，與模型相比較，T-006（1、3、10 mg/kg）可以提高synapsinⅠ表達量（1.736±0.073vs.0.839±0.050，P=0.000；1.718±0.124vs.0.839±0.050，P=0.000；1.314±0.153vs.0.840±0.050，P=0.007）。

經(jīng)單因素方差分析，6組間synpainⅡ表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=5.015，P=0.006）；采用LSD法進行兩兩比較，與模型相比較，T-006對于syn?painⅡ的表達無影響（P>0.05）。

2.4 T-006提高APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因小鼠CREB/BDNF通路蛋白的表達

Western blotting結(jié)果顯示（圖5），經(jīng)單因素方差分析，6組間p-CREB表達量差異無統(tǒng)計學意義（F=1.267，P=0.335）。

圖5 T-006對APP/PS1/Tau小鼠海馬區(qū)CREB/BDNF通路蛋白的影響Fig.5 The effects of T-006 on BDNF-CREB signaling pathway in the hippocampusof APP/PS1/Tau mice

經(jīng)單因素方差分析，六組間BDNF表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=6.509，P=0.004）；采用LSD法進行兩兩比較，和模型相比較，T-006（1 mg/kg）提高BDNF的表達量（2.032±0.522vs.0.526±0.051，P=0.001）。

3 討 論

阿爾茨海默病是一類在老年人群中發(fā)病率極高的疾病，發(fā)病作用機制尚不明確，臨床尚沒有可以藥物治愈AD。研究發(fā)現(xiàn)，突觸相關(guān)蛋白突觸在記憶、神經(jīng)元信號傳導(dǎo)等方面扮演重要角色，通過調(diào)控突觸蛋白可能是治療AD的有效途徑。

參考T-006前期在帕金森疾病模型中的藥效學研究［12］，本次研究中T-006設(shè)低、中、高（1、3、10 mg/kg）3個劑量，同時添加陽性藥（美金剛和多奈哌齊）做對照。在行為學研究中，我們可以看到，T-006在改善小鼠學習與記憶能力方面效果較好。在電跳臺實驗中，T-006與多奈哌齊有大體等同的藥效；在新物體實驗中，T-006有提高辨別指數(shù)DI的趨勢。因此，從行為學數(shù)據(jù)推測，T-006在治療AD疾病中有較大的潛力。

包括淀粉樣蛋白級聯(lián)假說等被認為是AD發(fā)病的重要原因。特別是最早提出的Aβ假說，一直是被認為是AD發(fā)病的核心原因。APP又稱為淀粉樣前體蛋白，是一種跨膜蛋白，由APP生成的產(chǎn)物有兩種形式，Aβ1-42是APP在β（BACE-1）、γ切割酶的作用下形成的肽段；Aβ1-42淀粉樣蛋白是老年斑塊的組成成分，也是AD疾病重要的病理學標志之一，在疾病發(fā)展過程中扮演重要角色［13］。研究發(fā)現(xiàn)，T-006不僅可以抑制APP蛋白的表達，同時也減少淀粉樣斑塊沉積，這對于下游信號通路的調(diào)節(jié)這是非常關(guān)鍵的。在AD患者中值得注意的是，最典型的病理特征是斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)，但突觸功能障礙與記憶力和認知能力下降有更強的關(guān)聯(lián)性［14］。在淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)出現(xiàn)之前，AD患者中就發(fā)生突觸功能障礙，這表明在AD早期產(chǎn)生的可溶性Aβ寡聚體可能會破壞突觸功能［15］。研究表明，Aβ聚集形成的寡聚物，有神經(jīng)毒性，會破壞谷氨酸的攝取水平，過度激活NMDA受體，Ca2+超載，破壞突觸的傳遞功能造成突觸障礙，進而影響學習和記憶能力［16］。PSD95是一種重要的支架蛋白，可以調(diào)節(jié)NMDA受體的突觸分布和活性，PSD95表達下降是由Aβ引起的病理級聯(lián)反應(yīng)中的重要中間步驟［17］。在AD病人中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括PSD95、synaptophysin、SNAP-25等突觸相關(guān)蛋白表達量下降的現(xiàn)象，特別是海馬區(qū)突觸相關(guān)蛋白丟失較為嚴重［18］。本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)T-006可以顯著性地提高PSD95、synaptophysin、synapsinⅠ蛋白的表達量，而且T-006可以提高3×Tg小鼠的行為學習與記憶能力。因此，我們初步推測小鼠學習與記憶能力的改善與突觸蛋白表達量的升高密切相關(guān)。

cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)與神經(jīng)元分化，突觸可塑性，學習和記憶有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）［19］；BDNF是一種CREB依賴性基因，在突觸的形成和可塑性方面扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者中BDNF的mRNA水平和蛋白表達量顯著下降；體外實驗中，Aβ通過CREB降低BDNF的水平，可能導(dǎo)致突觸喪失和神經(jīng)變性［20］。BDNF也可以調(diào)節(jié)APP的代謝進程，減少Aβ產(chǎn)生［21］。AD患者中神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路的破壞可能與認知能力下降有關(guān)［22］，CREB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄已被廣泛分析，因此，靶向作用于CREB-BDNF可能是治療AD疾病的關(guān)鍵通路［23］。更為重要的是，即使在AD臨床發(fā)作后，通過調(diào)節(jié)CREB的mRNA水平來增加BDNF的表達也可以逆轉(zhuǎn)患者記憶缺陷和認知功能障礙［24］。與文獻報道相符合，本次實驗中，T-006促進BDNF含量的增加，因此，我們推測，APP以及突觸蛋白表達的變化與CREB/BDNF通路的激活有關(guān)。

綜上所述，本研究證明了T-006在調(diào)節(jié)APP、突觸蛋白表達方面效果顯著，可以改善3×Tg小鼠的記憶和認知功能障礙，推測和突觸相關(guān)蛋白表達的增加密切相關(guān)，為進一步研發(fā)T-006抗AD提供了實驗依據(jù)。