陳秋荷，涂亞林，侯加衛(wèi)，陳 晨，魯俊鋒，皮榮標(biāo)

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理教研室，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006；3.中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東深圳518107）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常見的癡呆癥類型，預(yù)計2050年，AD患者人數(shù)將達(dá)到1.35億人，將會給患者家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)［1］。AD病因復(fù)雜，但常見治療藥物靶點單一、療效有限，不能從源頭緩解疾病發(fā)生發(fā)展；因此，開發(fā)新型AD藥物意義重大。以往基于單靶點策略的AD藥物研發(fā)屢屢失敗，部分研究人員認(rèn)為將兩個或多個藥效團結(jié)合到單一分子中，針對AD多個病理過程，獲得協(xié)同治療AD作用的單分子多靶點策略有望成功治療AD的新途徑［2］。AD從發(fā)病特點上可分為家族性AD（familial Alzheimer’s disease，fAD）和散發(fā)性AD（sporadic Alzheimer’s disease，sAD），其中sAD占絕大多數(shù)（>95%）［3］。大鼠/小鼠側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素（intracerebroventricular streptozotocin，icv-STZ）會誘導(dǎo)意識障礙［4］，引起胰島素受體的自身磷酸化和增加內(nèi)在酪氨酸激酶、磷酸化酪氨酸磷酸酶的活性，進(jìn)而會導(dǎo)致胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制，破壞腦中的葡萄糖和能量代謝［5］。并且側(cè)腦室注射STZ除了會影響海馬和皮層的葡萄糖代謝外，還能導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的激活所引起炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、突觸功能障礙、Tau蛋白過度磷酸化等AD樣病理特征［4，6-7］，因此被認(rèn)為是研究AD（尤其是sAD）發(fā)病機制及相關(guān)藥物研發(fā)的重要動物模型之一［8］。PT109［5-（1、2-二硫戊環(huán)-3-yl）-n-（4-（異喹啉-5-基氨基）環(huán)己基）戊酰胺］是基于單分子多靶點策略設(shè)計的多激酶抑制劑，可抑制GSK3β等蛋白激酶的活性；前期實驗已表明PT109能改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，緩解神經(jīng)炎癥，降低Tau蛋白的磷酸化水平并且具有良好的藥物代謝特性及血腦屏障透過性［9］。本研究擬進(jìn)一步在icv-STZ小鼠模型中探討PT109對sAD的作用，希望能進(jìn)一步闡明PT109的作用機制，為其深入研究提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

本實驗用到的試劑如下：鏈脲佐菌素（sigma，美國）；PT109［5-（1、2-二硫戊環(huán)-3-yl）-n-（4-（異喹啉-5-基氨基）環(huán)己基）戊酰胺］由實驗室制備（圖1，純度99%）；免疫組化試劑盒（KIT-9710，邁新）；DAB（博奧森，C02-04001）；BCA試劑盒（Thermo，#23225）；一抗：anti-Iba1（wako，#019-19741）；anti-MAP2（CST，#4542S）；anti-Tuj1（Bio?Legend，#801201）；anti-NLRP3（CST，#15101）；an?ti-PSD95（CST，#3450S）；anti-p-Tau（abcam，#ab109390）；anti-p-GSK3β（Bioword，#BS4084）；an?ti-β-actin（Thermo，#MA5-15739）；免疫熒光二抗：Rhodamine red-X goat anti-rabbit IgG（life technolo?gies，#R-6394）；免疫印跡二抗：Goat anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（碧云 天，A0208）；Goat anti-Mouse IgGH&L（HRP）（碧云天，A0216）；DAPI（碧云天，C1002）；ECL顯影液（Millipore，美國）；高爾基染色試劑盒（FDNeuro Technologies，美國）。

圖1 PT109結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of PT109

1.2 實驗動物

7周齡雄性健康的SPF級C57BL/6小鼠購于南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2015-0001，實驗動物質(zhì)量合格證號：No.32002100003485；飼養(yǎng)于中山大學(xué)實驗動物中心，使用許可證：SYXK（粵）2016-0112。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，溫度為（20～26）℃，濕度為40%～70%，晝夜明暗交替時間為12/12 h。小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開展實驗，相關(guān)實驗倫理申請獲得中山大學(xué)實驗動物管理與使用委員會批準(zhǔn)（No.2017-417XS）。

1.3 動物模型建立與分組給藥

腹腔注射戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）麻醉小鼠，固定于腦立體定位儀（NeuroStar），打開頭皮，確定注射位置后，使用微量注射器將STZ（每天3 mg/kg，第1、3天）注射入小鼠的左右側(cè)腦室，每個注射位點5μL；正常組與模型組前期操作一致，但注射等量生理鹽水。術(shù)后縫合，涂抹紅霉素軟膏，待蘇醒后將模型小鼠隨機分組。實驗過程中將小鼠共分為正常組、模型組、低劑量組（30 mg/kg）、高劑量組（100 mg/kg）。PT109使用含等摩爾量檸檬酸鈉的20%羥丙基-β-環(huán)糊精溶液溶解，腹腔注射給藥2周后，通過Morris水迷宮、避暗實驗評價小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，行為學(xué)實驗期間，小鼠仍每日給藥，整個實驗周期為4周。

1.4 Morris水迷宮實驗

給藥2周后，開展Morris水迷宮實驗評價小鼠學(xué)習(xí)記憶能力［9］。實驗分為適應(yīng)性實驗、訓(xùn)練實驗、探索實驗3部分。適應(yīng)性實驗期間，平臺露出水面，記錄小鼠60 s內(nèi)的游泳速度及找到平臺的潛伏期。第2～6天開展訓(xùn)練實驗，訓(xùn)練實驗期間，隱藏平臺（第三象限）。小鼠從第一象限放入池中，如在60 s內(nèi)找不到平臺，將引導(dǎo)小鼠找到平臺并在平臺上保持15 s；每天每只小鼠分別以四個象限為入水點，進(jìn)行4輪學(xué)習(xí)。第7天開展探索實驗，將平臺撤去，小鼠從第一象限放入池中，記錄小鼠60 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)和在目標(biāo)象限（原平臺所在象限）的游泳時間和游泳路徑比。

1.5 避暗實驗

水迷宮實驗結(jié)束后次日開展避暗實驗［9］。該實驗分為3個階段：適應(yīng)性實驗、訓(xùn)練實驗和測試實驗。第1天，將小鼠從亮室中放入裝置中，另其自由探索，對裝置進(jìn)行適應(yīng)180 s。第2天，將裝置暗室電擊裝置打開，小鼠從亮室放入裝置中，記錄300 s內(nèi)小鼠活動情況。24 h后，對小鼠進(jìn)行無電擊記憶保留實驗。將小鼠從亮室放入裝置內(nèi)，記錄小鼠在300 s內(nèi)進(jìn)入暗室的次數(shù)和進(jìn)入暗室的時間。

1.6 免疫熒光實驗

將各組小鼠腦片用PBS潤洗3次，在室溫下使用含有Triton X-100的免疫熒光封閉液孵育1 h。隨后孵育一抗，4℃過夜。次日用PBS潤洗3次，每次5 min。使用熒光標(biāo)記的二抗對避光孵育1 h，隨后用PBS潤洗3次，每次5 min。使用DAPI進(jìn)行染核7 min，隨后使用PBS潤洗3次，每次5 min。將腦片撈出置于玻片，暗處陰干后滴加熒光淬滅劑進(jìn)行封片，拍攝。

1.7 免疫組化實驗

根據(jù)免疫組化試劑盒說明書對腦片進(jìn)行免疫組化染色［9］。使用PBS潤洗腦片3次后，加入A液孵育30 min，PBS潤洗3次，每次5 min，然后使用B液進(jìn)行封閉1 h，隨后在4℃孵育一抗過夜。次日用PBS對潤洗3次，每次5 min。室溫孵育C液1 h，隨后用PBS潤洗3次，每次5 min。使用D液室溫下孵育1 h。用PBS潤洗后，使用DAB進(jìn)行染色，自來水終止染色，80%-100%乙醇梯度脫水，含二甲苯中性樹脂封片，拍攝。

1.8 免疫印跡法

將提取的蛋白樣品定量后加上樣緩沖液沸水煮5 min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)到PVDF膜，5%BSA溶液室溫封閉2 h，分別加NL?RP3、p-Tau、p-GSK3β一抗（1：1 000）4℃孵育過夜，二抗（1：5 000）室溫孵育1.5 h，用化學(xué)發(fā)光液顯影，曝光成像。

1.9 高爾基染色

采用高爾基染色試劑盒進(jìn)行染色。每組處死3只小鼠，用ddH2O潤洗腦組織。然后在室溫下用A+B混合液暗處浸泡14 d，再用C液浸泡5 d。使用冷凍切片機切片，厚度為180μm。切片按說明書所述用D溶液染色，封片拍攝。

1.1 0 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析或雙因素方差分析，多重比較采用Tukey法。Iba1陽性細(xì)胞數(shù)、樹突棘密度以及免疫印跡蛋白灰度值采用Image J軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)值均通過GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PT109改善icv-STZ小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙

給藥2周后，開展Morris水迷宮實驗、避暗實驗對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行評價。在水迷宮實驗中，如圖2A、B、D所示，經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組小鼠游泳速度未存在統(tǒng)計學(xué)差異（適應(yīng)實驗：F=2.733，P=0.062 5；訓(xùn)練實驗：F=1.621，P=0.187 2；探索實驗：F=0.081 12，P=0.969 7）。如圖2 C所示，經(jīng)雙因素方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第2～6天的訓(xùn)練實驗結(jié)果表明，各組小鼠的潛伏期會隨著訓(xùn)練時間增加而逐漸縮短，且各組小鼠潛伏期存在統(tǒng)計學(xué)差異［訓(xùn)練時間：［F（3，174）=10.67，P<0.001；組間：F（3，174）=12.36，P<0.001］。如圖2（E-G）所示，經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在探索實驗中，各組小鼠在平臺穿越次數(shù)（F=4.493，P=0.009 5）、目標(biāo)象限的時間比例（F=4.517，P=0.010 5）、路徑比例（F=5.122，P=0.006）存在統(tǒng)計學(xué)差異；采用Tukey法進(jìn)一步做兩兩比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比，低劑量和高劑量PT109均能顯著增加小鼠穿越平臺次數(shù)（P<0.05，P<0.05），提高小鼠在目標(biāo)象限的時間比例（P<0.01，P<0.05）；低劑量PT109能顯著增加小鼠在目標(biāo)象限路程比例（P<0.01），高劑量組與模型組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。如圖2H、I所示，經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)避暗實驗中，各組間潛伏期（F=5.695，P=0.003 3）和錯誤次數(shù)（F=10.03，P<0.000 1）存在統(tǒng)計學(xué)差異；采用Tukey法進(jìn)一步做兩兩比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比，高劑量PT109能顯著增加小鼠進(jìn)入暗室的潛伏期（P<0.05），而低劑量組數(shù)據(jù)與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；但PT109在低劑量和高劑量條件下均能減少小鼠進(jìn)入暗室的錯誤次數(shù)（P<0.05，P<0.01）。

圖2 PT109改善icv-STZ小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力Fig.2 PT109 improved spatial learning ability of icv-STZ mice

2.2 PT109減少icv-STZ小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量

通過免疫熒光及免疫組化法檢測小鼠海馬及皮層Iba1陽性細(xì)胞數(shù)量。如圖3 A-D所示，經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組小鼠Iba1陽性細(xì)胞數(shù)量在海馬區(qū)域存在統(tǒng)計學(xué)差異（F=17.15，P=0.001），而在皮層區(qū)域不存在統(tǒng)計學(xué)差異（F=2.958，P=0.063 9）；采用Tukey法進(jìn)一步做兩兩比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加（P<0.001），與正常組數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計學(xué)差異。PT109干預(yù)后海馬區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量減少（P<0.001），與模型組數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計學(xué)差異。但在皮層區(qū)域與模型組卻差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。同時我們檢測了小鼠海馬內(nèi)NLRP3炎癥小體的蛋白表達(dá)水平，各組間數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計學(xué)差異（F=6.326，P=0.016 6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量的PT109能顯著下調(diào)icv-STZ小鼠海馬NLRP3蛋白水平（P<0.05，圖3E、F）。

圖3 PT109減少icv-STZ小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量并降低NLRP3蛋白表達(dá)水平Fig.3 PT109 reduced the number of microglia and decreased NLRP3 levelsin icv-STZ mice

2.3 PT109減少icv-STZ小鼠的神經(jīng)元丟失

我們通過免疫熒光法檢測神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記蛋白Tuj1和MAP2的表達(dá)情況，如圖4所示，經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組小鼠海馬（F=6.882，P=0.002 3）和皮層區(qū)域（F=20.33，P<0.000 1）相關(guān)數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計學(xué)差異；采用Tukey法進(jìn)一步做兩兩比較，結(jié)果與正常組相比，模型組小鼠海馬和皮層中Tuj1和MAP2陽性細(xì)胞數(shù)量均大幅減少，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01，P<0.001）。與模型組相比，高劑量PT109干預(yù)后可增加icv-STZ小鼠海馬和皮層Tuj1和MAP2陽性細(xì)胞數(shù)量（P<0.05，P<0.01），但低劑量組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖4 PT109增加icv-STZ小鼠Tuj1和MAP2表達(dá)水平Fig.4 PT109 increased the Tuj1 and MAP2 expression of icv-STZ mice

2.4 PT109增加icv-STZ小鼠樹突棘密度

我們用高爾基染色法對小鼠腦組織進(jìn)行染色。如圖5A所示，經(jīng)單因素方差分析，各組小鼠樹突棘密度存在統(tǒng)計學(xué)差異（F=33.07，P<0.000 1）；采用Tukey法進(jìn)一步做兩兩比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組相比，模型組小鼠額葉皮質(zhì)樹突棘密度下降（P<0.001），具有統(tǒng)計學(xué)差異。而低劑量和高劑量PT109能增加icv-STZ小鼠樹突棘密度（P<0.001，P<0.001），相關(guān)數(shù)據(jù)與模型組具有統(tǒng)計學(xué)差異。另外，我們檢測海馬PSD95蛋白水平，發(fā)現(xiàn)各組PSD95蛋白表達(dá)存在統(tǒng)計學(xué)差異（F=6.32，P=0.016 7）；高劑量PT109可增加icv-STZ小鼠PSD95的表達(dá)水平（P<0.05）。

2.5 PT109對icv-STZ小鼠Tau蛋白、GSK3β磷酸化水平的影響

我們檢測了各組小鼠海馬中Tau蛋白磷酸化水平，經(jīng)單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)各組數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計學(xué)差異（F=12.95，P=0.001 9）；采用Tukey法進(jìn)一步做兩兩比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組相比，模型組小鼠Tau蛋白磷酸化水平具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），低劑量和高劑量的PT109能降低icv-STZ小鼠Tau蛋白磷酸化水平，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05，P<0.01）。同時，我們檢測了GSK3β的磷酸化水平，經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果顯示各組數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計學(xué)差異（F=7.006，P=0.012 5）；采用Tukey法進(jìn)一步做兩兩比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組S9位點的GSK3β磷酸化水平明顯降低（P<0.05），高劑量的PT109能逆轉(zhuǎn)下調(diào)趨勢（P<0.05；圖6）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，PT109能改善icv-STZ小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，PT109減少icv-STZ小鼠中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，降低NLRP3炎癥小體的蛋白表達(dá)水平，表明PT109可改善icv-STZ小鼠的神經(jīng)炎癥；PT109提高icv-STZ小鼠Tuj1和MAP2陽性細(xì)胞數(shù)量，增加樹突棘密度，上調(diào)海馬區(qū)PSD95蛋白表達(dá)，表明PT109可一定程度要減少STZ引起的神經(jīng)元損傷，具有神經(jīng)保護(hù)及突觸保護(hù)作用；此外，PT109可降低icv-STZ小鼠Tau蛋白磷酸化水平，并且能夠提高GSK3β的磷酸化水平。

sAD在AD患者中占比居多，開發(fā)針對性藥物意義重大。icv-STZ小鼠因具有神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、神經(jīng)退行性變等AD樣病理性指標(biāo)，常被用作為研究sAD動物模型［6，10］。因此本研究采用icv-STZ小鼠作為sAD模型動物進(jìn)行研究，給予PT109治療后，采用Morris水迷宮實驗、避暗實驗評價了PT109對icv-STZ小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。研究結(jié)果表明icv-STZ小鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶缺陷，這與已有研究一致［7］；而給予PT109治療后，icv-STZ小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙得到改善（圖2）。水迷宮實驗過程中，各組小鼠游泳速度沒有存在統(tǒng)計學(xué)差異，說明藥物不影響小鼠的運動能力。本課題組前期以APP/PS1小鼠作為fAD模型，同樣發(fā)現(xiàn)了PT109對fAD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用［9］，這些結(jié)果進(jìn)一步說明了PT109具有抗AD的潛力。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要吞噬細(xì)胞，是神經(jīng)炎癥的主要參與者。小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活會釋放大量的炎癥介質(zhì)，進(jìn)而加劇炎癥反應(yīng)［11］。而NLRP3炎癥小體是神經(jīng)系統(tǒng)中研究最廣泛的炎癥小體，主要集中在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中，活化后可誘導(dǎo)炎癥及免疫應(yīng)答，在神經(jīng)炎癥中扮演者重要角色［12］。本研究發(fā)現(xiàn)PT109能夠顯著減少icv-STZ小鼠腦內(nèi)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，同時能顯著降低NLRP3的蛋白表達(dá)水平（圖3）。這些研究結(jié)果表明PT109改善了icv-STZ小鼠的神經(jīng)炎癥。

AD發(fā)病過程中會出現(xiàn)神經(jīng)元損傷以及丟失等情況［13］。前期研究表明，STZ具有神經(jīng)毒性，可導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元減少、頂葉皮層變?。?］。為了評價PT109對icv-STZ小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元的作用，我們用免疫熒光方法檢測了icv-STZ小鼠腦中神經(jīng)元標(biāo)記蛋白Tuj1和MAP2的表達(dá)，在我們的研究中同樣發(fā)現(xiàn)icv-STZ小鼠腦中Tuj1和MAP2陽性細(xì)胞明顯減少。給藥治療后，陽性細(xì)胞明顯增加（圖4）。這提示我們PT109可減輕STZ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。

突觸是神經(jīng)元間信息傳遞的重要結(jié)構(gòu)，突觸功能異常會導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙，在AD發(fā)病過程中至關(guān)重要［14］。研究表明icv-STZ小鼠出現(xiàn)突觸可塑性損傷［15］。在本研究中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，icv-STZ小鼠腦組織中樹突棘大量減少，突觸相關(guān)蛋白PSD95顯著減少，表明STZ誘導(dǎo)了腦組織中突觸結(jié)構(gòu)的損傷；而給予PT109治療后，樹突棘的密度顯著增加，PSD95顯著增加（圖5）。這些結(jié)果提示我們PT109可以改善STZ誘導(dǎo)的突觸損傷。

圖5 PT109增加icv-STZ小鼠樹突棘密度和PSD95蛋白表達(dá)水平Fig.5 PT109 increased the number of dendritic spines and PSD95 protein levels of icv-STZ mice

Tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD的一個重要病理表現(xiàn)［16］。在AD患者腦內(nèi)，Tau蛋白處于高度磷酸化水平，最終會導(dǎo)致微管的解體。同時游離的磷酸化Tau蛋白會隨著軸索傳送到其他神經(jīng)元內(nèi)，并形成小顆粒和神經(jīng)纖維纏結(jié)，最終造成神經(jīng)元死亡和突觸功能障礙［17］。而GSK3β是調(diào)控Tau蛋白磷酸化的重要激酶。在AD中，活化的GSK3β表達(dá)增加，并能促使Tau蛋白磷酸化位點的形成［18］。另有研究表明，GSK3β還可通過調(diào)控Aβ異常聚集、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等參與AD的發(fā)病過程［19］。已有實驗表明PT109能減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠Tau蛋白的磷酸化水平，且在10μmol/L的濃度下具有較好的GSK3β活性抑制作用（61%）［9］。因此，本研究進(jìn)一步評價了PT109對icv-STZ小鼠腦組織中Tau蛋白磷酸化和GSK3β的影響。研究發(fā)現(xiàn)，PT109可提高icv-STZ小鼠腦組織中GSK3β的水平并減少Tau蛋白磷酸化（圖6）。這提示GSK3β可能參與介導(dǎo)PT109對Tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)。

圖6 PT109對icv-STZ小鼠Tau蛋白、GSK3β磷酸化水平影響Fig.6 The effects of PT109 on phosphorylation of Tau proteins and GSK 3βin icv-STZ mice

綜上所述，PT109可通過減少小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、神經(jīng)元丟失，增加樹突棘密度，減少Tau蛋白磷酸化等多途徑改善icv-STZ小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，相關(guān)作用可能與調(diào)節(jié)GSK3β信號通路有關(guān)。這與PT109在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的結(jié)果基本一致［9］，表明PT109有可能是一種潛在的預(yù)防或治療AD的多靶點先導(dǎo)化合物，但尚需進(jìn)一步驗證。