王春林 武蕓 劉秀麗 王風(fēng)琴

摘? ? 要：為探究外源H2S對(duì)西葫蘆幼苗耐鹽性的調(diào)節(jié)作用，以西葫蘆冬玉99F1為試材，通過(guò)基質(zhì)培養(yǎng)，研究了150 mmol·L-1 NaCl脅迫下施加外源H2S供體NaHS（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1）對(duì)西葫蘆幼苗活性氧代謝及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響。結(jié)果表明，鹽脅迫顯著增加了西葫蘆幼苗H2O2、超氧陰離子、MDA和Pro（脯氨酸）含量，提高了SOD、POD和CAT活性。在鹽脅迫下，外施NaHS均可顯著提高SOD和CAT活性，僅0.8 mmol·L-1 NaHS可顯著提高POD活性，且可使3種酶活性分別提高36.74%、41.84%和20.34%;可減少活性氧和MDA積累，0.8 mmol·L-1 NaHS可使H2O2、超氧陰離子和MDA含量分別降低9.27%、63.88%和52.66%，Pro含量顯著增加。綜上所述，外源H2S可通過(guò)提高活性氧清除系統(tǒng)的酶活性，減少活性氧和膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物的生成，并通過(guò)調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)來(lái)提高西葫蘆幼苗抗鹽能力，其中0.8 mmol·L-1 NaHS效果最優(yōu)。

關(guān)鍵詞：西葫蘆;硫化氫;鹽脅迫;生理特性

中圖分類號(hào)：S642.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2021）09-045-05

Effects of exogenous hydrogen sulfide on the physiological characteristics under salt tolerance of zucchini seedlings

WANG Chunlin1， WU Yun 2， LIU Xiuli 1， WANG Fengqin1

（1. College of Life Science & Technology， Longdong University， Qingyang 745000， Gansu， China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering， Longdong University， Qingyang 745000， Gansu， China）

Abstract： To explore the effects of hydrogen sulfide on zucchini seedlings under salt stress， Dongyu 99F1 planted in substrate culture was used as the experimental material， and NaHS with different concentrations （0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0 mmol·L -1） were applied. The active of oxygen metabolism and osmotic adjustment substance were investigated.The results showed that H2O2，O2-， MDA and proline content of zucchini seedlings were increased， and the activity of SOD， POD and CAT of zucchini seedlings were enhanced under salt stress. Exogenous hydrogen sulfide could increase the SOD ，CAT activity and proline content significantly under salt stress， but only 0.8 mmol·L -1 NaHS could enhance the POD activity. The SOD， POD and CAT activity were enhanced 36.74%， 41.84% and 20.34% respectively after 0.8 mmol·L -1 NaHS treatment. and the contents of H2O2， O2-， MDA were decreased 9.27%， 63.88% and 52.66% respectively compared to salt stress. This study indicated that exogenous hydrogen sulfide could increase salt resistance of zucchini seedlings because it could enhance the activity of antioxidant enzymes and membrane lipid superoxide biosynthesis. The alleviating effect for salt stress under 0.8 mmol·L -1 NaHS concentration was best.

Key words： Zucchini; Hydrogen sulfide; Salt stress; Physiological characteristics

西葫蘆（Cucurbita pepo L.）是葫蘆科、南瓜屬一年生蔓生草本植物，原產(chǎn)北美洲南部，也稱“美洲南瓜”。西葫蘆是城鄉(xiāng)人民喜食的蔬菜，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有除煩止渴、潤(rùn)肺止咳、清熱利尿、消腫散結(jié)的功效。近年來(lái)，由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中長(zhǎng)期不合理施用化肥及灌溉水質(zhì)、灌溉方式等因素的影響，目前鹽漬化程度正在進(jìn)一步加劇，鹽害成為植物遭受的主要逆境之一，已嚴(yán)重制約了西葫蘆的規(guī)?；a(chǎn)。鹽脅迫引起的滲透脅迫和離子毒害使植物細(xì)胞葉綠體和線粒體電子傳遞中電子泄露量增加，活性氧（ROS）積累，并導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷，使蛋白質(zhì)變性、核酸斷裂、光合作用下降，生長(zhǎng)受到抑制，甚至死亡[1]。因此，緩解鹽脅迫對(duì)西葫蘆生長(zhǎng)發(fā)育的影響具有重要意義。

H2S作為一種新的信號(hào)分子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用[2]，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多過(guò)程，如促進(jìn)種子萌發(fā)、調(diào)節(jié)根系發(fā)育、調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉、光合作用、果實(shí)保鮮和延緩衰老、非生物脅迫的調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[3-4]。孫曉莉等[5]研究表明，外源H2S可通過(guò)提高干旱脅迫下板栗幼苗Pro含量，SOD、POD、CAT活性，降低細(xì)胞膜受損程度以提高板栗對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性。黃菡等[6]在茶樹(shù)上的研究表明，噴施H2S能增強(qiáng)鹽脅迫下茶樹(shù)葉片SOD、POD、CAT、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）和谷胱甘肽還原酶（GR）等抗氧化酶活性及和抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）非酶抗氧化劑活性，而且提高了葉片中游離Pro和可溶性蛋白含量，顯著降低了葉片電解質(zhì)滲透率及減緩H2O2、超氧陰離子自由基和MDA的積累，從而減輕鹽脅迫引起的氧化損傷。目前，H2S對(duì)黃瓜、番薯、菠菜、番茄、小麥、水稻、苜?？鼓嫔矸矫娴难芯烤袌?bào)道[7]，而對(duì)西葫蘆抗鹽方面尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此，筆者以西葫蘆為試驗(yàn)材料，在幼苗期用外源H2S供體NaHS處理，通過(guò)測(cè)定葉片活性氧含量、抗氧化保護(hù)酶活性和氧化損害物質(zhì)積累情況，探討H2S在西葫蘆抗鹽方面的生理機(jī)制，以期為H2S提高西葫蘆的抗鹽性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

西葫蘆品種為冬玉99F1，由山西省太谷縣種苗有限公司生產(chǎn);H2S供體硫氫化鈉（NaHS），購(gòu)自Sigma公司（中國(guó)）。

1.2 方法

試驗(yàn)于2020年4—6月在隴東學(xué)院生農(nóng)科技園和生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，采取隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)。選取籽粒飽滿、大小一致的西葫蘆種子，用 0.1%高錳酸鉀浸泡10 min沖洗消毒，將浸泡后的種子用蒸餾水洗凈，將種子擺放在鋪有3層濾紙、直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，種子上層再鋪1層濾紙，鋪好濾紙后加10 mL蒸餾水，將培養(yǎng)皿置于溫度28 ℃、相對(duì)濕度60%、自然光照的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待種子露白后播種在盛有蛭石和珍珠巖（V蛭石∶V珍珠巖=3∶1）的營(yíng)養(yǎng)缽中，營(yíng)養(yǎng)缽規(guī)格5 cm×8 cm。幼苗2葉1心時(shí)，選取大小一致的植株，每缽留1株，隨機(jī)分成7組，每組30株。分別噴施0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1 NaHS溶液，分別為處理A、B、C、D、E、F，見(jiàn)表1。連續(xù)噴施3 d后，在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中加入150 mmol·L-1 NaCl溶液（試驗(yàn)預(yù)處理得知西葫蘆種子耐鹽（NaCl）的半致死濃度150 mmol·L-1）澆灌植株。采用噴施清水和添加正常1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照（CK）。處理7 d后測(cè)定各指標(biāo)，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

采用二甲酚橙法[8]測(cè)定H2O2含量，采用王學(xué)奎的方法[9]測(cè)定超氧陰離子含量，采用氮藍(lán)四唑還原法[10]測(cè)定SOD活性，采用愈創(chuàng)木酚法[10]測(cè)定POD活性，采用紫外吸收法[10]測(cè)定CAT活性，采用硫代巴比妥酸法[9]測(cè)定MDA含量，采用茚酮比色法[11]測(cè)定Pro（脯氨酸）含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行處理和作圖，采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析，用LSD法對(duì)比各處理間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaHS處理對(duì)鹽脅迫下西葫蘆葉片ROS含量的影響

由圖1可知，鹽脅迫下處理A西葫蘆幼苗葉片H2O2和超氧陰離子含量均顯著高于CK，H2O2和超氧陰離子含量比CK分別增加了10.34%和15.07%。添加外源NaHS后，西葫蘆葉片H2O2和超氧陰離子含量均顯著低于鹽脅迫下處理A，但處理B、C、D之間H2O2含量無(wú)顯著差異，處理E、F幼苗葉片H2O2含量均與CK無(wú)顯著差異，比鹽脅迫下處理A分別降低了9.27%和10.72%。處理D、E、F幼苗葉片超氧陰離子含量比鹽脅迫下處理A分別降低了54.06%、63.88%和63.97%，且均與CK無(wú)顯著差異。表明在0.2～1.0 mmol·L-1濃度范圍內(nèi)添加外源NaHS可顯著減緩鹽脅迫下H2O2和超氧陰離子的積累，減輕鹽脅迫引起的氧化損傷。

2.2 不同濃度NaHS處理對(duì)鹽脅迫下西葫蘆葉片抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，鹽脅迫下處理A西葫蘆葉片SOD、POD、CAT酶活性均顯著高于CK，分別較CK提高38.57%、36.33%和55.16%。不同濃度NaHS處理后西葫蘆幼苗葉片SOD酶活性均顯著高于鹽脅迫下處理A，且處理E和F間SOD酶活性無(wú)顯著差異。處理E葉片POD酶活性顯著高于處理A，比處理A提高了41.84%，各NaHS處理間POD酶活性無(wú)顯著差異。不同濃度NaHS處理后西葫蘆幼苗葉片CAT酶活性均較CK顯著提高。這表明添加0.2～1.0 mmol·L-1濃度的外源NaHS均可提高西葫蘆幼苗抗氧化酶活性。

2.3 不同濃度NaHS處理對(duì)鹽脅迫下西葫蘆葉片MDA含量的影響

由圖3可知，鹽脅迫下處理A西葫蘆葉片中MDA含量顯著升高，為CK的2.83倍。處理B與處理C之間MDA含量無(wú)顯著性差異，處理D、E、F之間MDA含量無(wú)顯著性差異，但不同濃度NaHS處理下西葫蘆葉片中MDA含量均顯著低于鹽脅迫下處理A，且處理D和F葉片中MDA含量降低到與CK無(wú)顯著差異，表明鹽脅迫可引起西葫蘆葉片MDA積累，外源NaHS可降低鹽脅迫下MDA含量。

2.4 不同濃度NaHS處理對(duì)鹽脅迫下西葫蘆葉片Pro含量的影響

由圖4可知，鹽脅迫的處理A西葫蘆葉片Pro含量比CK顯著提高，較CK提高37.26%。處理B西葫蘆葉片脯氨酸含量與鹽脅迫下的處理A無(wú)顯著差異，處理D、E、F西葫蘆葉片Pro含量均顯著高于其他處理，但這3個(gè)處理間Pro含量無(wú)顯著差異，表明外源NaHS處理一定程度上可促進(jìn)西葫蘆葉片Pro積累。

3 討論與結(jié)論

土壤中的鹽離子對(duì)植物生長(zhǎng)、發(fā)育和產(chǎn)量的形成有很大的影響，過(guò)高鹽含量可破壞植物的新陳代謝[12]。H2S作為一種新型氣體信號(hào)分子參與植物抵御逆境多種代謝過(guò)程。前人研究表明，H2S供體NaHS處理可顯著緩解鹽脅迫對(duì)番茄、玉米、大豆等[13-15]作物生長(zhǎng)發(fā)育的傷害。ROS（如H2O2和超氧陰離子）是植物有氧代謝的副產(chǎn)物，在植物中具有雙重效應(yīng)，即低濃度時(shí)調(diào)節(jié)植物對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力，而高濃度時(shí)則破壞植物體內(nèi)的氧化還原平衡，抑制植物正常的代謝生長(zhǎng)。MDA是膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，反映了膜的受傷害程度[16]。在正常生長(zhǎng)條件下，植物能通過(guò)自身的ROS清除機(jī)制來(lái)維持體內(nèi)ROS的平衡。然而，在逆境脅迫下，當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過(guò)植物自身的清除能力時(shí)，植物細(xì)胞中就會(huì)積累大量ROS，并且啟動(dòng)和加速了膜脂過(guò)氧化，從而破壞植物正常的生理代謝功能，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞程序化死亡[17]。逆境脅迫下，植物可通過(guò)增強(qiáng)自身抗氧化防御體系來(lái)緩解逆境引起的氧化損傷。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，雖然西葫蘆葉片內(nèi)抗氧化酶系SOD、POD和CAT活性增加，但仍不能及時(shí)清除迅速積累的ROS，造成西葫蘆植株體內(nèi)活性氧平衡遭到破壞，MDA含量升高，破壞膜結(jié)構(gòu)的完整性。而H2S供體NaHS處理后，西葫蘆葉片中SOD和CAT活性均顯著高于鹽脅迫的處理A，從而及時(shí)清除ROS的積累，減少M(fèi)DA積累，增強(qiáng)植物抗氧化防御能力，進(jìn)而緩解鹽脅迫引起的氧化損傷。黃菡等[6]在茶樹(shù)上研究也得出同樣的結(jié)論。

Pro是植物逆境條件下的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓、防止水分喪失、增強(qiáng)膜蛋白分子間水合作用具有重要的意義。在鹽脅迫下，植物體內(nèi)Pro大量積累，起到滲透調(diào)節(jié)作用，防止細(xì)胞失水。在本試驗(yàn)中，鹽脅迫下西葫蘆葉片Pro含量升高，而外源H2S供體NaHS處理的Pro含量高于鹽脅迫下的處理A，表明H2S可以通過(guò)調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)Pro含量來(lái)緩解鹽脅迫引起的滲透脅迫。

在本試驗(yàn)中，鹽脅迫下，0.2、0.4、0.6 mmol·L-1 NaHS處理之間西葫蘆葉片H2O2含量無(wú)顯著差異;0.2與0.4 mmol·L-1 NaHS處理間西葫蘆葉片MDA含量無(wú)顯著性差異，0.6、0.8、1.0 mmol·L-1 NaHS處理之間MDA含量均無(wú)顯著差異;0.8、1.0 mmol·L-1 NaHS處理間西葫蘆葉片H2O2含量、超氧陰離子含量、SOD酶活性無(wú)顯著差異;各NaHS處理間POD活性無(wú)顯著差異。NaHS濃度設(shè)置間隔較小可能是這些處理間差異不顯著的原因之一，這與何慶元等[15]研究H2S對(duì)鹽脅迫條件下大豆抗氧化酶活性的影響研究結(jié)果一致。關(guān)于NaHS對(duì)鹽脅迫下植物其他生理生化反應(yīng)的影響還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，鹽脅迫下，施加外源H2S可以通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞活性氧清除機(jī)制來(lái)提高西葫蘆幼苗活性氧清除酶SOD和CAT酶活性，有效清除過(guò)量的ROS，減少M(fèi)DA積累，降低鹽脅迫下西葫蘆幼苗膜脂過(guò)氧化程度。另外，施加外源H2S可以通過(guò)調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)Pro含量來(lái)緩解鹽脅迫引起的滲透脅迫，進(jìn)一步提高西葫蘆幼苗抗鹽能力，其中添加0.8 mmol·L-1 NaHS的效果最優(yōu)。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉友良，汪良駒.植物對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)和耐鹽性[M]//余淑文，湯章城.北京：科學(xué)出版社，1998：752-769.

[2] DENG Y Q， BAO J，YUAN F.Exogenous hydrogens ulfide alleviates salt stress in wheat seedlings by decreasing Na+ content[J].Plant Growth Regulation，2016，79：391-399.

[3] 李順， 景舉偉， 嚴(yán)金平，等.氣體信號(hào)分子H2S在植物中的研究進(jìn)展[J].植物生理學(xué)報(bào)，2015，51（5）：579-585.

[4] 徐慧芳，陳楨雨，孟丹，等.新型氣體信號(hào)分子H2S在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（15）：5-9.

[5] 孫曉莉，張?chǎng)螛s，田壽樂(lè)，等.外源硫化氫處理對(duì)板栗幼苗干旱脅迫抗性的影響[J].北方園藝，2017（15）：7-12.

[6] 黃菡， 郭莎莎，陳良超，等.外源硫化氫對(duì)鹽脅迫下茶樹(shù)抗氧化特性的影響[J].植物生理學(xué)報(bào)，2017，53（3）：497-504.

[7] 王春林，尚菲，段春燕，等.H2S在植物抵御逆境脅迫過(guò)程中的作用[J].安徽大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，43（3）：97-101.

[8] 李小方，張志良.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].5版.北京：高等教育出版社，2016.

[9] 王學(xué)奎.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].2版.北京：高等教育出版社，2006.

[10] 李玲.植物生理學(xué)模塊實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[11] 張志良.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].高等教育出版社，2002.

[12] 劉珂，張嘉欣，杜清潔，等.外源褪黑素對(duì)鹽脅迫下香椿種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響[J].中國(guó)瓜菜，2020，33（5）：53-58.

[13] 鄭州元，林海榮，崔輝梅.外源硫化氫對(duì)鹽脅迫下加工番茄幼苗光合參數(shù)及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慬J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2017，31（7）：1426-1435.

[14] SHAN C，LIU H，ZHAO L， et al.Effects of exogenous hydrogen sulfide on the redox states of ascorbate and glutathione in maize leaves under salt stress[J].Biologia Plantarum，2014，58 （1）： 169-173.

[15] 何慶元，向仕華，吳萍，等.硫化氫對(duì)鹽脅迫條件下大豆抗氧化酶活性的影響[J].大豆科學(xué)，2015，34（3）：427-431.

[16] 劉月，寇從賢，付桂萍，等.褪黑素對(duì)大豆幼苗鹽害的緩解效應(yīng)及機(jī)理研究[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2017，39（6）：813-819.

[17] 薛鑫，張芊，吳金霞.植物體內(nèi)活性氧的研究及其在植物抗逆方面的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2013，29（10）：6-11.