郭克婷+潘春香

摘要：采用超聲波處理羽扇豆（Lupinus micranthus Guss.）種子，對羽扇豆種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、活力指數(shù)、種子浸出液的相對電導(dǎo)率和幼苗的超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）含量等進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，經(jīng)過超聲波處理的羽扇豆種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率都得到了提高，以20 min的處理時間為最佳；處理后提高了羽扇豆幼苗的SOD活性和可溶性蛋白含量，降低了幼苗MDA含量和種子浸出液的相對電導(dǎo)率，提高了種子活力。說明羽扇豆種子萌發(fā)之前采用適宜的短時間超聲波處理，不僅能促進(jìn)萌發(fā)，還能促進(jìn)其抗氧化能力的提高。

關(guān)鍵詞：羽扇豆（Lupinus micranthus Guss.）；超聲波；種子活力；生理特性

中圖分類號：S681.9∶S122 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5282-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.029

Abstract：After using ultrasonic treatment on lupin （Lupinus micranthus Guss.） seed， the indices including germination potential， germination rate， vigor index， superoxide dismutase（SOD） activity， soluble protein content， and malondialdehyde（MDA） content were checked. The results showed that the germination potential， germination rate and seed vigor of lupin seeds have been improved after ultrasonic treatment. The best treatment time is 20 min. Ultrasonic treatment can enhance lupin seeds vigor， SOD activity and increase soluble protein content while reduce MDA content and seed leachate conductivity， therefore enhance the vitality of seeds. Using ultrasonic treatment on lupin seeds for a suitable short time before germination could not only promote germination but also improve their antioxidant capacity.

Key words： lupin（Lupinus micranthus Guss.）； ultrasonic wave； seed vigor； physiological characteristics

超聲波是指頻率高于20 kHz的一種彈性機(jī)械波，其生物學(xué)效應(yīng)非常復(fù)雜，既可引起生物分子或細(xì)胞損傷，也可促進(jìn)生物大分子的合成與生物體的生長。由于超聲波處理無化學(xué)殘留、安全性高、簡便有效，近年來在生物學(xué)、農(nóng)業(yè)技術(shù)方面得到了廣泛應(yīng)用。植物種子經(jīng)超聲波處理后，可以提高種子活力、促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長、增加植物的抗逆能力及產(chǎn)量[1-4]。羽扇豆（Lupinus micranthus Guss.），為豆科（Leguminosae）羽扇豆屬（Lupinus L.）多年生草本植物，多以播種繁殖，春秋播均可。羽扇豆豐富的花色及特別的植株形態(tài)是園林植物造景中較為難得的配置材料，觀賞價值很高，用作花境背景或在林緣河邊叢植、片植等，會使人們的視覺產(chǎn)生別樣的感受，因而被專業(yè)人士接納與推崇。此外，羽扇豆還具有飼用價值，莖葉可用于青飼和放牧，也可制作青貯，是豬和奶牛良好的飼料[5]，因此在農(nóng)、林、牧業(yè)里具有巨大的開發(fā)價值，也由此產(chǎn)生了強(qiáng)勁的市場需求。試驗(yàn)采用超聲波處理羽扇豆種子，研究其對種子萌發(fā)及活力的影響，旨在為羽扇豆的標(biāo)準(zhǔn)育苗及規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羽扇豆種子在韶關(guān)市當(dāng)?shù)鼗ɑ苁袌鲑徺I，試驗(yàn)時間在2014年9～11月，試驗(yàn)地點(diǎn)在韶關(guān)學(xué)院英東農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。儀器主要有KQ218超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、DDS-11A型電導(dǎo)率儀（上海光學(xué)儀器廠）；南京建成生物工程研究所提供試驗(yàn)用測試盒。

1.2 方法

1.2.1 超聲波處理 將子粒飽滿的羽扇豆種子進(jìn)行漂洗，洗干凈后裝入紗布袋中，放入超聲波清洗器內(nèi)對種子進(jìn)行超聲波處理，溫度波動控制在5 ℃之內(nèi)。試驗(yàn)共設(shè)5個處理，處理時間分別為5、10、15、20、25 min，以不經(jīng)任何處理的羽扇豆種子作為對照（CK），處理結(jié)束后浸種12 h，將各處理其中一部分種子用于發(fā)芽試驗(yàn)，進(jìn)行生長指標(biāo)的測定；另一部分用于生理指標(biāo)的測定。

1.2.2 生長指標(biāo)的測定 將超聲波處理后的種子放入種子發(fā)芽盒中，再放入培養(yǎng)箱中發(fā)芽，培養(yǎng)箱溫度為25 ℃，每處理50粒種子，重復(fù)3次。每天觀察并記載種子發(fā)芽情況，第七天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，并對幼苗重量稱重，計(jì)算發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)。

發(fā)芽率：P=G/S，

式中，G指在測定時間內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)，S為參試種子數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)=ΣGt/Dt，

式中，Gt指在不同時間（第t天）內(nèi)的發(fā)芽量，Dt指不同的發(fā)芽試驗(yàn)天數(shù)。

活力指數(shù)：活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×幼苗鮮重。

1.2.3 生理指標(biāo)測定 ①相對電導(dǎo)率測定，參照文獻(xiàn)[6]的方法，用DDS-11A型電導(dǎo)率儀測定羽扇豆種子浸出液的相對電導(dǎo)率。每處理50粒種子，重復(fù)3次。②超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白及丙二醛（MDA）含量測定，從處理后生長15 d的幼苗中，隨機(jī)選取30株完整幼苗，分成葉片和幼莖2個部分，分別進(jìn)行SOD活性、可溶性蛋白及MDA含量測定。每處理都設(shè)3次重復(fù)，準(zhǔn)確稱取0.5 g幼苗的葉片和幼莖，剪碎，加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)3 mL，于冰浴中的研缽內(nèi)研磨成勻漿，再分別用3 mL的研磨介質(zhì)沖洗2次，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，于2 000 r/min下冷凍離心15 min，上清液即為蛋白含量和酶活性測定的粗提液。利用南京建成生物工程研究所提供的測試盒，分別對羽扇豆幼苗的可溶性蛋白含量、SOD活性、MDA含量進(jìn)行測定?？扇苄缘鞍缀坑每捡R斯亮藍(lán)法測定[7]，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法（羥氨法）測定[8]，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003軟件處理，并用其制表、做圖；在SPSS 16.0軟件環(huán)境下，運(yùn)用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法（Duncan's new multiple range test，DMRT）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超聲波處理時間對羽扇豆種子萌發(fā)特性的影響

超聲波處理時間對羽扇豆種子萌發(fā)特性的影響情況見表1。從表1可見，超聲波處理時間可不同程度地影響羽扇豆種子的發(fā)芽能力，萌發(fā)特性各指標(biāo)發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼苗重均高于對照。在種子發(fā)芽勢方面，超聲處理5、10、15、20、25 min后，分別比對照提高了26.68%、10.00%、3.33%、13.33%、10.00%，以超聲處理5 min的效果最好，但各處理與對照間差異不顯著（P>0.05）；在種子發(fā)芽率方面，超聲處理5、10、15、20、25 min后，分別比對照提高了27.02%、18.93%、43.26%、32.43%、35.11%，以15 min的超聲處理效果最好，并且各處理與對照間差異顯著（P<0.05）；在幼苗重方面，超聲處理5、10、15、20、25 min后，分別比對照提高了15.97%、10.67%、26.89%、31.42%、24.69%，其中處理20 min的效果最好，除了處理10 min的與對照間差異不顯著（P>0.05）外，其他處理與對照間差異顯著（P<0.05）；在發(fā)芽指數(shù)方面，超聲處理5、10、15、20、25 min后，分別比對照提高了27.27%、14.55%、21.82%、21.82%、31.82%，其中以處理25 min的發(fā)芽指數(shù)最大，除了處理10 min的與對照間差異不顯著（P>0.05）外，其他處理與對照間差異顯著（P<0.05）；在活力指數(shù)方面，超聲處理5、10、15、20、25 min后，分別比對照提高了47.65%、26.47%、54.70%、60.00%、64.12%，但各處理與對照間差異不顯著（P>0.05）。綜合分析來看，以超聲波處理20、25 min的效果最佳，其中處理20 min后胚根較粗壯，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率分別達(dá)到45.33%和65.33%，分別比對照提高13.33%和32.43%，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別比對照高21.82%和60.00%，活力指數(shù)是反映種子活力的綜合指標(biāo)，粗壯發(fā)達(dá)的根系有利于幼苗的生長和抵御外界不良環(huán)境的影響。

2.2 不同超聲波處理時間對羽扇豆種子浸出液相對電導(dǎo)率的影響

電導(dǎo)率的大小在一定程度上反映了植物種子細(xì)胞膜的完整程度和修復(fù)能力，不同超聲波處理時間對羽扇豆種子浸出液相對電導(dǎo)率的影響情況見圖1。由圖1可以看出，通過超聲波處理羽扇豆種子5～25 min后，可降低種子浸出液的相對電導(dǎo)率，從而使種子細(xì)胞膜的透性下降，達(dá)到減少從細(xì)胞內(nèi)流出內(nèi)含物的目的，進(jìn)而為促進(jìn)種子萌發(fā)和提高種子活力提供幫助。種子浸出液的相對電導(dǎo)率大小反映了膜透性的高低，相對電導(dǎo)率高，膜透性大，溶質(zhì)外滲增多。由圖1可見，經(jīng)超聲波處理后，種子浸出液的相對電導(dǎo)率在處理5、10、15、20、25 min后，分別比對照降低了30.0%、16.7%、30.0%、25.0%、30.8%，說明適宜的超聲波處理時間具有穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、增加細(xì)胞修復(fù)能力的作用。

2.3 超聲波處理對羽扇豆生理特性的影響

2.3.1 超聲波處理對羽扇豆幼苗SOD活性的影響 SOD廣泛存在于植物細(xì)胞中，與細(xì)胞的抗氧化能力相關(guān)；不同超聲波處理時間對羽扇豆幼苗SOD活性的影響情況見表2。由表2可以看出，不同超聲波時間處理后，幼莖的SOD活性均受到激發(fā)效應(yīng)而升高，在處理5、10、15、20、25 min后，羽扇豆幼苗幼莖的SOD活性分別比對照提高了60.39%、36.11%、7.06%、38.33%、15.72%，其中處理5、10、20 min的SOD活性顯著高于對照（P<0.05）；葉片的SOD活性分別比對照提高了36.79%、42.77%、23.90%、20.75%、31.13%，其中處理5、10、25 min的SOD活性與對照差異顯著（P<0.05）。

2.3.2 超聲波處理對羽扇豆幼苗MDA含量的影響 細(xì)胞里MDA含量的多少，能在一定程度上反映膜脂過氧化作用的強(qiáng)弱和細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整程度，不同超聲波處理時間對羽扇豆幼苗MDA含量的影響情況見表2。從表2可見，不同超聲波時間處理后，羽扇豆幼莖的MDA含量變化有所不同，除了處理 5 min的MDA含量稍微高于對照外，其他的10、15、20、25 min處理的幼莖MDA含量都低于對照，分別比對照降低了14.58%、13.02%、20.31%、44.27%，其中處理25 min的幼莖MDA含量僅為0.107，顯著低于對照以及其他4個處理（P<0.05）。而葉片的MDA含量表現(xiàn)為不規(guī)律的變化，故不做分析。下一步進(jìn)行研究討論。

2.3.3 超聲波處理對羽扇豆種子可溶性蛋白含量的影響 種子的萌發(fā)離不開蛋白質(zhì)的參與，植物體內(nèi)的可溶性蛋白大多數(shù)是各類代謝酶類，所以可溶性蛋白含量的變化在一定程度上反映了植物體內(nèi)的代謝變化。不同超聲波處理時間對羽扇豆幼苗可溶性蛋白含量的影響情況見表2。從表2可見，不同超聲波時間處理后，羽扇豆幼莖和葉片中的可溶性蛋白含量都高于對照，在超聲波處理5、10、15、20、25 min后，幼莖的可溶性蛋白含量分別比對照提高了13.28%、10.96%、27.30%、32.13%、6.10%，其中15、20 min處理的種子，其幼莖可溶性蛋白含量顯著高于對照（P<0.05）。而葉片中的可溶性蛋白含量在5～15 min處理內(nèi)上升，到15 min達(dá)到最大值，其后則下降，各處理的可溶性蛋白含量與對照差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

超聲波技術(shù)是一種簡捷實(shí)用、高效環(huán)保的技術(shù)。超聲波的生物學(xué)效應(yīng)主要是由空化作用引起，低強(qiáng)度超聲波作用于種子的細(xì)胞后，能提高細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的穿透性，促進(jìn)種子的新陳代謝。張衛(wèi)華等[9]研究表明，超聲波處理抱莖獐牙菜（Swertia franchetiana H. Smith）種子20～50 min，對種子的萌發(fā)均有促進(jìn)作用，其中以超聲波處理35 min的效果較好。王劍龍等[10]研究表明，超聲波處理黃精（Polygonatum sibiricum Delar.ex Redoute）種子可以促進(jìn)種子萌發(fā)，以超聲波處理20 min的效果最明顯，處理時間在10～60 min范圍內(nèi)均有效果，在本試驗(yàn)中，超聲波處理羽扇豆種子時間在5～25 min范圍內(nèi)，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、幼苗重和活力指數(shù)均超過了對照，而以處理20～25 min的效果較好，再一次證明超聲波處理可以提高種子活力。但由于種子的大小、形態(tài)、種皮的厚薄各異，超聲波處理種子的最佳時間也就不同。

抗氧化酶系統(tǒng)可加速對自由基的清除，減輕自由基對膜的破壞，有利于膜的修復(fù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波處理提高了羽扇豆幼苗的葉片和幼莖的SOD活性，降低了MDA含量，有效減輕了活性氧對膜的傷害，保護(hù)了膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的完整性。超聲波處理后，羽扇豆種子外滲液電導(dǎo)率降低，有利于種子活力的提高。經(jīng)超聲波處理后，羽扇豆種子可以保持較高的抗氧化酶活性，減少M(fèi)DA的積累，保持細(xì)胞膜的相對完整性，提高了種子的活力。羽扇豆種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率提高的機(jī)理可能是通過提高SOD活性、修復(fù)種子吸脹過程中引起的膜損傷來實(shí)現(xiàn)的。由于超聲波是一種彈性機(jī)械波，其生物學(xué)效應(yīng)非常復(fù)雜，既可引起生物分子甚至細(xì)胞損傷，也可促進(jìn)生物大分子的合成及生物體的生長[11，12]，對種子既有有益的一面，也有有害的一面，此次超聲波處理時間試驗(yàn)對羽扇豆種子的處理是在5～25 min條件下實(shí)施的，處理時間最長為25 min，從羽扇豆種子發(fā)芽率來看，處理25 min與最佳時間15 min差異不顯著，說明超聲波處理25 min還沒有對種子造成傷害，但究竟處理多長時間才會對種子產(chǎn)生傷害，有待進(jìn)一步深入研究來證實(shí)。

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