鄭春花+孔祥遠(yuǎn)+陳冠旭+隋炯明+喬利仙+王晶珊+趙春梅

摘 要：Clp蛋白酶是一種ATP依賴的絲氨酸型蛋白酶，廣泛存在于原核和真核生物中，在生物抗逆脅迫中發(fā)揮重要作用。為分析花生中Clp基因的情況，我們構(gòu)建了花生葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過生物信息學(xué)手段鑒定出28個(gè)Clp基因，分別位于花生A組野生種的9條染色體上；聚類分析表明，花生的28個(gè)Clp基因分別聚到已報(bào)道的ClpB、C、D、X、P、R和S 7個(gè)亞類中。利用花生耐鹽突變體（S2）和對(duì)照（S4）構(gòu)建了鹽脅迫處理前后各時(shí)間段的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行Clp基因鹽脅迫表達(dá)分析，結(jié)果表明16個(gè)Clp基因在S2和（或）S4中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。該研究為花生Clp基因的功能研究與利用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生；Clp基因；RNA測(cè)序；鹽脅迫

中圖分類號(hào)：S565.203.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）12-0001-05

Abstract Clp is a kind of ATP-dependent protease widespreading in prokaryote and eukaryote， which plays an important role in resisting biotic and abiotic stresses in plants. To improve the understanding of Clp genes in peanut，28 Clp genes were screened by one transcriptome library constructed with peanut leaves. These 28 Clp genes distributed on 9 chromosomes respectively of A genome of wild peanut. Clustering analysis showed that these 28 Clp genes were assorted to ClpB， C， D， X， P，R， S groups reported previously. To analyze the response to salinity stress of 28 Clp genes，digital gene expression profiles were constructed using a mutant with higher salinity resistance （S2） and its control （S4） before and after treated with 250 mmol/L NaCl. The results showed that 16 Clp genes were responsive to salinity stress in S2 and/or S4. This study provided bases for functional researches and application of Clp genes in peanut.

Keywords Peanut （Arachis hypogaea L.）；Clp gene；RNA sequencing；Salinity stress

Clp蛋白酶是一種ATP依賴的絲氨酸型蛋白酶，屬于AAA+類ATP酶超級(jí)家族。Clp家族基因在植物中廣泛存在，有些成員在受到非生物脅迫時(shí)可被誘導(dǎo)表達(dá)。藍(lán)藻在強(qiáng)光、低溫、UV-B等外界脅迫下的生長(zhǎng)狀況與Clp蛋白酶密切相關(guān)[1]。擬南芥和玉米胞質(zhì)ClpB基因能夠恢復(fù)其突變體的耐熱性[2-4]。超表達(dá)擬南芥胞質(zhì)ClpB基因后，擬南芥生長(zhǎng)速度加快，而且能夠耐45℃的高溫脅迫[5]。反義抑制番茄的葉綠體類ClpB基因后，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高溫更為敏感，表明葉綠體類ClpB基因可能是植物耐熱過程中的重要蛋白[6]。擬南芥ClpA類似物在水分脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)，在植株衰老時(shí)表達(dá)量有所增加[7]。但Clp基因與植物耐鹽性關(guān)系的報(bào)道非常少。

花生是重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，培育高產(chǎn)耐鹽花生品種不僅可以豐富育種資源，同時(shí)對(duì)花生耐鹽的分子機(jī)理研究也具有重要作用。然而花生缺乏耐鹽種質(zhì)資源[8]，利用常規(guī)雜交方法難以選育出耐鹽品種。因此挖掘花生的耐鹽基因并進(jìn)行功能研究是花生抗逆分子育種的重要任務(wù)之一。

目前，關(guān)于花生中Clp基因的研究相對(duì)較少。紀(jì)鴻飛等[9]利用花生品種魯花14號(hào)種子不同發(fā)育時(shí)期混合cDNA文庫(kù)，篩選到1個(gè)AhClpP蛋白酶基因，但未報(bào)道該Clp基因是否受脅迫誘導(dǎo)。為了探究Clp基因在花生中是否受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，本研究從轉(zhuǎn)錄組整體水平上分析花生Clp基因的染色體定位和分類，并利用構(gòu)建好的表達(dá)譜尋找鹽脅迫響應(yīng)的Clp基因，為進(jìn)一步研究它們的功能以及利用它們改良花生抗逆性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

前期我們以平陽(yáng)霉素為誘變劑進(jìn)行了花生離體誘變，經(jīng)篩選獲得一批穩(wěn)定遺傳的突變體[10]，其中1個(gè)突變體（S2）在0.7% NaCl溶液中的發(fā)芽率可達(dá)到50%以上，而對(duì)照花育20（S4）在0.7% NaCl溶液中的發(fā)芽率只有6.7%，且S2比S4具有更高的SOD和POD值。本研究即以花生耐鹽突變體（S2）和花育20（S4）為材料。

1.2 花生葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建

用250 mmol/L NaCl處理耐鹽突變體S2和對(duì)照S4，在0、6、12、24、48 h取葉片分別提取總RNA，S2的5個(gè)樣品分別命名為S2_0、S2_6、S2_12、S2_24和S2_48；S4的5個(gè)樣品分別命名為S4_0、S4_6、S4_12、S4_24和S4_48，每個(gè)樣品包含2個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將所有樣品RNA混合后構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，送交北京諾和致源公司進(jìn)行雙向測(cè)序，組裝處理后獲得非冗余Unigene序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)（注冊(cè)號(hào)：SRR311451）。用NR、NT、SwissProt、PFAM、KOG、GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋。

1.3 鹽脅迫處理前后花生葉片表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建

對(duì)上述樣品采用Solexa技術(shù)分別進(jìn)行數(shù)字化表達(dá)譜測(cè)序，構(gòu)建花生葉片鹽脅迫處理前后的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI注冊(cè)號(hào)：SRR3210665和SRR3210666），并以上述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為參考，對(duì)整理去雜后的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)Unigene序列進(jìn)行分析。

1.4 Clp家族基因的篩選、結(jié)構(gòu)分析和染色體定位

根據(jù)上述7大數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能預(yù)測(cè)搜索Clp基因。利用SMART在線工具進(jìn)一步分析結(jié)構(gòu)域，去除無(wú)典型結(jié)構(gòu)域的基因。蛋白的分子量和理論等電點(diǎn)利用http：//www.expasy.org進(jìn)行分析。從花生全基因組數(shù)據(jù)（http：//www.peanutbase.org）下載A組野生種基因組序列，進(jìn)行基因序列比對(duì)，取相似度最高的序列作為目標(biāo)基因，并根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)和比對(duì)結(jié)果進(jìn)行外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)與基因組比對(duì)后基因位置的顯示結(jié)果，標(biāo)示每個(gè)基因在染色體上的位置，得到各個(gè)基因在染色體上的分布狀況。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過Clustal X程序?qū)ㄉ蛿M南芥Clp蛋白進(jìn)行多序列聯(lián)配分析，序列聯(lián)配結(jié)果使用MEGA4.0程序構(gòu)樹。采用鄰接法生成Clp基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.6 Clp基因的鹽脅迫響應(yīng)分析

應(yīng)用DESeq R package （1.10.1）對(duì)S2或S4樣品中某一基因在脅迫處理0、6、12、24、48 h的任意2個(gè)時(shí)間段間的表達(dá)量進(jìn)行比較，如果達(dá)到顯著上調(diào)或下調(diào)（應(yīng)用Benjamini和Hochberg的方法調(diào)整P值，調(diào)整后的P<0.05）水平，則認(rèn)為該基因?qū)}脅迫有響應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生Clp基因家族的鑒定

根據(jù)7大數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能預(yù)測(cè)結(jié)果，我們從花生葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出多個(gè)候選Clp基因，將其與公布的花生A組野生種基因組序列進(jìn)行比對(duì)，去除比對(duì)到同一位置的Clp基因，最終得到28個(gè)花生Clp基因。根據(jù)比對(duì)的基因位置顯示結(jié)果得到28個(gè)Clp基因在花生A組野生種染色體上的位置信息，這些基因分布在9條染色體上，第1號(hào)染色體分布的成員數(shù)量最多，有6個(gè)；其次為第3號(hào)、4號(hào)和8號(hào)染色體，各有4個(gè)Clp基因；而第6號(hào)染色體上不含有Clp基因；第4號(hào)染色體在63 kb范圍內(nèi)有3個(gè)緊密連鎖的Clp基因（c52883_g1、c50546_g1和c61473_g1）?；ㄉ鶦lp氨基酸殘基個(gè)數(shù)在不同成員間差別很大，長(zhǎng)度范圍為142～1 118個(gè)殘基，其等電點(diǎn)范圍從5.59到9.82，基因編碼產(chǎn)物全部定位在葉綠體或線粒體上。基因結(jié)構(gòu)分析顯示，外顯子個(gè)數(shù)從2個(gè)到15個(gè)不等（表1）。

2.2 花生Clp家族基因的聚類分析

擬南芥至少有26個(gè)Clp基因，可分為ClpB、C、D、X、P、R和S 7個(gè)亞類[11]。根據(jù)Clp蛋白家族成員長(zhǎng)度差異、含不同特征的結(jié)構(gòu)域等特點(diǎn)，對(duì)花生28個(gè)Clp蛋白與擬南芥的Clp蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，花生的28個(gè)Clp蛋白都能聚到ClpB、C、D、X、P、R和S 7個(gè)亞類中，這7個(gè)亞類分別包含6、2、1、4、5、3個(gè)和7個(gè)花生Clp蛋白。在擬南芥中ClpP亞類有6個(gè)成員，其中ClpP1由質(zhì)體編碼，其它由核基因編碼，我們?cè)诨ㄉ泻Y選到5個(gè)ClpP蛋白，分別與擬南芥的ClpP2、3、4、5、6聚到一類。

2.3 花生Clp家族基因的鹽脅迫響應(yīng)分析

我們利用鹽脅迫處理前后S2和S4的數(shù)字表達(dá)譜，對(duì)28個(gè)Clp基因在脅迫處理前后任何2個(gè)時(shí)間段間的表達(dá)量進(jìn)行比較，根據(jù)調(diào)整后的P值，確定其是否受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果列于表2和圖2?？梢钥闯觯赟2中，與脅迫處理前相比，脅迫處理6 h后，差異表達(dá)的基因最多，有2個(gè)上調(diào)，2個(gè)下調(diào)；而在S4中，與脅迫處理前相比，脅迫處理12 h后，差異表達(dá)的基因最多，有2個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，6個(gè)基因（c43789_g1、c36018_g1、c31985_g1、c29574_g1、c42812_g4、c38266_g1）在S2和S4中均受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)；2個(gè)基因（c35026_g1、c56996_g1）只在S2中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)；8個(gè)基因（c42246_g3、c42960_g1、c61473_g1、c41338_g1、c44270_g1、c49696_g1、c42812_g1、c40559_g3）只在S4中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。其中，c42246_g3、c61473_g1、c36018_g1、c42960_g3、c43789_g1這5個(gè)基因在耐鹽突變體S2和對(duì)照S4中表達(dá)模式完全一致，都為上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)-上調(diào)；而c49696_g1、c44270_g1、c42812_g1、c31985_g1、c40559_g2、c56996_g1這6個(gè)基因在S2和S4中表現(xiàn)出截然不同的表達(dá)模式。

各基因FPKM值差異很大， S2中FPKM值的變化范圍為0.33～267.41， 而S4中FPKM值的變化范圍為0.43～285.92（圖2）。與脅迫處理前相比，鹽脅迫處理48 h后，c43789_g1在S2和S4中的表達(dá)量均顯著上調(diào)，log2（fold change）分別達(dá)到3.84和5.46；鹽脅迫處理12 h時(shí)與6 h相比，c36018_g1在S2和S4中的表達(dá)量均顯著下調(diào)，log2（fold change）分別達(dá)到-2.71和-3.44，而隨著鹽脅迫處理時(shí)間的增加，該基因的表達(dá)量迅速增加，48 h與12 h相比，該基因的log2（fold change）分別達(dá)到2.58和3.85。c31985_g1 和c38266_g1這2個(gè)基因的表達(dá)量在多個(gè)時(shí)間段間的表達(dá)量差異都達(dá)到顯著水平。鹽脅迫處理6 h時(shí)，c42246_g3在S2和S4間表達(dá)量差異達(dá)到顯著水平，推測(cè)該基因可能與這兩個(gè)材料的耐鹽性差異有一定聯(lián)系（結(jié)果另文發(fā)表）。

結(jié)合聚類分析結(jié)果，上述16個(gè)受鹽脅迫誘導(dǎo)的Clp基因涉及到除ClpR亞類外的其余6個(gè)亞類，其中ClpC（2/2）和ClpD（1/1）2個(gè)亞類中的基因均受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)；其次為ClpS（5/7）和ClpB（4/6）2個(gè)亞類，絕大多數(shù)成員受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)；而ClpP（2/5）和ClpX（2/4）只有個(gè)別成員受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

植物在生長(zhǎng)過程中，不可避免地會(huì)受到各種逆境脅迫條件的影響。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中， 植物自身已經(jīng)形成了多種抵抗脅迫的機(jī)制，例如：當(dāng)植物細(xì)胞經(jīng)歷生化代謝或受到脅迫后， 會(huì)產(chǎn)生一些不可逆損傷的蛋白或多肽，這些蛋白喪失了其天然構(gòu)象或活性，而生物體內(nèi)的蛋白酶可以維持它們的穩(wěn)定、促進(jìn)其再折疊或者降解。因此，蛋白酶在調(diào)節(jié)蛋白代謝過程及清除損傷蛋白過程中起關(guān)鍵作用[12]。多數(shù)細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解作用通過依賴于能量的蛋白酶來完成，Clp蛋白酶就是其中之一。

為了分析花生中Clp家族成員的情況，我們利用構(gòu)建的花生葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩出28個(gè)Clp蛋白酶基因，它們位于花生A組野生種的9條染色體上，不同染色體上的Clp基因數(shù)目差異很大。根據(jù)已有報(bào)道，Clp蛋白可分為兩大類：ClpP蛋白家族和Hsp100/Clp分子伴侶家族。前者組成Clp蛋白酶的催化亞基，后者組成Clp蛋白酶的調(diào)節(jié)亞基（成員包括 ClpA、B、C、D、M、N、X 及Y等）[13]，ClpP通常與分子伴侶組合成為Clp復(fù)合物，共同行使蛋白酶的功能。在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與ClpP 具有相似蛋白序列的基因ClpR，但它們?nèi)狈lpP所具有的蛋白酶活性中心。此外在擬南芥中還發(fā)現(xiàn)了不屬于任何已知Clp基因家族的ClpS蛋白[14]。我們對(duì)花生的28個(gè)Clp基因進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果表明這28個(gè)Clp基因分別聚到已報(bào)道的ClpB、C、D、X、P、R和S 7個(gè)亞類中，與擬南芥的Clp基因分類結(jié)果完全一樣。

我們還利用花生耐鹽突變體（S2）和對(duì)照（S4）構(gòu)建了鹽脅迫處理前后各時(shí)間段的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因鹽脅迫表達(dá)分析，結(jié)果表明16個(gè)Clp基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，這16個(gè)基因涉及除R亞類外的其它6個(gè)亞類。ClpS和ClpB亞類中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的成員最多；同一亞家族內(nèi)的基因表達(dá)模式并不完全相同，例如ClpP和ClpX只有個(gè)別成員受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，暗示它們可能在進(jìn)化過程中發(fā)生了功能分化。該研究可為花生Clp蛋白酶基因的耐鹽功能研究與利用提供重要參考。

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