李賽男 呂怡娜 姜煥煥 黃麟淇 區(qū)炳明 劉文華

摘要：【目的】構(gòu)建表達(dá)甜菜夜蛾核多角體病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus，SeMNPV） VP39蛋白的vp39假型苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica MNPV，AcMNPV），明確SeMNPV VP39是否能取代AcMNPV VP39在AcMNPV中行使功能，為深入探究桿狀病毒的核衣殼裝配機(jī)理打下理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坷肂ac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在AcMNPV vp39缺失型重組bacmid（bAcvp39KO）的基礎(chǔ)上構(gòu)建攜帶SeMNPV vp39基因、綠色熒光蛋白基因（Enhanced green fluorescence protein，egfp）和多角體蛋白基因（Polyhedrin，polh）的重組病毒（vAcSevp39：FLAG）。利用Western blotting檢測(cè)分析SeMNPV vp39在vAcSevp39：FLAG轉(zhuǎn)染的草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）IPLB-Sf21-AE clonal isolate 9（Sf9）細(xì)胞中的表達(dá)情況，通過熒光顯微鏡觀察vAcSevp39：FLAG在Sf9中的感染和擴(kuò)散情況，采用病毒滴度測(cè)定并繪制病毒生長(zhǎng)曲線檢測(cè)vAcSevp39：FLAG的感染性芽生型病毒粒子產(chǎn)量，并以電子顯微鏡觀察vAcSevp39：FLAG轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞中的形態(tài)發(fā)生情況。【結(jié)果】Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，SeMNPV VP39能在vAcSevp39：FLAG轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞中獲得表達(dá);熒光顯微鏡觀察和病毒生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明，在vAcSevp39：FLAG轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞中無感染性的芽生型病毒粒子產(chǎn)生，與AcMNPV vp39缺失型重組病毒（vAcvp39KO）的現(xiàn)象一致;電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與vAcvp39KO不同的是，在vAcSevp39：FLAG轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中雖然未產(chǎn)生核衣殼，但在感染細(xì)胞的核中存在大量空的透明長(zhǎng)管狀衣殼結(jié)構(gòu)，表明SeMNPV VP39能挽救vAcvp39KO的衣殼結(jié)構(gòu)裝配，但在AcMNPV中不具備裝配核衣殼的能力?！窘Y(jié)論】 SeMNPV VP39在AcMNPV中雖能形成衣殼結(jié)構(gòu)，但不能有效裝配核衣殼，導(dǎo)致無芽生型病毒粒子和包埋型病毒粒子產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞： 苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒; vp39; 甜菜夜蛾核多角體病毒; 芽生型病毒粒子; 核衣殼裝配

0 引言

【研究意義】桿狀病毒是一類專一性感染節(jié)肢動(dòng)物的病原微生物，其外形呈桿狀，外具囊膜，基因組為雙鏈閉合環(huán)狀DNA（Rohrmann，2019）。在桿狀病毒的一個(gè)感染周期中會(huì)產(chǎn)生2種功能形態(tài)各異的病毒粒子：芽生型病毒粒子（Budded virion，BV）和包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virion，ODV），二者的囊膜組分和來源各不相同，但遺傳物質(zhì)和核衣殼結(jié)構(gòu)相近。迄今為止，桿狀病毒核衣殼結(jié)構(gòu)的裝配機(jī)理尚不清楚。VP39蛋白是桿狀病毒衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，開展VP39蛋白功能研究對(duì)深入探究桿狀病毒核衣殼的裝配機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】桿狀病毒科（Baculoviridae）可分為4個(gè)屬，分別是Alphabaculovirus、Betabaculovirus、Gammabaculovirus和Deltabaculovirus（Jehle et al.，2006），其中，Alphabaculovirus又可進(jìn)一步分為Group I和Group II核多角體病毒（Nucleopolyhedrovirus，NPV）（de A Zanotto et al.，1993）。Group I NPVs與Group II NPVs的核衣殼組成和結(jié)構(gòu)相似，但BV的膜融合蛋白不同，Group I NPVs以GP64為膜融合蛋白，而Group II NPVs以F蛋白為膜融合蛋白。此外，Group I NPVs中存在含gp64在內(nèi)的12個(gè)基因，在Group II NPVs中沒有同源基因（Rohrmann，2019）。桿狀病毒的核衣殼由基底結(jié)構(gòu)、圓柱形的鞘和頂冠3部分組成（Fraser，1986）。新的病毒DNA在病毒發(fā)生基質(zhì)（Virogenic stroma，VS）中合成后被壓縮包裝入衣殼形成核衣殼，衣殼裝配過程可能不依賴于病毒DNA的壓縮包裝（Fraser，1986;Wang et al.，2016）。苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica multiple NPV，AcMNPV）是桿狀病毒的代表種，也是目前研究最廣泛和最清楚的桿狀病毒（Ayres et al.，1994）。AcMNPV基因組大小約134 kb，約編碼150個(gè)開放閱讀框（Open reading frame，ORF）（Ayres et al.，1994;Harrison and Bonning，2003;Maghodia et al.，2014;Rohrmann，2019）。AcMNPV vp39（orf89）的同源基因存在于所有已測(cè)序的桿狀病毒基因組中，是桿狀病毒的核心基因。vp39的特征最早在AcMNPV（Thiem and Miller，1989）和黃杉毒蛾核多角體病毒（Orgyia pseudotsugata MNPV）（Pearson et al.，1988）中被研究。在AcMNPV中，vp39位于AcMNPV基因組75534～76577 nt之間，全長(zhǎng)1044 bp，編碼347個(gè)氨基酸殘基（Ayres et al.，1994）。已有研究表明，桿狀病毒主要衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP39以單體形式環(huán)狀排列在核蛋白核心的周圍（Pearson et al.，1988;Blissard et al.，1989;Thiem and Miller，1989;Wang et al.，2010b）。家蠶核多角體病毒（Bombyx mori NPV，BmNPV）vp39的缺失，導(dǎo)致BmNPV不能產(chǎn)生BV（Ono et al.，2012）。AcMNPV vp39的缺失導(dǎo)致核衣殼裝配受阻（Bai et al.，2019），BmNPV VP39第276位保守甘氨酸位點(diǎn)的突變導(dǎo)致病毒核衣殼不能正確裝配，病毒DNA不能正確包裝進(jìn)入衣殼（Katsuma and Kokusho，2017）。最近有研究表明，BmNPV VP39 C-末端的第192～286位氨基酸區(qū)域在核內(nèi)肌動(dòng)蛋白的聚合中具有關(guān)鍵作用（Zhang et al.，2020）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期通過利用構(gòu)建的C端融合FLAG標(biāo)簽的AcMNPV vp39全長(zhǎng)補(bǔ)回型重組病毒（vAcvp39：FLAG）和AcMNPV vp39缺失型重組病毒（vAcvp39KO），發(fā)現(xiàn)VP39為病毒核衣殼裝配的必需蛋白（Li et al.，2021），但其作用機(jī)理未明確。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Group II NPVs的甜菜夜蛾核多角體病毒（Spodoptera exigua MNPV，SeMNPV）VP39氨基酸序列與AcMNPV VP39氨基酸序列的相似性約43%，但SeMNPV VP39能否替代AcMNPV VP39在AcMNPV的生活周期中行使功能有待進(jìn)一步探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在AcMNPV vp39缺失型重組bacmid（bAcvp39KO）的基礎(chǔ)上構(gòu)建攜帶SeMNPV vp39基因、綠色熒光蛋白基因（Enhanced green fluorescence protein，egfp;本研究簡(jiǎn)寫為gfp）和多角體蛋白基因（Polyhedrin，polh）的重組病毒（vAcSevp39：FLAG），以該重組病毒為基礎(chǔ)，通過熒光顯微鏡觀察、病毒滴度測(cè)定和電子顯微鏡觀察分析SeMNPV VP39取代AcMNPV VP39對(duì)AcMNPV的感染性BV產(chǎn)量和核衣殼裝配的影響，為深入探究桿狀病毒的核衣殼裝配機(jī)理打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 質(zhì)粒、病毒和昆蟲細(xì)胞 含有SV40多聚腺苷酸化序列的質(zhì)粒pUC18-SV40及攜帶gfp和polh雙標(biāo)記的質(zhì)粒pFB1-PH-GFP為中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建（Wu et al.，2006;Cai et al.，2012）。缺失vp39基因的重組bacmid bAcvp39KO、攜帶polh和gfp雙標(biāo)記的vp39 C端融合FLAG標(biāo)簽的vp39全長(zhǎng)補(bǔ)回型重組病毒vAcvp39：FLAG及攜帶polh和gfp雙標(biāo)記的vp39基因缺失型重組病毒vAcvp39KO由肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物資源開發(fā)與利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建（Li et al.，2021）。來源于草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的IPLB-Sf21-AE clonal isolate 9（Sf9）細(xì)胞株由中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。Sf9細(xì)胞培養(yǎng)于添加有胎牛血清（10%）、青霉素（100 μg/mL）和鏈霉素（30 μg/mL）的TNM-FH培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為27 ℃。

1. 1. 2 主要試劑 克隆載體pMD18-T為TaKaRa公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶和預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker購自Thermo Scientific公司;氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)霉素、IPTG和X-gal均購自Sigma公司;DNA電泳Marker購自廣州東盛生物科技有限公司;Anti-FLAG鼠單克隆抗體購自Abmart公司;bacmid DNA堿法提取試劑（Solution I、Solution II和Solution III）、質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 vp39假型AcMNPV（vAcSevp39：FLAG）構(gòu)建參照Daimon等（2005）的方法進(jìn)行重疊PCR。以AcMNPV基因組DNA為模板，采用引物對(duì)Acvp39PF1（5'-GAGCTCCAAATTTGATTTCAATTTTATCGTG TTGGT-3'）/Acvp39PR1（5'-GAGGAGACAGGCGTC AGAGCCATATTGTTGCCGTTATAAATATGGA-3'）擴(kuò)增得到AcMNPV vp39基因的啟動(dòng)子區(qū)域（76578～76977 nt）;以SeMNPV基因組DNA為模板，采用引物對(duì)Acvp39PF2（5'-TCCATATTTATAACGGCAACAAT ATGGCTCTGACGCCTGTCTCCTC-3'）/Acvp39PR2（5'-GGTACCCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAA TCGACGACGGCCGTGGGCCGAAGC-3'）擴(kuò)增得到在C端融合有FLAG標(biāo)簽的SeMNPV vp39 ORF片段（73243～74223 nt）。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：2×PrimeSTAR Max DNA聚合酶25.0 μL，20 ng DNA模板，正、反向引物各10 pmol，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性4 min;98 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。分別回收PCR片段，以2個(gè)PCR擴(kuò)增片段的混合物為模板進(jìn)行重疊PCR。PCR反應(yīng)體系48.0 μL：2×PrimeSTAR Max DNA聚合酶25.0 μL，回收的2個(gè)PCR擴(kuò)增片段各600 ng，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至48.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性4 min;98 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，進(jìn)行4個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。在上述PCR管中加入引物Acvp39PF1和Acvp39PR2各10 pmol，重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性4 min;98 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存?；厥罩丿BPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆至pMD18-T載體，經(jīng)Sac I/Kpn I雙酶切鑒定正確后，委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司廣州分公司對(duì)插入的DNA片段進(jìn)行測(cè)序鑒定。從測(cè)序正確的質(zhì)粒上以Sac I/Kpn I雙酶切下插入的Sevp39：FLAG片段，連接至經(jīng)Sac I/Kpn I雙酶切且含有SV40多聚腺苷酸化序列的pUC18-SV40質(zhì)粒上（Cai et al.，2012），即得到重組質(zhì)粒pUC18-Sevp39：FLAG，使用Sac I/Xba I雙酶切下攜帶SV40多聚腺苷酸化序列的Sevp39：FLAG線性片段，克隆至攜帶polh啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的polh基因及AcMNPV ie1啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的gfp基因的pFB1-PH-GFP載體（Wu et al.，2006），得到轉(zhuǎn)座載體pFB1-Sevp39：FLAG。

將轉(zhuǎn)座載體pFB1-Sevp39：FLAG轉(zhuǎn)化到CaCl2法制備的含重組bacmid bAcvp39KO的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中。通過轉(zhuǎn)座子Tn7介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座（Luckow et al.，1993），將AcMNPV vp39基因啟動(dòng)子控制下的SeMNPV vp39基因及SV40多聚腺苷酸化信號(hào)序列、polh和gfp基因一起插入bAcvp39KO的polh位點(diǎn)，構(gòu)建攜帶polh和gfp雙標(biāo)記的vp39假型AcMNPV（vAcSevp39：FLAG）。分別使用引物對(duì)Acvp39PF1/Acvp39PR2、Acvp39PF1/M13R（5'-CAGGAAACAG CTATGAC-3'）、M13F（5'-GTTTTCCCAGTCACGA C-3'）/Acvp39PR2和M13F/M13R對(duì)構(gòu)建的重組病毒進(jìn)行PCR鑒定及測(cè)序驗(yàn)證。

1. 2. 2 轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞 參照Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)操作手冊(cè)和Wu等（2006）的方法，定量1 μg vAcvp-39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG bacmid DNA分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞單層（1.0×106），以添加新鮮含胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基的時(shí)間點(diǎn)記為0 h。利用熒光倒置顯微鏡（Nikon ECLIPSE TE2000-U）在轉(zhuǎn)染后（Post-transfection，p.t.）24、48、72和96 h觀察病毒的復(fù)制和擴(kuò)散情況。參照OReilly等（1992）的方法，收集0、24、48、72、96和120 h p.t.的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用半數(shù)組織培養(yǎng)物感染劑量法（50% tissue culture infective dose，TCID50）測(cè)定病毒滴度。

1. 2. 3 Western blotting檢測(cè)分析 分別定量1 μg vAcvp39KO和vAcSevp39：FLAG bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞單層（1.0×106），在96 h p.t.收集細(xì)胞，使用12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳，以anti-FLAG鼠單克隆抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)分析，以檢測(cè)病毒感染Sf9細(xì)胞中SeMNPV VP39的表達(dá)。

1. 2. 4 透射電鏡觀察 分別定量2 μg vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞單層（1.0×106），于72 h p.t.以細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞，4 ℃下2000 r/min離心10 min，收集Sf9細(xì)胞，透射電鏡樣品的制備參照Yuan等（2008）的方法。以120 kV的加速電壓在透射電子顯微鏡（JEOL JEM-1400）下對(duì)樣品進(jìn)行觀察，拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2. 1 vAcSevp39：FLAG的構(gòu)建和驗(yàn)證結(jié)果

以AcMNPV基因組DNA為模板，采用引物對(duì)Acvp39PF1/Acvp39PR1擴(kuò)增出AcMNPV vp39基因啟動(dòng)子區(qū)域;同時(shí)以SeMNPV基因組DNA為模板，采用引物對(duì)Acvp39PF2/Acvp39PR2擴(kuò)增出在C端融合有FLAG標(biāo)簽的SeMNPV vp39 ORF片段。分別回收PCR片段，以PCR片段的混合物為模板，以引物對(duì)Acvp39PF1/Acvp39PR2進(jìn)行重疊PCR，擴(kuò)增片段1405 bp（圖1，泳道1）?；厥赵撝丿BPCR的產(chǎn)物，克隆至pMD18-T載體上，經(jīng)Sac I/Kpn I雙酶切鑒定，獲得2692 bp的pMD18-T載體片段和約1405 bp的目的片段（圖1，泳道2），與預(yù)期結(jié)果一致。將測(cè)序正確的克隆子命名為T-Sevp39：FLAG。用Sac I/Kpn I從T-Sevp39：FLAG切下目的片段，連接至經(jīng)同樣酶切的pUC18-SV40質(zhì)粒上（Cai et al.，2012），得到重組質(zhì)粒pUC18-Sevp39：FLAG，用Sac I/Kpn I進(jìn)行酶切鑒定，獲得約2927 bp的pUC18-SV40載體片段和約1405 bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1，泳道3）。采用Sac I/Xba I從pUC18-Sevp39：FLAG切下目的片段，插入經(jīng)同樣酶切的pFB1-PH-GFP載體（Wu et al.，2006），得到轉(zhuǎn)座載體pFB1-Sevp39：FLAG，使用Sac I/Xba I進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得的片段與預(yù)期結(jié)果相符（載體pFB1-PH-GFP片段約7300 bp，帶有SV40多聚腺苷酸化序列的Sevp39線性片段約1652 bp），表明轉(zhuǎn)座載體pFB1-Sevp39：FLAG構(gòu)建成功（圖1，泳道4）。

重組病毒vAcSevp39：FLAG的構(gòu)建如圖2所示。以轉(zhuǎn)座載體pFB1-Sevp39：FLAG轉(zhuǎn)化bAcvp39KO感受態(tài)細(xì)胞，通過位點(diǎn)特異性重組，polh、gfp及在AcMNPV vp39啟動(dòng)子控制下且在C端融合表達(dá)FLAG標(biāo)簽（圖2中以灰色三角符號(hào)標(biāo)識(shí)）的SeMNPV vp39基因一起插入重組bacmid bAcvp39KO的polh基因位點(diǎn)，即獲得攜帶SeMNPV vp39基因的vp39假型AcMNPV（vAcSevp39：FLAG）。

對(duì)獲得的重組病毒vAcSevp39：FLAG進(jìn)行PCR驗(yàn)證，引物對(duì)Acvp39PF1/Acvp39PR2、M13F/Acvp39-PR2、Acvp39PF1/M13R和M13F/M13R在重組病毒中可分別擴(kuò)增出大小約1405、4150、3450和6000 bp的條帶，產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖3），而在bAcvp39KO中未擴(kuò)增出任何條帶（文中未顯示）。回收PCR產(chǎn)物，進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果表明重組病毒構(gòu)建成功。

2. 2 SeMNPV vp39在AcMNPV中的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

分別定量1 μg vAcvp39KO和vAcSevp39：FLAG bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，在96 h p.t.收集細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并以anti-FLAG鼠單克隆抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)分析，結(jié)果（圖4）顯示，在vAcSevp39：FLAG bacmid DNA轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞樣品中能特異性檢測(cè)到SeMNPV VP39的條帶，而在vAcvp39KO轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞樣品中未檢測(cè)出任何條帶，表明SeMNPV VP39能在vAcSevp39：FLAG轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞中表達(dá)。

2. 3 重組病毒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞的顯微鏡觀察和病毒生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

定量1 μg vAcSevp39：FLAG的bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，以AcMNPV vp39缺失型重組病毒vAcvp-39KO為陰性對(duì)照，以AcMNPV vp39補(bǔ)回型重組病毒vAcvp39：FLAG為陽性對(duì)照，利用熒光顯微鏡觀察病毒的感染和擴(kuò)散情況，結(jié)果如圖5所示。24 h p.t.，在vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG等3種重組病毒轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞中約有20%的細(xì)胞產(chǎn)生熒光，熒光分布情況也基本一致，表明三者具有基本一致的轉(zhuǎn)染效率。72 h p.t.，在vAcvp39KO和vAcSevp39：FLAG轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞中產(chǎn)生熒光的細(xì)胞數(shù)與24 h p.t.相比未見增加，而vAcvp39：FLAG轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞中幾乎所有的細(xì)胞均可觀察到綠色熒光，說明vAcSevp39：FLAG不能產(chǎn)生可感染性的BV。96 h p.t.，普通光鏡觀察結(jié)果顯示，在vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG等3種重組病毒轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞中均能產(chǎn)生包涵體（Occlusion body，OB）（圖5），表明3種重組病毒感染Sf9細(xì)胞的進(jìn)程基本一致。

為進(jìn)一步確定vAcSevp39：FLAG的感染性BV產(chǎn)生能力，分別定量1 μg vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG等3種重組病毒bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，收取轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，測(cè)定病毒滴度，繪制病毒生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖6所示。在vAcvp39KO和vAcSevp39：FLAG轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，從24 h p.t.到120 h p.t.均未檢測(cè)到感染性病毒粒子BV產(chǎn)生，而在vAcvp39：FLAG轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，從24 h p.t.開始檢測(cè)到病毒滴度，至96 h p.t.達(dá)高峰，表明其產(chǎn)生BV的能力較高。

綜合顯微鏡觀察和轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)曲線的結(jié)果，SeMNPV VP39不能替代AcMNPV VP39在AcMNPV BV產(chǎn)生中行使功能。

2. 4 重組病毒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞的透射電鏡觀察結(jié)果

為確定SeMNPV VP39替代AcMNPV VP39對(duì)病毒形態(tài)發(fā)生的影響，分別定量2 μg vAcvp39KO、vAcSevp39：FLAG和vAcvp39：FLAG bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，于72 h p.t.收集Sf9細(xì)胞，制備電鏡樣品，使用透射電子顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果如圖7所示。在vAcvp39：FLAG轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞中顯示出桿狀病毒感染的典型特征，包括含有大量正常形態(tài)核衣殼的VS在核內(nèi)形成（圖7-a），在細(xì)胞核中VS外的環(huán)帶區(qū)域可觀察到大量病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的微囊泡（文中未顯示）、大量含有核衣殼的ODV（圖7-b）和包埋有大量ODV的OB（圖7-c）。在vAcvp39KO轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞中，雖然能形成與vAcvp39：FLAG形態(tài)相似的VS，但在VS和環(huán)帶區(qū)域未觀察到任何衣殼結(jié)構(gòu)，大量不正常的電子致密小體（圖7-d中以白色箭頭標(biāo)識(shí)）出現(xiàn)在VS中（圖7-d），在環(huán)帶區(qū)域可觀察到大量的微囊泡，但無ODV出現(xiàn)在環(huán)帶區(qū)域（圖7-e）和OB中（圖7-f）。在vAcSevp39：FLAG轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞中，與vAcvp39KO現(xiàn)象類似，可觀察到無任何衣殼結(jié)構(gòu)但具有大量的電子致密小體（圖7-g中以白色箭頭標(biāo)識(shí)）的VS（圖7-g），而這些電子致密小體常存在于不能產(chǎn)生正常核衣殼的AcMNPV感染的細(xì)胞中（Olszewski and Miller，1997;Zhu et al.，2013;Guan et al.，2016）;環(huán)帶區(qū)域有大量的微囊泡，但無ODV（圖7-h），OB中無ODV包埋（圖7-i）;但與vAcvp39KO不同的是，在vAcSevp39：FLAG轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞核中可觀察到大量異常的缺乏電子致密核心即含有病毒DNA的核蛋白的電子透明的長(zhǎng)衣殼結(jié)構(gòu)（圖7-h中以白色三角形標(biāo)識(shí)）。

綜合上述觀察結(jié)果，SeMNPV VP39在AcMNPV的衣殼結(jié)構(gòu)裝配中具有功能，但不能挽救vAcvp39KO的核衣殼形成。

3 討論

VP39是桿狀病毒核衣殼最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在所有已測(cè)序的桿狀病毒基因組中保守（Pearson et al.，1988;Blissard et al.，1989;van Oers and Vlak，2007;Wang et al.，2010b）。本課題組前期通過構(gòu)建C端融合FLAG標(biāo)簽的AcMNPV vp39全長(zhǎng)補(bǔ)回型重組病毒vAcvp39：FLAG和vp39缺失型重組病毒vAcvp39KO，并證實(shí)AcMNPV vp39的缺失導(dǎo)致病毒核衣殼裝配受阻（Li et al.，2021）。本研究在bAcvp39KO的基礎(chǔ)上構(gòu)建表達(dá)C端融合FLAG標(biāo)簽的SeMNPV VP39的vp39假型AcMNPV，并利用該重組病毒探究SeMNPV VP39取代AcMNPV VP39對(duì)AcMNPV的病毒產(chǎn)生和核衣殼裝配的影響，結(jié)果表明，SeMNPV VP39取代AcMNPV VP39導(dǎo)致病毒不能產(chǎn)生可感染性的病毒粒子BV，也未能裝配產(chǎn)生核衣殼，但能產(chǎn)生大量電子透明的不含病毒DNA的長(zhǎng)管狀衣殼類似結(jié)構(gòu)，即SeMNPV VP39能挽救vAcvp39KO的衣殼裝配，但在AcMNPV中不具備裝配核衣殼的能力。

與vAcSevp39：FLAG表型相似，一些桿狀病毒核衣殼相關(guān)基因的缺失會(huì)導(dǎo)致AcMNPV的核衣殼裝配受阻及產(chǎn)生大量不正常的空的長(zhǎng)管狀衣殼類似結(jié)構(gòu)，這些基因包括vlf-1（Vanarsdall et al.， 2006）、38k（Wu et al.，2006）、ac53（Liu et al.，2008）、BV/ODV-C42（Li et al.，2010）、p6.9（Wang et al.， 2010a）、pk-1（Liang et al.，2013）、vp91（Zhu et al.， 2013）、vp1054（Guan et al.，2016）和ac102（Hepp et al.，2018）。核衣殼基底結(jié)構(gòu)蛋白P78/83是Wiskott-Aldrich蛋白家族成員（Russell et al.，1997;Goley et al.，2006），在桿狀病毒感染細(xì)胞內(nèi)絲狀肌動(dòng)蛋白（Filamentous actin，F(xiàn)-actin）的形成過程中具有重要作用，F(xiàn)-actin為核衣殼的正確組裝提供支架（Goley et al.，2006;Ohkawa et al.，2010;Rohrmann，2019）。BV/ODV-C42基因編碼的BV/ODV-C42蛋白是新合成的P78/83從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核行使功能的必需蛋白，同時(shí)，BV/ODV-C42蛋白還通過抑制P78/83的降解而使其保持性能穩(wěn)定（Wang et al.，2008;Wang et al.，2015）。近年來，有研究表明，BV/ODV-C42蛋白能與P78/83、ODV-EC27和ac102編碼的Ac102蛋白相互作用形成P78/83-BV/ODV-C42-ODV-EC27-Ac102蛋白復(fù)合物（Hepp et al.，2018）。Ac102通過與BV/ODV-C42蛋白相互作用而抑制BV/ODV-C42的泛素化，降低BV/ODV-C42的蛋白酶降解，從而保證P78/83啟動(dòng)actin聚合形成F-actin的活性（Zhang et al.，2018）。此外，p6.9基因編碼的P6.9蛋白能與桿狀病毒DNA結(jié)合，并負(fù)責(zé)桿狀病毒新合成DNA的壓縮以利于包裝進(jìn)衣殼形成核衣殼（Funk and Consigli，1993;Liu et al.，2012），38k基因編碼的蛋白38K在P6.9去磷酸化從而行使此功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Lai et al.，2018）。

核衣殼裝配是一個(gè)需要大量蛋白共同參與的復(fù)雜過程。有研究表明，VP39與其自身及核衣殼相關(guān)蛋白38K、ODV-EC27、BV/ODV-C42、P78/83和宿主細(xì)胞蛋白actin間存在相互作用（Lanier and Volkman，1998;Lu et al.，2004;Braunagel and Summers，2007;Wu et al.，2008），暗示VP39與這些蛋白通過相互作用共同參與核衣殼的裝配，且這些相互作用在核衣殼的裝配中發(fā)揮關(guān)鍵作用。蛋白發(fā)生相互作用后，其空間構(gòu)象與單個(gè)蛋白相比可能會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變（Makalliwa et al.，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，以SeMNPV VP39替代AcMNPV VP39導(dǎo)致病毒核衣殼裝配受阻，盡管在感染細(xì)胞的核中出現(xiàn)許多缺乏病毒DNA的空的長(zhǎng)管狀衣殼類似結(jié)構(gòu)，考慮到SeMNPV VP39與AcMNPV VP39的氨基酸序列相似性只有43%，相對(duì)偏低。因此，在vAcSpltvp39：FLAG感染Sf9細(xì)胞中SeMNPV VP39可能不被AcMNPV的38K、ODV-EC27、BV/ODV-C42、P78/83或其他相關(guān)蛋白充分識(shí)別而產(chǎn)生相互作用或相互作用較弱，從而可能影響這些蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。蛋白構(gòu)象的不完全轉(zhuǎn)變可能導(dǎo)致蛋白不能充分行使功能，如SeMNPV VP39與AcMNPV 38K較弱的相互作用可能引起38K構(gòu)象發(fā)生不完全轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致38K的活性降低，活性較低的38K可能不足以適當(dāng)介導(dǎo)P6.9的去磷酸化，致使在vAcSpltvp39：FLAG中無病毒DNA包裝進(jìn)入衣殼形成正常的核衣殼。這些結(jié)果也暗示vp39雖然是桿狀病毒核心基因，存在于所有桿狀病毒中，但vp39基因已進(jìn)化以適應(yīng)每種病毒與宿主的相互作用，從而有利于病毒在宿主中的復(fù)制和擴(kuò)增。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建能表達(dá)C端融合FLAG標(biāo)簽的SeMNPV VP39的vp39假型AcMNPV，且發(fā)現(xiàn)SeMNPV VP39雖然在AcMNPV的衣殼裝配中具有功能，但在AcMNPV中不具有裝配形成核衣殼的能力，導(dǎo)致vp39假型AcMNPV不能產(chǎn)生BV和ODV。本研究結(jié)果不僅為進(jìn)一步探究桿狀病毒核衣殼的裝配機(jī)制打下基礎(chǔ)，還為探究保守基因進(jìn)化以適應(yīng)每種病毒與宿主的相互作用提供了信息。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）