劉 歡,于 洋,王 哲，祝 率，付 薔，胡騰龍1,

慢性牙周炎(CP)是牙周組織的慢性進(jìn)行性炎癥,長(zhǎng)期的炎癥環(huán)境導(dǎo)致牙齒周圍支持組織的喪失,最終牙齒脫落,咀嚼功能紊亂,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。作為口腔最常見(jiàn)的疾病之一,牙周炎影響了約46%的成年人[2]，在國(guó)內(nèi)的發(fā)病率高達(dá)80%[3]。研究表明,牙周炎不僅是局部的病變,還與多種系統(tǒng)性疾病的發(fā)生有關(guān)，是心血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一[4-5]。

在牙周炎患者病變局部存在大量的細(xì)菌,中性粒細(xì)胞作為機(jī)體的第一道防線,首先到達(dá)感染部位,發(fā)揮防御作用,在感染的牙齦上皮以及齦溝液中存在大量的中性粒細(xì)胞。2004年Brinkmann等[6]首次發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞受到刺激可產(chǎn)生類似網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)——中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs),主要發(fā)揮捕獲細(xì)菌的防御功能。隨著對(duì)NETs研究的深入,發(fā)現(xiàn)NETs本身的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和其上附著的多種酶導(dǎo)致凝血紊亂,在多種疾病的血栓形成中發(fā)揮作用[7-9]。因此,本研究以牙周炎患者的中性粒細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察其釋放的NETs對(duì)重度牙周炎患者凝血指標(biāo)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年12月—2019年12月,于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科就診的20例重度牙周炎患者作為重度牙周炎組,以20例牙周健康者作為正常對(duì)照組。本研究經(jīng)過(guò)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

選取標(biāo)準(zhǔn):重度牙周炎:至少有一個(gè)牙齒鄰間部位的牙周探診深度(probing depth, PD)≥5 mm,至少有兩個(gè)不在同一牙齒的鄰間部位的臨床附著喪失(clinical attachment loss, CAL)≥6 mm。正常對(duì)照組選取標(biāo)準(zhǔn):PD≤3 mm,牙齦無(wú)炎癥，無(wú)牙槽骨吸收。所有患者至少保留18顆牙齒,并且第三磨牙和需要拔除的牙齒不計(jì)算在內(nèi)[10]。排除標(biāo)準(zhǔn):心血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤、免疫性疾病等系統(tǒng)性疾??；吸煙；懷孕或者正在哺乳期的婦女；半年內(nèi)接受過(guò)牙周治療；6個(gè)月內(nèi)有外傷或拔牙史者；3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)抗生素、類固醇或非甾體類抗炎藥。

1.2 牙周檢查

對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行牙周檢查,每顆牙都檢查6個(gè)位點(diǎn):頰側(cè)(近中、中、遠(yuǎn)中),舌側(cè)(近中、中、遠(yuǎn)中)。用Williams牙周探針,檢測(cè)牙齦指數(shù)(gingival index, GI)、PD和CAL水平。為了保證每一位患者檢測(cè)的臨床指標(biāo)的可靠性,本實(shí)驗(yàn)由一位專業(yè)的牙周科醫(yī)生對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行牙周檢查,并記錄相關(guān)指數(shù)。

1.3 血樣采集

所有參與對(duì)象上午8:00—10:00采集空腹肘靜脈血于兩管枸櫞酸鈉抗凝管中,每管5 mL。一份送至本院檢驗(yàn)科進(jìn)行凝血指標(biāo)檢測(cè),包括凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、D-二聚體(D-dimer)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)bg)；另一份用于中性粒細(xì)胞的制備和檢測(cè)外周血中的NETs標(biāo)志物髓過(guò)氧化物酶-DNA(myeloperoxidase-deoxyribonucleic acid, MPO-DNA)和胞外DNA(cell-free DNA, cf-DNA)。所有參與對(duì)象均是在牙周治療前完成血樣采集。

1.4 制備中性粒細(xì)胞

血液采集后,在30 min內(nèi),利用一步離心法獲得中性粒細(xì)胞。利用Polymorphprep中性粒細(xì)胞分離液,450×g離心40 min,提取中性粒細(xì)胞。將細(xì)胞重懸在RPMI 1640中,500×g離心5 min,最后將細(xì)胞重懸于含有3%胎牛血清的RPMI 1640中,細(xì)胞的最終密度為1×106個(gè)/mL。用臺(tái)盼藍(lán)和流式細(xì)胞儀評(píng)估中性粒細(xì)胞，生存力>99%,純度>94%[9]。

1.5 ELISA檢測(cè)

cf-DNA和MPO-DNA代表NETs的水平。用Quant-iT-PicoGreen-dsDNA檢測(cè)試劑盒(Invitrogen)檢測(cè)牙周炎患者血漿中cf-DNA的水平,根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用ELISA捕獲法測(cè)定血漿中MPO-DNA復(fù)合物的含量。

1.6 免疫熒光

將中性粒細(xì)胞(1×106個(gè)/mL)接種到賴氨酸包被的24孔板上,在含5% CO2的室溫環(huán)境下,用50 nmol/L的十四烷酸佛波醇酯(phorbol myristate acetate，PMA)刺激3 h后,用4%多聚甲醛固定中性粒細(xì)胞,2%牛血清白蛋白(BSA)封閉,加入小鼠抗人的彈性蛋白酶、髓過(guò)氧化物酶抗體(1∶100)4 ℃孵育過(guò)夜。第2天吸走一抗,PBS洗3次,加入兔抗鼠的彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)抗體和髓過(guò)氧化物酶(MPO)抗體(1∶100),室溫下敷育0.5～1.0 h,PBS洗3次,每孔加入100 μL的DAPI,通透5 min,再用PBS洗1～2次,每次5 min。摳片,防淬滅的甘油滴在載玻片上,將細(xì)胞面朝下,扣在載玻片上,用指甲油封片。在熒光顯微鏡下觀察NETs結(jié)構(gòu)[9]。通過(guò)雙盲實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)每100個(gè)細(xì)胞所釋放的NETs比例，每次結(jié)果均由兩人觀察得出，并且每項(xiàng)測(cè)試進(jìn)行3次[11]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。牙周炎組與正常對(duì)照組的GI、PD、CAL、PT、APTT、D-dimer、Fbg等指標(biāo)的組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)性分析對(duì)MPO-DNA、cf-DNA與PD、CAL、Fbg、D-dimer的相關(guān)性進(jìn)行分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

我們選取20例無(wú)系統(tǒng)性疾病的重度牙周炎患者,包括11例男性,9例女性,平均年齡為(56.73±6.81)歲。尋找年齡和性別匹配的對(duì)照組,包括11例男性,9例女性,平均年齡為(53.52±9.24)歲。性別和年齡不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行牙周檢查發(fā)現(xiàn)(表1),重度牙周炎組的GI較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)。重度牙周炎組的牙周指標(biāo)PD顯著高于對(duì)照組,兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。通過(guò)對(duì)比CAL更顯示重度牙周炎組牙槽骨吸收非常嚴(yán)重(P<0.001)。

表1 重度牙周炎與對(duì)照組牙周指標(biāo)的對(duì)比

2.2 重度牙周炎組外周血中NETs標(biāo)志物明顯升高

我們通過(guò)檢測(cè)cf-DNA和MPO-DNA間接反映NETs水平。通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定兩組外周血中的cf-DNA和MPO-DNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn),重度牙周炎組的cf-DNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，重度牙周炎組的MPO-DNA比對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，具體見(jiàn)表2。

表2 重度牙周炎與對(duì)照組外周血中NETs標(biāo)志物對(duì)比

2.3 重度牙周炎組的中性粒細(xì)胞更易釋放NETs

在免疫熒光顯微鏡下,可見(jiàn)重度牙周炎組外周血的中性粒細(xì)胞經(jīng)過(guò)刺激后釋放大量的NETs(圖1),應(yīng)用免疫熒光顯微鏡觀察中性粒細(xì)胞周圍存在大量的絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),進(jìn)一步確認(rèn)NETs結(jié)構(gòu)。對(duì)照組中只存在少量的NETs,說(shuō)明不同來(lái)源的中性粒細(xì)胞的活性存在差異,重度牙周炎患者的中性粒細(xì)胞處于明顯活躍狀態(tài)。

圖A、B是應(yīng)用50 nmol/L的PMA刺激中性粒細(xì)胞3 h后，通過(guò)染色在免疫熒光顯微鏡下觀察NETs結(jié)構(gòu)；A：對(duì)照組的中性粒細(xì)胞受到刺激后，未見(jiàn)明顯的NETs結(jié)構(gòu)；B：重度牙周炎組的中性粒細(xì)胞受到刺激后，可見(jiàn)明顯的NETs結(jié)構(gòu)(如圖中白色箭頭所指)；C：PMA刺激不同來(lái)源的中性粒細(xì)胞，然后測(cè)定NETs釋放的百分比；D：以100個(gè)中性粒細(xì)胞為單位，觀察中性粒細(xì)胞釋放NETs的比值；藍(lán)色：DNA；綠色：彈性蛋白酶；紅色：髓過(guò)氧化物酶；**：與對(duì)照組相比P<0.01；圖中標(biāo)尺=20 μm；PMA：十四烷酸佛波醇酯

2.4 重度牙周炎組的凝血指標(biāo)改變

通過(guò)檢測(cè)凝血指標(biāo)發(fā)現(xiàn)(表3),重度牙周炎組的PT與對(duì)照組相比縮短(P<0.05)；APTT在重度牙

表3 重度牙周炎組凝血異常

周炎組較對(duì)照組略有縮短,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；重度牙周炎組的Fbg水平(P<0.01)、纖維降解產(chǎn)物D-dimer水平(P<0.05)較對(duì)照組明顯升高。

2.5 凝血指標(biāo)與NETs指標(biāo)之間存在正相關(guān)關(guān)系

通過(guò)將cf-DNA和MPO-DNA與凝血指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析可見(jiàn),NETs指標(biāo)與凝血指標(biāo)之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。見(jiàn)圖2。

A、B：將對(duì)照組和重度牙周炎組的cf-DNA和D-dimer、Fbg進(jìn)行相關(guān)性分析，隨著cf-DNA水平的升高，D-dimer和Fbg水平呈明顯上升水平；C、D：將對(duì)照組和重度牙周炎組的MPO-DNA和D-dimer、Fbg進(jìn)行相關(guān)性分析，可見(jiàn)隨著MPO-DNA水平的升高，D-dimer和Fbg水平呈明顯上升水平；D-dimer：D-二聚體；Fbg：纖維蛋白原；cf-DNA：胞外DNA；MPO-DNA：髓過(guò)氧化物酶-DNA過(guò)Toll樣受體，激活血小板，促進(jìn)血小板活化，表達(dá)P-選擇素，釋放血小板活化因子-4，促進(jìn)高凝狀態(tài)的形成[18]。

3 討 論

我們的研究發(fā)現(xiàn),在重度牙周炎患者中,外周血中的NETs水平明顯升高,并且中性粒細(xì)胞處于活躍狀態(tài),受到刺激后更易于釋放NETs。此外,我們通過(guò)對(duì)凝血指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在重度牙周炎組明顯存在異常的高凝狀態(tài),并且與NETs呈正相關(guān)關(guān)系。本研究首次驗(yàn)證NETs水平與重度牙周炎患者高凝狀態(tài)的形成關(guān)系密切,這可能是其介導(dǎo)牙周炎與心血管疾病相互關(guān)聯(lián)的機(jī)制之一。

牙周炎與冠心病、心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病關(guān)系密切[12-13],但是缺乏直接的證據(jù)證實(shí)。早期研究發(fā)現(xiàn),牙周炎患者的凝血指標(biāo)異常。PAI-1、vWF的水平隨牙周炎嚴(yán)重程度的增加而增加,機(jī)體的纖溶能力下降[14],間接證實(shí)牙周炎患者處于高凝狀態(tài)。

目前認(rèn)為牙周炎與心血管疾病相關(guān)有多種機(jī)制。第一,由于細(xì)菌的長(zhǎng)期存在,刺激機(jī)體持續(xù)的免疫反應(yīng), 免疫細(xì)胞募集到病變部位, 與細(xì)菌相互作用,釋放趨化因子和促炎因子(如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等)，形成慢性炎癥環(huán)境。炎癥因子的增加,不僅加重組織損傷,還誘發(fā)全身性疾病[15-16]。第二，在免疫細(xì)胞遷移出血管的同時(shí)，會(huì)造成內(nèi)皮損傷，破壞內(nèi)皮細(xì)胞連接,增加血管的通透性，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子促進(jìn)中性粒細(xì)胞和血小板的募集，促進(jìn)血栓形成[17]。第三,牙周致病菌可以通與健康人相比，牙周炎患者的中性粒細(xì)胞由于細(xì)菌的持續(xù)刺激，數(shù)目和反應(yīng)活性均增加,并且壽命延長(zhǎng)[19]。牙周致病菌侵入循環(huán)后，刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs。NETs的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不僅可以捕獲細(xì)菌，限制細(xì)菌的擴(kuò)散,還可以捕獲各種血細(xì)胞[20]。NETs的DNA骨架上附著多種顆粒酶，如彈性蛋白酶、髓過(guò)氧化物酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、瓜氨酸化的組蛋白等，這些顆粒酶激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)凝血酶的生成[7,21]。

IL-6、IL-8可以促進(jìn)NETs的釋放,增加機(jī)體的凝血活性。通過(guò)中和炎癥因子或者抑制炎癥因子的生成,會(huì)降低NETs的產(chǎn)生[22]。當(dāng)水解NETs結(jié)構(gòu),或者抑制NETs產(chǎn)生時(shí),發(fā)現(xiàn)機(jī)體的促凝活性明顯下降[22]。說(shuō)明在慢性炎癥性疾病中NETs在激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。因此,在牙周炎患者中,隨著疾病嚴(yán)重程度的增加,炎癥因子水平升高,誘發(fā)機(jī)體活躍的中性粒細(xì)胞釋放NETs增多,促進(jìn)高凝狀態(tài)的形成[8-9]。

Moonen等通過(guò)對(duì)比牙周炎患者和健康人的中性粒細(xì)胞在受到相同刺激下釋放NETs的能力,結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)顯著的差異[23]。但是,此項(xiàng)研究的牙周炎對(duì)象選取的是中重度患者,而我們的牙周炎患者均選自重度牙周炎患者,這可能是造成差異的主要原因之一。另外，患者的個(gè)體差異以及牙周炎是否處于活動(dòng)期都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

研究顯示，通過(guò)牙周治療可以顯著改善內(nèi)皮功能障礙[24-25]，降低系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)[26]。此外,牙周治療后可以提高NETs的降解率,在牙周治療3個(gè)月后,NETs的降解率提高10%[23]。由此可見(jiàn),循環(huán)中的NETs在牙周治療前也可能是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的原因之一。

我們的研究排除了基礎(chǔ)疾病、性別和年齡對(duì)凝血系統(tǒng)的影響,但沒(méi)有細(xì)致區(qū)分牙周炎患者是處于靜止期還是活動(dòng)期，并且樣本量較少,只研究了重度牙周炎患者,未納入牙齦炎、輕度牙周炎和中度牙周炎患者,也沒(méi)有研究NETs如何促進(jìn)牙周炎高凝狀態(tài)形成的細(xì)胞分子機(jī)制。因此本研究的結(jié)論需要更大樣本量和細(xì)致的分組研究進(jìn)一步證實(shí)。

本研究通過(guò)對(duì)重度牙周炎患者和健康對(duì)照組循環(huán)中NETs水平、凝血指標(biāo)的分析,在排除其他基礎(chǔ)性疾病、性別和年齡差異的影響下,我們研究結(jié)果認(rèn)為NETs影響重度牙周炎患者的促凝活性，并促進(jìn)重度牙周炎高凝狀態(tài)的形成。通過(guò)研究NETs對(duì)牙周炎凝血系統(tǒng)的影響,為牙周炎誘發(fā)心血管疾病的發(fā)生提供新的理論機(jī)制，抑制NETs的產(chǎn)生或者水解NETs結(jié)構(gòu)可能有助于降低牙周炎誘發(fā)心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。