杜帥俠，姚秀翠，段 珂，王 靜

牙周病是一種常見(jiàn)的口腔疾病，會(huì)引起成人失牙，臨床上表現(xiàn)為牙齦出血、炎癥、牙槽骨吸收及牙齒松動(dòng)移位等，嚴(yán)重影響患者正常生活。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者展開(kāi)了基于干細(xì)胞的骨組織工程相關(guān)研究，使骨再生成為可能。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells, DPSCs)是一種間充質(zhì)干細(xì)胞，來(lái)源豐富、易于取材并且使用無(wú)倫理爭(zhēng)議，是骨組織工程的重要種子細(xì)胞[1-2]。Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-Catenin)信號(hào)通路是促進(jìn)組織損傷修復(fù)和再生的重要通路之一，在DPSCs成骨分化和牙齒生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[3-4]。Wnt/β-Catenin信號(hào)通路激活后，會(huì)抑制糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)的磷酸激酶活性，拮抗β-Catenin的降解，使其大量聚集并進(jìn)入細(xì)胞核激活下游靶基因，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[5-6]。Mao等[7]研究表明，可通過(guò)調(diào)控GSK-3β/β-Catenin信號(hào)通路，在正畸過(guò)程中促進(jìn)牙齒移動(dòng)部位骨形成，該通路可作為潛在的臨床牙科治療靶點(diǎn)。米諾環(huán)素(minocycline, MINO)是一種廣譜抗菌的四環(huán)素類抗生素，近年來(lái)研究者們發(fā)現(xiàn)它除了具有抗菌作用，還有抑制骨吸收、促進(jìn)新骨形成的作用[8]，但其作用機(jī)制尚未明確。據(jù)此，本研究擬采用不同劑量的米諾環(huán)素干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠牙髓干細(xì)胞(RDPSCs)，觀察并檢測(cè)RDPSCs成骨分化各項(xiàng)指標(biāo)以及Wnt/β-Catenin通路的變化，探討米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs成骨分化的作用及機(jī)制，以期為RDPSCs應(yīng)用于牙周病治療的臨床研究提供一定科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RDPSCs購(gòu)自上海ATCC細(xì)胞庫(kù)；米諾環(huán)素購(gòu)自默克化工技術(shù)(上海)有限公司；DMEM培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)和0.2%胰蛋白酶溶液購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色試劑盒、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot, WB)二抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；骨鈣素試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；茜素紅、蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；ALP檢測(cè)試劑盒、β-Catenin抗體、GSK-3β抗體和Runx2抗體購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

生物安全柜購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；Facscalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；垂直板電泳槽、蛋白轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將RDPSCs復(fù)蘇培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分為5組，每組6個(gè)平行對(duì)照，A組：對(duì)照組(不加米諾環(huán)素)；B組：0.1 mg/L米諾環(huán)素組；C組：1.0 mg/L米諾環(huán)素組；D組：10.0 mg/L米諾環(huán)素組；E組：100.0 mg/L米諾環(huán)素組。各組均加入成骨分化誘導(dǎo)液(每100 mL 10% FBS DMEM培養(yǎng)基中含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.2 mmol/L抗壞血酸和100 nmol/L地塞米松)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 將RDPSCs細(xì)胞以1×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后按照1.2.1中的分組進(jìn)行處理。分別在細(xì)胞培養(yǎng)1、7、14 d時(shí)，加入10 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔450 nm處OD值。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組-空白組)÷ (對(duì)照組-空白組)×100%。當(dāng)培養(yǎng)至7 d時(shí)，細(xì)胞增殖率最接近50%，選取7 d作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)。

1.2.3 測(cè)定細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣蛋白(OCN)含量 將RDPSCs細(xì)胞配制為2×105個(gè)/mL密度的單細(xì)胞懸液，2 mL/孔接種于6孔板中培養(yǎng)至貼壁，按照1.2.1中的分組進(jìn)行處理。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每3 d換液1次。棄去培養(yǎng)基后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止并4 ℃、1 500 r/min離心10 min，無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，隨后按照ALP檢測(cè)試劑盒或骨鈣素試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，于405 nm或450 nm處測(cè)OD值，計(jì)算ALP或OCN水平。

1.2.4 細(xì)胞ALP染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RDPSCs細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL的密度接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照1.2.1中的分組進(jìn)行處理，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)7 d，每3 d更換1次培養(yǎng)基。棄去培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌細(xì)胞3次，甲醛固定細(xì)胞后再次PBS洗滌，加入200 μL/孔的ALP染液，室溫避光顯色20 min，棄去染液后用PBS洗滌，晾干后于顯微鏡下觀察結(jié)果并記錄。

1.2.5 茜素紅S染色檢測(cè)細(xì)胞鈣鹽沉積量 將RDPSCs細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)至貼壁后按照1.2.1中的分組進(jìn)行處理。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)7 d，每3 d更換1次培養(yǎng)基。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，固定細(xì)胞后進(jìn)行茜素紅S染色，PBS洗滌，顯微鏡下觀察并拍照，隨后用20%醋酸溶解，檢測(cè)每孔405 nm處OD值。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)ALP和OCN mRNA表達(dá)情況 根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞中的總RNA，以其為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)ALP和OCN mRNA表達(dá)情況，引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.7 WB檢測(cè)GSK-3β、β-Catenin和Runx2蛋白表達(dá)水平 在6孔板中接種2 mL密度為2×105個(gè)/mL的RDPSCs細(xì)胞，待貼壁后按照1.2.1中的分組進(jìn)行處理。培養(yǎng)7 d后棄去培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS終止后低溫1 500 r/min離心10 min，洗滌2次后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白并根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定蛋白總濃度。后取50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束取出凝膠，使用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶室溫封閉1 h，加入稀釋(1∶1 000)的對(duì)應(yīng)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，棄去一抗溶液并洗滌PVDF膜，加入稀釋(1∶2 000)的二抗溶液，室溫?fù)u床1 h，洗膜3次，ECL顯色并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。F表示整個(gè)擬合方程的顯著性，F(xiàn)越大表示越顯著，擬合程度也就越好；P反映對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組差異大小，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RDPSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示：細(xì)胞形態(tài)以纖維狀為主，排列緊密且具有典型的旋渦狀特點(diǎn)，符合RDPSCs特點(diǎn)。

圖1 RDPSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)光鏡下觀察( ×200)

2.2 米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs細(xì)胞增殖率的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，米諾環(huán)素各組細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05)，14 d時(shí)，10.0 mg/L組相比0.1 mg/L組、100 mg/L組相均比1.0 mg/L組有所下降，如表2、圖2所示。

表2 米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs細(xì)胞增殖率的影響

*：與A組相比，P<0.05

2.3 米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs細(xì)胞ALP活性和OCN含量的影響

由結(jié)果可知，與對(duì)照組相比，0.1、1.0 mg/L米諾環(huán)素組ALP活性和OCN含量顯著升高(P<0.05)，10.0、100.0 mg/L米諾環(huán)素組ALP活性和OCN含量顯著降低(P<0.05)，如表3，圖3、4所示。

*:與A組比較，P<0.05

表3 米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs細(xì)胞ALP活性和OCN含量的影響

2.4 米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs細(xì)胞鈣鹽沉積的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，0.1、1.0 mg/L米諾環(huán)素組細(xì)胞鈣鹽沉積量明顯上升(P<0.05)，10.0、100.0 mg/L米諾環(huán)素組細(xì)胞鈣鹽沉積量明顯下降(P<0.05)，如表4，圖5、6所示。

比例尺：200 μm

*:與A組比較，P<0.05

比例尺：500 μm

表4 米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs細(xì)胞鈣鹽沉積的影響

2.5 米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs細(xì)胞ALP和OCN mRNA表達(dá)的影響

由結(jié)果可知，與對(duì)照組相比，0.1、1.0 mg/L米諾環(huán)素組ALP和OCN mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，10.0、100.0 mg/L米諾環(huán)素組ALP和OCN表達(dá)顯著降低(P<0.05)，如表5、圖7所示。

*：與A組相比，P<0.05

表5 米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs細(xì)胞ALP和OCN mRNA表達(dá)的影響

2.6 米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs細(xì)胞GSK-3β、β-Catenin和Runx2蛋白表達(dá)的影響

由結(jié)果可知，與對(duì)照組相比，0.1、1.0 mg/L米諾環(huán)素組GSK-3β蛋白表達(dá)量顯著降低，β-Catenin和Runx2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，10.0、100.0 mg/L米諾環(huán)素組GSK-3β蛋白表達(dá)量顯著升高，β-Catenin和Runx2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，如表6，圖8、9所示。

*：與A組相比，P<0.05

表6 米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs細(xì)胞GSK-3β、β-Catenin和Runx2蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

牙周病可導(dǎo)致牙槽骨的病理性吸收，造成成人失牙。DPSCs增殖活性高，具有多向分化潛力，目前關(guān)于它的組織工程應(yīng)用研究主要集中在修復(fù)受損牙本質(zhì)、成骨分化和成神經(jīng)細(xì)胞分化等方面[9-13]， 為臨床口腔疾病的治療帶來(lái)希望。米諾環(huán)素是一種半合成的四環(huán)素類藥物，研究表明它能夠有效抑制牙周致病菌繁殖，消除細(xì)菌感染，抑制破骨細(xì)胞活性并減少骨吸收，還可以促進(jìn)牙周組織再生、新骨形成[14]。

圖9 米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs細(xì)胞GSK-3β、β-Catenin和Runx2蛋白表達(dá)的影響

Tabatabaei等[15]發(fā)現(xiàn)，DPSCs可在體外被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，表達(dá)典型的成骨細(xì)胞標(biāo)志物ALP和OCN，產(chǎn)生礦化基質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素作用于成骨細(xì)胞后，可促進(jìn)細(xì)胞ALP和OCN表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、成骨分化和礦化[16]。米諾環(huán)素還可促進(jìn)損傷脊髓處骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的募集，并且促進(jìn)其體外增殖[17]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，0.1、1.0 mg/L米諾環(huán)素組牙髓干細(xì)胞的增殖率、骨形成指標(biāo)ALP和OCN含量、細(xì)胞鈣鹽沉積量均顯著升高，10.0、100.0 mg/L米諾環(huán)素組細(xì)胞增殖率較對(duì)照組顯著升高，骨形成指標(biāo)ALP和OCN含量及二者表達(dá)水平、細(xì)胞鈣鹽沉積量均顯著降低，提示低濃度的米諾環(huán)素對(duì)牙髓干細(xì)胞成骨分化起促進(jìn)作用，高濃度則起抑制作用，提示臨床用藥時(shí)應(yīng)注意把握劑量。

Wnt/β-Catenin信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)多個(gè)生物過(guò)程，當(dāng)通路未激活時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的β-Catenin、GSK-3β和軸抑制蛋白(axis inhibitor, Axin)、腺瘤樣息肉蛋白(adenoatous polyposis coli, APC)結(jié)合形成四聚體，使得GSK-3β能夠持續(xù)磷酸化β-Catenin，磷酸化的β-Catenin在蛋白酶的作用下發(fā)生降解，Wnt信號(hào)通路就此被抑制；當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活時(shí)，會(huì)產(chǎn)生傳導(dǎo)信號(hào)抑制GSK-3β、Axin和APC的活性，四聚體發(fā)生解離從而釋放β-Catenin，使得細(xì)胞質(zhì)中不斷積累β-Catenin，隨后未降解的β-Catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)Wnt信號(hào)通路下游靶基因Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(recombinant Runt related transcription factor 2, Runx2)[18-19]。Luo等[20]研究報(bào)道，激活Wnt/β-Catenin通路可抑制骨髓干細(xì)胞成脂分化，促進(jìn)其成骨分化。Jiang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的人牙周膜干細(xì)胞中加入雌激素，可激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路從而促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化。本研究結(jié)果顯示，與不加米諾環(huán)素的對(duì)照組相比，0.1、1.0 mg/L米諾環(huán)素組牙髓干細(xì)胞β-Catenin和Runx2蛋白水平顯著升高，GSK-3β蛋白水平顯著降低，而10.0、100.0 mg/L米諾環(huán)素組牙髓干細(xì)胞β-Catenin和Runx2蛋白水平顯著降低，GSK-3β蛋白水平顯著升高，表明低濃度的米諾環(huán)素可激活Wnt/β-Catenin通路，高濃度則可抑制Wnt/β-Catenin通路活化，與上述不同濃度米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs成骨分化的影響一致。

綜上所述，米諾環(huán)素可通過(guò)調(diào)控Wnt/β-Catenin信號(hào)通路影響RDPSCs成骨分化，低濃度米諾環(huán)素促進(jìn)RDPSCs成骨分化，高濃度米諾環(huán)素則抑制RDPSCs成骨分化。本研究?jī)H初步探討了米諾環(huán)素對(duì)RDPSCs成骨分化以及Wnt/β-Catenin信號(hào)通路的影響，RDPSCs的成骨分化還涉及Wnt信號(hào)通路與許多其他通路的共同協(xié)作，明確其中機(jī)制還需更深一步的研究。