夏林，余國政，唐晶

0 引言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）是全球范圍內(nèi)具有高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤。最新的中國癌癥報告顯示，CRC的發(fā)病率和死亡率分別占據(jù)第四位和第三位[1]。CRC的早期癥狀不明顯，很多CRC患者明確診斷時已是中晚期，臨床預(yù)后很差[2]。大便隱血試驗檢測CRC的敏感度很低，極易造成誤診和漏診[3]。內(nèi)鏡組織活檢結(jié)合組織病理學(xué)是診斷CRC的金標(biāo)準(zhǔn)，然而因檢查有創(chuàng)侵入性而不易被廣大患者接受[4]。尋找新型標(biāo)志物是CRC早期診斷和預(yù)后判斷的重要手段。環(huán)形RNA（circular RNA,circRNA）屬于非編碼RNA的一種，其源于基因組的外顯子和（或）內(nèi)含子，但無5’末端的帽子和3’末端poly（A）尾巴結(jié)構(gòu)，通過共價鍵形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)[5]。相比線性RNA，circRNA結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，因其對核酸酶等消化不敏感[6]。circRNA在CRC的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，并在CRC的臨床診斷中具有潛在的應(yīng)用價值[7-23]。鑒于單項單中心研究存在樣本小、結(jié)果偏倚大等諸多問題，本研究擬通過定量的Meta分析，系統(tǒng)性評價circRNA對CRC臨床診斷的綜合效能，為circRNA后期能否作為新型分子標(biāo)志物用于CRC診斷提供循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

全文依照系統(tǒng)評價和薈萃分析優(yōu)先報告的條目（PRISMA）規(guī)范（2009版）進行報告[24]。納入條件：（1）內(nèi)容關(guān)于circRNA在CRC中的診斷價值評價，研究對象為國內(nèi)外CRC患者，研究樣本例數(shù)≥20例；（2）研究中可直接或間接獲得數(shù)據(jù)用于構(gòu)建2×2四格表。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）與circRNA診斷CRC無關(guān)的文獻；（2）用于統(tǒng)計分析的數(shù)據(jù)提供不足且聯(lián)系原作者失敗；（3）質(zhì)量評分為低質(zhì)量的研究；（4）文章類型為基礎(chǔ)研究、綜述、會議摘要等。

1.2 文獻檢索

檢索數(shù)據(jù)包括PubMed、EMBASE、Wiley Online Library、Web of Science、CNKI、萬方、維普以中文或英文發(fā)表的文獻，日期截至2021年3月1日。檢索詞為：“circular RNA、circRNA、環(huán)狀RNA、結(jié)直腸癌、colorectal cancer、colorectal carcinoma、colorectal neoplasms、診斷、敏感度、特異性、曲線下面積、ROC曲線、diagnosis、sensitivity、specificity、AUC、ROC curve”，檢索時通過“and”或“or”進行組合。

1.3 數(shù)據(jù)提取和質(zhì)量評價

安排兩作者同時篩選數(shù)據(jù)信息，包括論文作者、發(fā)文時間、人群來源、樣本數(shù)量、對照樣本類型/來源、circRNA名稱、檢測方法、參照基因、cut-off值設(shè)置、靈敏度、特異度及AUC值等，對于不能直接獲得的數(shù)據(jù)通過聯(lián)系作者或軟件間接提取。參照“診斷性試驗質(zhì)量評價量表2（QUADAS-2）”工具對文獻偏倚和質(zhì)量進行評分[25]，包括病例選擇、待評價實驗、金標(biāo)準(zhǔn)、病例流程和進展情況等方面。項目評為風(fēng)險“低”時記1分，風(fēng)險評為“未知”或“高”時均記0分?？傇u分≥4分認(rèn)為文獻研究偏倚較小、質(zhì)量較高[26]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

診斷統(tǒng)計量的合并基于Stata12.0。異質(zhì)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)評估閾值效應(yīng)，Cochran’-Q、I2檢驗評估非閾值效應(yīng)，P＜0.01或I2＞50%時認(rèn)為異質(zhì)性顯著，選用隨機效應(yīng)模型合并統(tǒng)計量，否則選用固定效應(yīng)模型。設(shè)置亞組分析、敏感度檢驗和Meta回歸分析異質(zhì)性生成原因。進行Deek’s定量漏斗圖檢驗，評估研究間發(fā)表偏倚，P＜0.1提示出現(xiàn)發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1 文獻篩選結(jié)果

圖1所示，在線數(shù)據(jù)庫檢索共獲得513篇相關(guān)論文（剔除重復(fù)）。認(rèn)真閱讀文獻標(biāo)題和摘要后，排除435篇無關(guān)文獻，最后全文閱讀剩余78篇文獻，進一步排除61篇，最終有17項研究納入統(tǒng)計分析[7-23]。

圖1 相關(guān)研究的納入和排除過程Figure 1 Inclusion and exclusion process of relevant studies

2.2 資料特點和研究質(zhì)量

獲得的17項研究共含1873例CRC患者和1573例匹配非癌對照。所有CRC患者均經(jīng)病理組織細胞學(xué)確診，檢測樣本類型包括組織、血漿、血清和外泌體，均于治療前手術(shù)前獲得。納入研究人群包括亞洲人和歐洲人。納入的circRNA有29種，分別為circCCDC66、hsa_circ_0001649、hsa_circ_0000711、circVAPA、hsa_circ_001988、hsa_circ_0000567、hsa_circ_0014717、hsa_circRNA_104700、hsa_circRNA_103809、circRNA0003906、hsa_circ_0004771、hsa_circ_0082182、hsa_circ_0000370、hsa_circ_0035445、has_circ_0004585、hsa_circ_0002568、hsa_circ_0002566、hsa_circ_0002567、hsa_circ_0074033、hsa_circ_0074039、hsa_circ_0007534、hsa_circ_0002320、circ-FMN2、circ-LMNB1、circ-ZNF609、hsa_circ_0026416、hsa_circ_0001900、hsa_circ_0001178和hsa_circ_0005927，其中19種circRNA在CRC組織中表達上調(diào)，10種表達下調(diào)。circRNA的表達檢測均通過RT-qPCR，內(nèi)參基因包括GAPDH，U6和18S rRNA，見表1。

表1 納入研究的資料特征Table 1 Data characteristics of all included studies

按照QUADAS Ⅱ的7項條目嚴(yán)格評估納入文獻的質(zhì)量[17]。表2所示所有納入研究的累計得分均高于4分，提示納入的文獻整體研究質(zhì)量較高。

表2 QUADAS-2量表進行質(zhì)量評價Table 2 Research quality assessed by QUADAS-2 checklist

2.3 異質(zhì)性分析

異質(zhì)性分析結(jié)果顯示，Spearman相關(guān)系數(shù)的P=0.646，提示研究間不存在閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性，同時Cochran’-Q檢驗P=0.000，I2=71.9%，提示研究間存在中等程度異質(zhì)性，主要來自非閾值效應(yīng)，故選取隨機效應(yīng)模型進行診斷指標(biāo)的合并。

2.4 診斷Meta分析

CRC 患者中異常表達的circ RNA 合并的AUC=0.81，見圖2，對應(yīng)的敏感度、特異性、陽性似然比（PLR）、陰性似然比（NLR）和診斷優(yōu)勢比（DOR）分別為0.79（95%CI:0.76～0.81）、0.69（95%CI:0.64～0.73）、2.52（95%CI:2.20～2.89）、0.31（95%CI:0.26～0.36）和8.02（95%CI:6.21～10.36），提示異常表達的circRNA表達譜在CRC診斷中具有較高的價值。

圖2 circRNA異常表達譜診斷CRC的SROC曲線Figure 2 SROC curve of abnormal circRNA expression profile in diagnosing CRC

2.5 亞組分析

亞組分析結(jié)果顯示，血清來源的circRNA分析檢測（AUC=0.89,DOR=16.79）診斷CRC效能高于血漿（AUC=0.79,DOR=7.08）和組織（AUC=0.76,DOR=6.87），提示血清可作為circRNA分析檢測的最好基質(zhì)。據(jù)circRNA的表達情況分析顯示，致癌性的circRNA表達譜診斷CRC效能高于抑癌性的circRNA（AUC:0.83vs.0.77;DOR:9.50vs.6.48）?；趨⒖蓟騁APDH的circRNA分析與整體診斷效能相當(dāng)?；贕APDH為內(nèi)參的circRNA診斷CRC效能與整體效應(yīng)相當(dāng)（AUC:0.80vs.0.81,DOR:8.29vs.8.00），見表3。

表3 circRNA用于結(jié)直腸癌診斷的亞組分析Table 3 Subgroup analysis of circRNAs in diagnosis of CRC

2.6 敏感度分析和Meta回歸分析

敏感度分析顯示，納入研究[16]的一項數(shù)據(jù)偏離上限，提示為離群數(shù)據(jù)，見圖3，故將該數(shù)據(jù)重新剔除后進行Meta分析：對應(yīng)合并的敏感度、特異性、PLR、NLR、DOR和AUC分別為0.79（95%CI:0.77～0.81）、0.69（95%CI:0.64～0.73）、2.52（95%CI:2.19～2.91）、0.31（95%CI:0.27～0.35）、8.29（95%CI:6.45～10.65）和0.81，對應(yīng)I2由71.9%降至71.2%，說明納入的離群數(shù)據(jù)是對合并整體效應(yīng)的結(jié)果及異質(zhì)性的影響均不大。

圖3 敏感度分析檢測研究的同質(zhì)性Figure 3 Sensitivity analysis of homogeneity among studies

Meta回歸分析基于病例數(shù)、對照組例數(shù)、樣本類型、circRNA表達狀態(tài)，文獻質(zhì)量評分等變量進一步分析異質(zhì)性來源。結(jié)果顯示，上述變量均不是引起研究異質(zhì)性產(chǎn)生的因素（均P＞0.05），見表4。

表4 circRNA表達用于結(jié)直腸癌診斷的Meta回歸分析Table 4 Meta-regression analysis of circRNA in diagnosis of CRC

2.7 發(fā)表偏倚

研究間的發(fā)表偏倚經(jīng)Deek’s定量漏斗圖檢測診斷性，結(jié)果顯示，該檢驗得到P=0.310，提示研究間不存在發(fā)表偏倚，見圖4。

圖4 Deek’s定量漏斗圖顯示研究的發(fā)表偏倚Figure 4 Publication bias assessed by Deek's quantitative funnel plot

3 討論

2015年中國癌癥統(tǒng)計顯示，CRC的發(fā)病率和死亡率分別占據(jù)第四位和第三位，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。不斷開發(fā)CRC早期診斷的生物標(biāo)志物迫在眉睫。近年研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)形RNA（circRNA）的異常表達與CRC的臨床分期、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)[7-23]，提示可作為CRC診斷的重要指標(biāo)。本研究通過定量Meta分析系統(tǒng)性評價了異常表達的circRNA分子對CRC的綜合診斷效能。

目前研究已報道，異常的circRNA分子表達譜在肝癌[27]、肺癌[28]中均具有很高的診斷應(yīng)用價值。Huang等[27]的Meta分析結(jié)果顯示，異常的circRNA分子表達譜用于區(qū)分肝細胞癌和非癌對照的合并AUC為0.81，對應(yīng)合并敏感度為0.82，合并特異性為0.72。本研究合并效應(yīng)量分析顯示，異常表達的circRNA用于診斷CRC和非癌對照的合并敏感度為0.79，特異性為0.69，AUC為0.81，說明異常circRNA的表達異?？勺鳛镃RC較好的診斷分子指標(biāo)。另一方面，診斷的優(yōu)勢比（DOR）可用于反映診斷試驗的結(jié)果與疾病的關(guān)聯(lián)程度，當(dāng)DOR＞1時，其值越大說明該診斷試驗的判別準(zhǔn)確度越高[29]。本研究中circRNA合并DOR為8.02，說明整體的判別準(zhǔn)確度很高。另外，我們發(fā)現(xiàn)陽性似然比（PLR）為2.52，說明CRC患者中circRNA檢測陽性結(jié)果的概率約為非癌對照檢測陽性概率的2.3倍；陰性似然比（NLR）為0.31提示，在陰性結(jié)果中，circRNA檢測存在約31%的假陰性率。本研究進一步基于circRNA的功能（表達形式）及參考基因類型等進行亞組分析，發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)的circRNA對CRC的綜合診斷效能優(yōu)于下調(diào)的circRNA，血漿來源的circRNA檢測診斷CRC價值高于組織來源，但基于GAPDH為內(nèi)參的circRNA檢測診斷CRC效能與整體效應(yīng)相當(dāng)。盡管如此，因亞組分析的納入樣本量少，故以上發(fā)現(xiàn)有待于進一步證實。

異質(zhì)性的產(chǎn)生是Meta分析過程中不可避免的一個問題[30]。異質(zhì)性的產(chǎn)生主要源自閾值和非閾值效應(yīng)：閾值效應(yīng)即診斷實驗閾值選擇的不同而引起，而患者病情的嚴(yán)重程度、疾病不同病理組織學(xué)類型、不同的試劑來源、檢測溫度、操作人員不同等為非閾值因素[31]。由于診斷試驗的獨立性，加上非閾值因素諸多差異，異質(zhì)性便由此產(chǎn)生[26]。本研究合并的統(tǒng)計量存在較大的異質(zhì)性，考慮可能與納入研究的不同cut-off值設(shè)定、納入研究人群的不同狀態(tài)、circRNA的不同分子類型及表達水平等相關(guān)。因此，本研究通過敏感度分析和單因素回歸分析深入探討異質(zhì)性來源。敏感度分析提示研究間存在離群數(shù)據(jù)，故將該數(shù)據(jù)重新剔除后再次進行Meta分析，顯示I2由71.9%降至71.2%，說明納入的離群數(shù)據(jù)對整體合并結(jié)果及異質(zhì)性影響不大。盡管如此，回歸分析提示樣本例數(shù)、樣本類型、circRNA表達狀態(tài)，文獻質(zhì)量評分等均不是引起研究間異質(zhì)性的因素。

本研究存在不足之處如下：（1）可能存在一定的人群偏倚：納入的研究主要來自亞洲人群（中國和中國臺灣）；（2）circRNA表達譜涵蓋不全面；（3）納入的部分研究數(shù)據(jù)為通過計算間接提取，存在一定誤差；（4）獲得的樣本類型大部分為組織，缺乏與血清、血漿樣本的對比。因此，本研究結(jié)論仍需后期更大樣本的臨床研究加以證實。

綜上，本研究系統(tǒng)性評價了異常表達的circRNA在CRC診斷中的臨床應(yīng)用價值，認(rèn)為合并的circRNA異常表達譜可作為CRC診斷的較好輔助指標(biāo)應(yīng)用于臨床。