吳朝陽(yáng)，王生淋*，沈榮凱，陳飛，林建華，朱夏，張真真

0 引言

骨肉瘤（Osteosarcoma）是臨床最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，其中普通型骨肉瘤占所有骨肉瘤的80%以上[1]?；熃Y(jié)合手術(shù)治療是目前普通型骨肉瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療模式，患者的5年生存率從不足20%提高到60%～70%，但復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年生存率仍較差，化療耐藥是影響骨肉瘤預(yù)后的關(guān)鍵因素[2]。因此，預(yù)測(cè)骨肉瘤患者化療效果和預(yù)后有助于臨床采用更積極有效的治療方案，從而提高生存率。本研究通過(guò)回顧性分析，探究化療前骨肉瘤軟組織腫塊內(nèi)成骨與臨床病理特征的相關(guān)性，為骨肉瘤患者最佳治療方案選擇提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2000年5月—2015年5月期間于本院手術(shù)治療的258例骨肉瘤患者臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡小于40歲，發(fā)病部位在長(zhǎng)骨，有明顯軟組織腫塊，病理學(xué)診斷（術(shù)前穿刺活檢和術(shù)后病理均證實(shí)）為骨肉瘤，接受了規(guī)范化療（阿霉素、順鉑、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺）和手術(shù)，定期隨訪并有完整臨床資料。臨床資料包括腫瘤Enneking分期、局部X線、HE染色和免疫組織化學(xué)染色、化療后腫瘤壞死率、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況、總生存時(shí)間和轉(zhuǎn)移后生存時(shí)間。由于不規(guī)則骨病變解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、預(yù)后較差，且其X線無(wú)法顯示清楚軟組織成骨情況，所以本研究排除了不規(guī)則骨來(lái)源的病例。

1.2 評(píng)估方法

1.2.1 影像學(xué)評(píng)估 在標(biāo)準(zhǔn)X線片上，由兩位影像科醫(yī)師獨(dú)立對(duì)軟組織腫塊進(jìn)行腫瘤性成骨評(píng)估，僅少量鈣化（面積≤5%）的為無(wú)成骨型，部分鈣化（5%＜面積≤50%）的為部分成骨型，軟組織內(nèi)明顯鈣化（面積＞50%）的為成骨型。

1.2.2 病理學(xué)評(píng)估（1）穿刺組織成骨程度分級(jí)：化療前軟組織穿刺活檢標(biāo)本通過(guò)HE染色觀察其中骨組織形態(tài)，并用尼康數(shù)碼顯微鏡攝像頭拍攝圖像，結(jié)合圖像分析軟件計(jì)算骨樣組織在每個(gè)視野（100×）的面積（面積=長(zhǎng)×寬/106mm2），見圖1A。腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物SATB2免疫組織化學(xué)染色后，尋找成骨區(qū)域骨肉瘤細(xì)胞最密集的地方，拍照計(jì)數(shù)高倍視野（400×）腫瘤細(xì)胞數(shù)量，每張切片取3個(gè)典型區(qū)域拍照計(jì)數(shù)后求平均值，見圖1B，以SATB2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/骨樣組織面積作為最終數(shù)值，應(yīng)用x-Tile軟件確定骨肉瘤軟組織病變成骨程度最佳截?cái)嘀担╟utoff value），將成骨程度分為Ⅰ級(jí)（≥100)、Ⅱ級(jí)（30～100）和Ⅲ級(jí)（0～30）。以上評(píng)估由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立完成。（2）腫瘤壞死率：按照HUVOS標(biāo)準(zhǔn)[3]對(duì)接受新輔助化療的樣本進(jìn)行腫瘤壞死率評(píng)估。基于化療前MRI結(jié)果對(duì)術(shù)中切除腫瘤最大切面取材，計(jì)算每個(gè)切片殘存腫瘤細(xì)胞百分比，最后以平均值作為每個(gè)樣本的最終結(jié)果，使用X-tile軟件依據(jù)腫瘤細(xì)胞總體生存情況對(duì)腫瘤化療反應(yīng)敏感度進(jìn)行分組（敏感組：殘存腫瘤細(xì)胞≤10%；不敏感組：殘存腫瘤細(xì)胞＞10%）。以上評(píng)估由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立完成。

圖1 骨肉瘤軟組織成骨程度分級(jí)Figure 1 Ossification grade in soft tissue lump of osteosarcoma

1.3 臨床治療方案

穿刺活檢組織病理確診后進(jìn)行臨床分期并接受新輔助化療，方案為：阿霉素75 mg/m2、順鉑100 mg/m2，間隔異環(huán)磷酰胺10 g/m2，每三周一個(gè)化療周期。兩個(gè)周期后進(jìn)行手術(shù)治療，根據(jù)影像學(xué)設(shè)計(jì)的外科邊界選擇保肢或截肢。術(shù)后評(píng)估腫瘤壞死率，殘存腫瘤細(xì)胞≤10%時(shí)，繼續(xù)原方案進(jìn)行術(shù)后輔助化療四個(gè)周期，殘存腫瘤細(xì)胞＞10%時(shí)，加用大劑量甲氨蝶呤10 g/m2。

1.4 隨訪

住院化療期間，每6周行肺部CT和局部X線片檢查。輔助化療結(jié)束后，前兩年每3月隨訪1次，第3～5年每6月隨訪1次，第6年起每年隨訪1次。隨訪時(shí)間截至2020年6月30日。如發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，記錄腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移時(shí)間。如患者死亡，記錄患者死亡時(shí)間和原因。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。影像學(xué)成骨情況與病理學(xué)成骨分級(jí)的相關(guān)性采用Kendall’s tau-b相關(guān)分析。用Kaplan-Meier曲線及Log rank檢驗(yàn)進(jìn)行預(yù)后單因素分析并比較組間差異顯著性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤患者臨床資料

本研究共納入258例患者，符合入組條件的為189例?；颊呋九R床資料見表1。

表1 189例骨肉瘤患者臨床病理特征Table 1 Characteristics of 189 osteosarcoma patients

2.2 影像學(xué)成骨情況與病理形態(tài)學(xué)成骨分級(jí)的相關(guān)性

X線顯示無(wú)成骨型43例，部分成骨型114例，成骨型32例，相對(duì)應(yīng)的病理形態(tài)學(xué)分級(jí)為Ⅰ級(jí)41例，Ⅱ級(jí)116例，Ⅲ級(jí)32例，有2例X線表現(xiàn)為無(wú)成骨型的患者病理形態(tài)學(xué)為Ⅱ級(jí)。Kendall’s tau-b相關(guān)分析結(jié)果表明，影像學(xué)軟組織成骨情況與病理學(xué)成骨分級(jí)高度一致（相關(guān)系數(shù)=0.98,P＜0.001），見圖2。

圖2 骨肉瘤軟組織內(nèi)影像學(xué)成骨與病理學(xué)成骨分級(jí)的相關(guān)性Figure 2 Correlation between imaging osteogenesis and pathological osteogenesis grade in soft tissue lump of osteosarcoma

2.3 成骨情況與腫瘤Enneking分期的相關(guān)性

ⅢB期患者中無(wú)成骨型占30.2%（13/43），部分成骨型占9.6%（11/114），成骨型6.3%（2/32），三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），見表2。進(jìn)一步分析顯示無(wú)成骨型患者ⅢB期占比顯著高于部分成骨型（P=0.001）和成骨型（P=0.010）患者。以上結(jié)果表明，無(wú)成骨型骨肉瘤更具有轉(zhuǎn)移潛能。

表2 骨肉瘤軟組織骨化程度與患者臨床特征相關(guān)性Table 2 Association of ossification degree in soft tissue lump with clinicopathological characteristics of osteosarcoma patients

2.4 成骨情況與化療敏感度的相關(guān)性

無(wú)成骨型與部分成骨型患者化療敏感率分別為60.5%（26/43）和59.6%（68/114），成骨型的化療敏感者比例為31.3%（10/32），三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012），見表2。進(jìn)一步分析顯示成骨型患者化療敏感度明顯低于無(wú)成骨型（P=0.012）或部分成骨型（P=0.004），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 成骨情況與患者預(yù)后的相關(guān)性

單因素分析結(jié)果顯示，與無(wú)成骨型組相比，部分成骨型（P=0.009）及成骨型（P=0.001）骨肉瘤患者的總生存期均較長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。部分成骨型與成骨型骨肉瘤患者總生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.080）。除此之外，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后，成骨型骨肉瘤患者帶瘤生存期長(zhǎng)于無(wú)成骨型骨肉瘤患者，雖然差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.078）。而部分成骨型與無(wú)成骨型（P=0.662）或成骨型（P=0.109）組發(fā)生轉(zhuǎn)移后的生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖3 骨肉瘤不同成骨分型患者總生存期(A)及轉(zhuǎn)移后生存期(B)差異分析Figure 3 Overall survival(A) and post-metastatic survival(B) of osteosarcoma patients with different osteoblastic types

3 討論

腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和化療耐藥是影響骨肉瘤患者療效的主要原因[4]。無(wú)效化療不僅使患者承受不良反應(yīng)，還有可能延誤手術(shù)時(shí)機(jī)，使保肢困難甚至形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此化療效果的預(yù)測(cè)具有重要意義。馬煥等通過(guò)觀察化療前后動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI定量參數(shù)變化評(píng)估骨肉瘤新輔助化療療效，結(jié)果表明，化療反應(yīng)良好者動(dòng)態(tài)增強(qiáng)磁共振定量參數(shù)在化療前、后存在較明顯的變化[5]；陳海妹等發(fā)現(xiàn)基于T1WI影像組學(xué)列線圖是骨肉瘤患者1年內(nèi)復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，在治療前即可預(yù)測(cè)骨肉瘤術(shù)后1年內(nèi)的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[6]。本研究通過(guò)回顧性分析189例骨肉瘤患者化療前局部X線，將骨肉瘤分成無(wú)成骨型、部分成骨型和成骨型。無(wú)成骨型或部分成骨型骨肉瘤化療敏感度高于成骨型患者。盡管化療敏感度較高，無(wú)成骨型骨肉瘤患者總生存期仍短于部分成骨型和成骨型患者，提示化療前骨肉瘤軟組織腫瘤性成骨情況對(duì)患者化療敏感度和預(yù)后判斷有重要意義。

骨肉瘤的特征性表現(xiàn)是惡性梭形腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生骨樣基質(zhì)。骨樣基質(zhì)的量和成熟程度在影像學(xué)上表現(xiàn)為不同程度的成骨，但是骨肉瘤的骨膜反應(yīng)性成骨或骨質(zhì)被腫瘤破壞后，機(jī)體啟動(dòng)的修復(fù)性成骨在影像學(xué)上與腫瘤性成骨難以區(qū)分。因此，本研究選擇軟組織腫塊作為研究對(duì)象，避開骨膜成骨和反應(yīng)性成骨的干擾，其可直接代表腫瘤性成骨情況。超微結(jié)構(gòu)分析顯示，細(xì)胞外骨樣基質(zhì)的數(shù)量與腫瘤細(xì)胞分化程度有關(guān)，骨樣基質(zhì)越成熟，分化程度越高，成骨現(xiàn)象越明顯[7]。本研究結(jié)果同樣證實(shí)，在骨肉瘤患者中，影像學(xué)上軟組織骨化程度和病理學(xué)對(duì)腫瘤性成骨的評(píng)估高度一致。

骨肉瘤成骨分化程度與腫瘤惡性程度相關(guān)。從低度惡性的骨肉瘤進(jìn)展為高度惡性的骨肉瘤過(guò)程中，成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)降低[8-9]，而成骨分化程度在臨床表現(xiàn)為X線上的骨化程度。本研究結(jié)果顯示，軟組織腫塊無(wú)明顯成骨的骨肉瘤患者雖然化療效果更好，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率更高，一旦耐藥進(jìn)展或轉(zhuǎn)移，病情進(jìn)展迅速，生存時(shí)間短。而軟組織腫塊成骨的骨肉瘤患者，化療相對(duì)不敏感，但轉(zhuǎn)移率低，即使轉(zhuǎn)移，生存期也較長(zhǎng)，表現(xiàn)出類似高分化骨肉瘤的臨床特點(diǎn)。部分成骨的普通型骨肉瘤占大部分，影像學(xué)和臨床表現(xiàn)更復(fù)雜，提示這類骨肉瘤患者的腫瘤具有更大的異質(zhì)性，其軟組織腫塊中既有不成骨的高度惡性腫瘤成分，又有成骨的高分化腫瘤成分。腫瘤的高度惡性部分決定其生物學(xué)行為，所以在本研究中，部分成骨的骨肉瘤在化療敏感度與無(wú)成骨型更一致。

骨肉瘤的新輔助化療明顯提高了保肢率，但并未進(jìn)一步提高骨肉瘤的總生存率[10]。2020版中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)經(jīng)典型骨肉瘤診療指南也提出，為了避免術(shù)前化療期間腫瘤進(jìn)展，對(duì)于ⅡA期和沒有保肢條件的ⅡB期患者，部分有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師會(huì)推薦不行術(shù)前化療，直接手術(shù)[11]。本研究結(jié)果也表明，成骨明顯的骨肉瘤化療敏感度較差。因此，對(duì)于成骨明顯的骨肉瘤，在腫瘤外科邊界允許、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)低的情況下可以考慮直接手術(shù)，術(shù)后進(jìn)行輔助化療，在理論上對(duì)部分患者可能具有更好的臨床獲益，但仍需更多的病例和臨床研究來(lái)證實(shí)。