古麗霞 傅詠梅 張蜀 林居逸 鄧紅 盧永美

中圖分類號 R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）18-2236-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.18.10

摘 要 目的：建立猴耳環(huán)多酚的改良型雙水相萃取體系。方法：以猴耳環(huán)多酚含量、提取效率和分配系數(shù)為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)篩選雙水相萃取體系的料液比、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間。制備猴耳環(huán)不同極性部位的雙水相萃取液，以多酚含量和抗氧化活性[1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）的半數(shù)抑制濃度（IC50）]為指標(biāo)，結(jié)合多酚類成分與抗氧化活性的灰色關(guān)聯(lián)度分析，篩選改良劑?？疾旌煌|(zhì)量分?jǐn)?shù)（0～90%）改良劑的改良型雙水相萃取體系對猴耳環(huán)多酚提取的影響，并與傳統(tǒng)提取工藝（超聲提取和加熱回流提?。┻M(jìn)行比較。結(jié)果：最優(yōu)雙水相萃取體系為料液比1 ∶ 45，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%，室溫下超聲提取20 min。3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，猴耳環(huán)多酚含量、提取效率和分配系數(shù)分別為（28.35±1.01）%（RSD=3.56%，n=3）、（98.87±0.19）%（RSD=0.19%，n=3）和13.25±0.71（RSD=5.39%，n=3）。改良劑為乙酸乙酯。當(dāng)乙酸乙酯-乙醇混合溶液中乙酸乙酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，改良型雙水相萃取體系提取所得萃取物中多酚含量和抗氧化活性與超聲提取、加熱回流提取比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但得率和轉(zhuǎn)移率均顯著高于超聲提取、加熱回流提?。≒<0.05）。結(jié)論：成功建立提取得率和轉(zhuǎn)移率優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法的改良型雙水相萃取體系，可一步提取猴耳環(huán)多酚。

關(guān)鍵詞 猴耳環(huán);多酚;改良型雙水相萃取;抗氧化活性

Establishment of Modified Aqueous Two-phase Extraction System of Polyphenols from Archidendron clypearia

GU Lixia1，F(xiàn)U Yongmei2，ZHANG Shu1，3，LIN Juyi1，DENG Hong1，3，LU Yongmei1（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Advanced Drug Delivery Systems， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 2. Sinopharm Group Guangdong Medi-World Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangdong Foshan 528000， China; 3. Guangdong Provincial Engineering Center of Topical Precise Drug Delivery Systems， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish modified aqueous two-phase extraction （ATPE） system of polyphenols from Archidendron clypearia. METHODS： Taking the polyphenol content， extraction efficiency and partition coefficient of A. clypearia as indexes， the solid-liquid ratio， ethanol mass fraction and ultrasonic time of ATPE system were selected by single factor tests. The aqueous two-phase extracts from different polar parts of A. clypearia was prepared. The modifier was selected by taking polyphenol content and antioxidant activity [IC50 of 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH）， 2，2′-hydrazine bis （3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid） diammonium salt （ABTS）] as indicators， combined with the grey correlation analysis between polyphenols and antioxidant activity. The effects of modified ATPE system with different mass fraction （0-90%） of modifier on the extraction of polyphenols from A. clypearia were investigated and compared with traditional extraction technology （ultrasonic extraction and heating reflux extraction）. RESULTS： The optimal ATPE system included solid-liquid ratio of 1 ∶ 45， ethanol mass fraction of 40%，（NH4）2SO4 mass fraction of 11%，ultrasonic extraction time of 20 min， at room temperature. In 3 validation tests， polyphenol content， extraction efficiency and partition coefficient were （28.35±1.01）%（RSD=3.56%，n=3），（98.87±0.19）%（RSD=0.19%，n=3） and 13.25±0.71 （RSD=5.39%，n=3）， respectively. The modifier was ethyl acetate. When the mass fraction of ethyl acetate in the ethyl acetate-ethanol mixed solvent was 70%， there was no significant difference in the content and anti-oxidant activity of polyphenols from A. clypearia of modified ATPE （P>0.05）. The yield and transfer rate of it were significantly higher than those of ultrasonic extraction and heating reflux extraction （P<0.05）. CONCLUSIONS： The modified ATPE system with better extraction yield and transfer rate than the traditional extraction technology is successfully established， which can extract polyphenols from A. clypearia in one step.

KEYWORDS? ?Archidendron clypearia; Polyphenols; Modified aqueous two-phase extraction; Antioxidant activity

猴耳環(huán)Archidendron clypearia（Jack）Benth為含羞草科猴耳環(huán)屬植物，主要分布在廣東、海南、廣西、湖南等地，是我國南方的特色中藥材，具有清熱解毒、涼血消腫、止瀉、去濕斂瘡的功效[1]。猴耳環(huán)的主要活性成分有黃酮類、黃烷類和有機(jī)酚酸類等多酚物質(zhì)，具有抗炎、抗菌、抗病毒、降血糖等作用[2-6]。

多酚提取方法包括溶劑回流/超聲提取法、酶提取法、超臨界流體萃取法等[7-9]，這些方法存在提取率低、設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)[7-9]。雙水相萃取是利用物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離提取的方法，其中醇-鹽雙水相體系（如乙醇-硫酸銨）因其成本低、生物相容性好、條件溫和、配制簡單等優(yōu)點(diǎn)，在生物提取、天然產(chǎn)物分離等方面的應(yīng)用日益廣泛[10-11]。乙醇-硫酸銨雙水相萃取是利用乙醇和硫酸銨共同競爭水，從而使乙醇在水中的溶解度降低而導(dǎo)致分層，其中上相是含硫酸銨的乙醇溶液，下相是含乙醇的硫酸銨溶液。上相富含乙醇，有利于有效成分從藥材中溶出釋放，而大極性雜質(zhì)則轉(zhuǎn)移至下相（水相）。但這一提取方法會(huì)在分離提取的同時(shí)引入硫酸銨，因此有必要對雙水相萃取體系進(jìn)行改良[12-14]。

目前，猴耳環(huán)常用水、乙醇、甲醇為溶劑進(jìn)行提取，提取后還需要進(jìn)一步純化或者萃取才能得到有效部位[15-17]。本課題從有效部位研究的角度出發(fā)，以多酚含量、提取效率和分配系數(shù)為指標(biāo)，優(yōu)化雙水相萃取工藝參數(shù)，并在此基礎(chǔ)上，加入改良劑（如乙酸乙酯、正丁醇等）建立改良型雙水相萃取體系，以期達(dá)到一步分離提取猴耳環(huán)多酚的目的，為植物多酚的提取和雙水相萃取的應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ACQUITY型超高效液相色譜（UPLC）儀及配備的光電二極管陣列（PDA）檢測器（美國Waters公司）、UV1800型紫外-可見光分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）、RV8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）、BSA224S-CW型電子分析天平（德國Sartorius公司）、SK7200LHC型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

猴耳環(huán)藥材[批號DLS-20200422，經(jīng)課題組檢測其多酚含量為25.82%（g/g）]由廣東態(tài)合堂實(shí)業(yè)有限公司提供，經(jīng)廣東藥科大學(xué)何偉教授鑒定為真品;沒食子酸對照品（批號110831-201605，純度90.8%）購自中國食品藥品檢定研究院;乙醇、石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、正丁醇、硫酸銨、磷酸、碳酸鈉均購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;福林酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2′-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）均購自上海麥克林生化科技有限公司;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 雙水相相圖的繪制

根據(jù)濁點(diǎn)滴定法繪制雙水相相圖[18]。取一定量的硫酸銨，加水超聲（功率350 W，頻率53 kHz，下同）使溶解，冷卻至室溫后加入適量乙醇，溶液由澄清變?yōu)闇啙幔o置，振搖再靜置，均為渾濁），此時(shí)為相變點(diǎn)，記錄體系總質(zhì)量及乙醇質(zhì)量;加水約2 mL，體系由渾濁變?yōu)槌吻澹o置，振搖再靜置，均為澄清），即可進(jìn)行下一個(gè)相變點(diǎn)的測定。重復(fù)上述操作，采用Origin 2019b軟件，以硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（x）為橫坐標(biāo)、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（y）為縱坐標(biāo)繪制雙水相相圖，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，AC為雙節(jié)曲線，其下方為單相區(qū)，上方為兩相區(qū)，曲線上的點(diǎn)為成相臨界點(diǎn);ABC為系線[19-20]。采用Excel 2016軟件計(jì)算，得系線方程如下：y=-1.229 5x+53.317。

2.2 猴耳環(huán)多酚的雙水相萃取

按圖1中雙相區(qū)內(nèi)乙醇-硫酸銨的比例取硫酸銨適量，加水超聲使溶解，冷卻至室溫后加入相應(yīng)量的乙醇，分相后即為雙水相萃取體系。向該體系中加入猴耳環(huán)藥材粉末1 g，超聲提取20 min，濾去藥渣，分別取上相和下相溶液用于后續(xù)測定。

2.3 多酚含量、提取效率、分配系數(shù)的測定

采用福林酚比色法測定多酚含量[21]。以沒食子酸為對照品，以紫外-可見分光光度計(jì)在753 nm波長處測定吸光度，以待測物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=0.013 8x+0.021 3（R 2=0.999 8），并按此回歸方程計(jì)算上、下相溶液中多酚的濃度（以沒食子酸計(jì)）。該方法的方法學(xué)考察見文獻(xiàn)[21]。按如下公式計(jì)算多酚含量（Y）、提取效率（R）和分配系數(shù)（K）：Y=ctVt/M，R=ctVt/（ctVt+cbVb）×100%，K=ct/cb。式中，ct為上相多酚濃度，Vt為上相體積，M為藥材取樣量，cb為下相多酚濃度，Vb為下相體積。其中，提取效率是指上相中的物質(zhì)含量占雙水相萃取出的總物質(zhì)含量的比例，分配系數(shù)是指物質(zhì)在兩相中的分配情況，即上下相質(zhì)量濃度之比[22]。

2.4 雙水相萃取體系優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化猴耳環(huán)多酚的雙水相萃取體系。以多酚含量、提取效率和分配系數(shù)為指標(biāo)，考察料液比（g/mL，下同）、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間對猴耳環(huán)多酚提取的影響。

2.4.1 料液比 固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%、超聲時(shí)間為20 min，考察不同料液比（1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35、1 ∶ 40、1 ∶ 45、1 ∶ 50、1 ∶ 60）對猴耳環(huán)多酚提取的影響。結(jié)果顯示，多酚含量隨著料液比的變化（1 ∶ 25→1 ∶ 60）呈先升高后降低的趨勢，且在料液比1 ∶ 45時(shí)達(dá)到峰值;提取效率隨著料液比的變化（1 ∶ 25→1 ∶ 60）呈先升高后降低再升高的趨勢，且在料液比1 ∶ 40時(shí)達(dá)到峰值;當(dāng)料液比在1 ∶ 30～? 1 ∶ 45范圍內(nèi)，分配系數(shù)較高且趨于平穩(wěn)，詳見圖2A。綜合考慮，選擇料液比為1 ∶ 45。

2.4.2 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) 固定料液比為1 ∶ 45、超聲時(shí)間為20 min，考察不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（20%、25%、30%、35%、40%）對猴耳環(huán)多酚提取的影響。結(jié)果顯示，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響分水能力，當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～30%時(shí)，分配系數(shù)較高;當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)>30%時(shí)，多酚含量隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈緩慢升高的趨勢，提取效率呈先降低后升高的趨勢，分配系數(shù)明顯下降，詳見圖2B。綜合考慮，選擇乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%。

2.4.3 超聲時(shí)間 固定料液比為1 ∶ 45、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，考察不同超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對猴耳環(huán)多酚提取的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)超聲時(shí)間為20～40 min時(shí)，分配系數(shù)較高;超聲時(shí)間的變化對多酚含量、提取效率的影響不大，超聲20 min后多酚含量和提取效率不再明顯增加，詳見圖2C。綜合考慮，選擇超聲時(shí)間為20 min。

2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在料液比1 ∶ 45、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%（根據(jù)系線方程計(jì)算）、室溫超聲提取20 min的條件下，重復(fù)提取3次，按“2.3”項(xiàng)下方法測定并計(jì)算多酚含量、提取效率、分配系數(shù)。結(jié)果顯示，猴耳環(huán)多酚含量為（28.35±1.01）%（RSD=3.56%，n=3），提取效率為（98.87±0.19）%（RSD=0.19%，n=3），分配系數(shù)為13.25±0.71（RSD=5.39%，n=3），表明該體系穩(wěn)定、可行，可用于猴耳環(huán)中多酚的提取。

2.5 改良劑的篩選

本研究結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)考察不同極性萃取劑對多酚富集情況的影響，選出最佳改良劑，以擴(kuò)大兩相極性差異，去除雙水相萃取體系引入的硫酸銨。

2.5.1 樣品的制備 按“2.4”項(xiàng)所得最優(yōu)雙水相萃取體系提取猴耳環(huán)多酚。取上相依次加入等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇，濃縮后于60 ℃干燥，用甲醇復(fù)溶并稀釋、定容至10 mL量瓶中;剩余少量水層經(jīng)60 ℃烘干后用水復(fù)溶并稀釋、定容至10 mL量瓶中，分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水等4個(gè)部位的樣品溶液，質(zhì)量濃度均為200 mg/mL（以生藥量計(jì)）。取各部位樣品溶液適量，用水稀釋成質(zhì)量濃度分別均為5.0、2.0、1.0、0.5、0.05 mg/mL（均以生藥量計(jì)）的不同極性部位的系列樣品溶液。

2.5.2 猴耳環(huán)不同極性部位多酚含量的測定 取“2.5.1”項(xiàng)下不同極性部位的樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法測定多酚含量。每份樣品平行操作3次。結(jié)果顯示，石油醚部位中未見多酚，乙酸乙酯部位中多酚含量最高，正丁醇部分次之，詳見表1。

2.5.3 猴耳環(huán)不同極性部位抗氧化活性的檢測 （1）DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)：取“2.5.1”項(xiàng)下不同極性部位的系列樣品溶液各2 mL，分別加入0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL，混勻，暗處放置30 min后，在517 nm波長處測定吸光度，同法測定對照溶液（樣品+無水乙醇）和空白溶液（水+DPPH乙醇溶液）的吸光度，計(jì)算樣品對DPPH自由基的清除率[23]。（2）ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)：取“2.5.1”項(xiàng)下不同極性部位的系列樣品溶液各0.4 mL，分別加入ABTS工作液（7 mmol/L的ABTS溶液與5.16 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合）4 mL，混勻，室溫下避光反應(yīng)6 min后，在734 nm波長處測定吸光度，同法測定對照溶液（樣品+無水乙醇）和空白溶液（水+ABTS工作液）的吸光度，計(jì)算樣品對ABTS自由基的清除率[24]。（3）DPPH或ABTS清除率的計(jì)算：DPPH或ABTS清除率（%）=[1-（A樣品-A對照）/A空白]×100%。采用SPSS 25.0軟件建立Probit回歸以計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。結(jié)果顯示，對DPPH自由基的清除活性由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位>石油醚部位，對ABTS自由基的清除活性由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位≈石油醚部位，由此可見，乙酸乙酯部位對DPPH和ABTS自由基的清除作用最強(qiáng)，正丁醇部位次之，石油醚部位清除DPPH和ABTS自由基的IC50較大，基本無抗氧化活性，詳見表1。

2.5.4 猴耳環(huán)不同極性部位色譜峰與抗氧化活性的關(guān)聯(lián)度分析 取“2.5.1”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的各極性部位樣品溶液，按如下色譜條件進(jìn)行UPLC-PDA分析：以ACQUITY UPLC T3 C18（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱，以甲醇為流動(dòng)相A、0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（0～2.00 min，6%A→17%A;2.00～10.00 min，17%A→23%A;10.00～15.00 min，23%A→26%A;15.00～20.00 min，26%A→30%A;20.00～25.00 min，30%A→32%A;25.00～30.00 min，32%A;30.00～40.00 min，32%A→38%A;40.00～50.00 min，38%A→48%A;50.00～55.00 min，48%A→6%A），流速為0.3 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為3 μL[21]。其色譜圖見圖3，峰面積見表2。以DPPH和ABTS的IC50的倒數(shù)為參考數(shù)列、多酚含量為評價(jià)數(shù)列、色譜圖中各色譜峰的峰面積為比較數(shù)列進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析[25-26]，結(jié)果見表3、表4。

由表3、表4可知，猴耳環(huán)多酚各色譜峰峰面積與DPPH、ABTS的IC50關(guān)聯(lián)度（前10位）均大于0.5，表明猴耳環(huán)對DPPH和ABTS自由基的清除活性與其多酚含量具有一定的相關(guān)性。由圖3、表2可知，抗氧化活性貢獻(xiàn)較大的多酚類成分大部分富集在猴耳環(huán)的乙酸乙酯部位。綜合考慮，選擇乙酸乙酯作為改良劑。

2.6 猴耳環(huán)多酚的改良型雙水相萃取

按“2.4”項(xiàng)下方法超聲，將其中冷卻至室溫后加入的乙醇替換為乙酸乙酯-乙醇混合溶液，分相后即為改良型雙水相萃取體系。向改良型雙水相萃取體系中加入猴耳環(huán)藥材粉末1 g，超聲提取20 min，濾去藥渣，分別取上相和下相溶液用于后續(xù)測定。

2.7 改良型雙水相萃取體系中不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸乙酯對猴耳環(huán)多酚提取的影響

按“2.6”項(xiàng)下方法配制改良型雙水相萃取體系，考察乙酸乙酯-乙醇混合溶液中不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸乙酯（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）對猴耳環(huán)多酚提取的影響。結(jié)果顯示，隨著乙酸乙酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，多酚含量呈先升高后降低的趨勢，提取效率呈逐漸降低的趨勢，且在乙酸乙酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，多酚含量最高，提取效率和分配系數(shù)均較高;此外，在乙酸乙酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%時(shí)有一突躍點(diǎn)，且此時(shí)分配系數(shù)達(dá)到最大，詳見圖4。這可能與上相極性改變而導(dǎo)致部分大極性多酚轉(zhuǎn)移至下相有關(guān)。

2.8 改良型雙水相萃取方法與傳統(tǒng)提取方法的比較

2.8.1 樣品溶液的制備 分別配制含10%、70%乙酸乙酯的乙酸乙酯-乙醇混合溶液的改良型雙水相萃取體系，按“2.6”項(xiàng)下方法提取猴耳環(huán)多酚，取上相濃縮、凍干，制成A′樣品和A樣品。以70%乙醇為溶劑，液料比為1 ∶ 45，室溫超聲提取20 min，取提取液濃縮后加入等體積乙酸乙酯萃取，取上層濃縮、凍干，制成B樣品。以70%乙醇為溶劑，液料比為1 ∶ 45，加熱回流1 h，取提取液濃縮后加入等體積乙酸乙酯萃取，取上層濃縮、凍干，制成C樣品。以水為溶劑，液料比為1 ∶ 45，加熱回流1 h，取提取液濃縮后加入等體積乙酸乙酯萃取，取上層濃縮、凍干，制成D樣品。精密稱取上述樣品各20 mg，置于20 mL量瓶中，加70%乙醇溶解、稀釋并定容，制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的樣品溶液。

2.8.2 萃取物提取指標(biāo)和抗氧化活性的比較 取“2.8.1”項(xiàng)下樣品溶液各適量，分別按照“2.3”項(xiàng)下方法測定其中的多酚含量，按如下公式計(jì)算得率和轉(zhuǎn)移率：得率=Mc/M×100%，轉(zhuǎn)移率=Yc/Ys×100%[27-28]。式中，Mc為萃取物質(zhì)量，M為藥材投料量，Yc為萃取物中多酚含量，Ys為藥材中多酚含量。按“2.5.3”項(xiàng)下方法檢測“2.8.1”項(xiàng)下各樣品溶液對DPPH和ABTS自由基的IC50。采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩兩比較采用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。每樣品平行3份操作，結(jié)果見表5。

由表5可知，A′樣品的得率超過100%，提示其中含有大量的硫酸銨，后續(xù)不再納入分析。A、B、C、D樣品中多酚含量和抗氧化活性組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但A樣品的得率和轉(zhuǎn)移率均顯著高于B、C、D樣品（P<0.05），說明加入適量的改良劑（乙酸乙酯）將有利于猴耳環(huán)多酚溶出和純化。

2.8.3 萃取物的成分比較 取“2.8.1”項(xiàng)下A、B、C、D樣品溶液各適量，按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，上述4種樣品的色譜圖基本一致，詳見圖5。

3 討論

猴耳環(huán)加入至雙水相萃取體系后，在超聲的物理效應(yīng)下，多酚從植物細(xì)胞中快速釋放、擴(kuò)散，并在上相富集，而雜質(zhì)（如多糖類、蛋白類）由于極性較大易富集于下相，以此達(dá)到提取純化的目的。本課題組前期曾對雙水相萃取體系中的超聲溫度進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，雙水相萃取體系的穩(wěn)定性變差，在60 ℃時(shí)不分相。雙水相萃取體系受分子間的作用力（范德華力、疏水作用、分子間的氫鍵、分子與分子之間電荷作用等）影響，在超聲和高溫條件下，體系黏度和密度均會(huì)發(fā)生改變，從而影響分子間的作用力[29-30]，故應(yīng)嚴(yán)格控制在室溫下提取。

灰色關(guān)聯(lián)度分析對大、小樣本量和有、無規(guī)律樣本均同樣適用，而且計(jì)算量小，十分方便，用于“成分-藥效”分析的優(yōu)勢明顯[31-33]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，猴耳環(huán)不同極性部位色譜峰峰面積與DPPH、ABTS的IC50呈負(fù)相關(guān)，因此本研究將DPPH、ABTS的IC50進(jìn)行倒數(shù)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析。結(jié)果顯示，猴耳環(huán)多酚中各色譜峰與IC50的倒數(shù)的關(guān)聯(lián)度（前10位）均大于0.5，表明猴耳環(huán)的抗氧化活性與多酚類成分具有一定的關(guān)聯(lián)性，抗氧化活性可能是各成分共同作用的結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，乙酸乙酯可富集抗氧化活性貢獻(xiàn)較大的多酚類成分，因此選擇乙酸乙酯作為改良劑。以10%乙酸乙酯-乙醇混合溶劑配制的改良型雙水相萃取體系提取猴耳環(huán)多酚的結(jié)果顯示，萃取物中還含有較多的硫酸銨晶體;而以70%乙酸乙酯-乙醇混合溶劑配制的改良型雙水相萃取體系提取猴耳環(huán)多酚的結(jié)果顯示，上相中由于增加了有機(jī)溶劑的含量，擴(kuò)大了兩相的極性差異，使上相含水量降低，導(dǎo)致硫酸銨向下相轉(zhuǎn)移，從而減少了硫酸銨的殘留[34]。因此，選擇70%乙酸乙酯-乙醇混合溶液配制改良型雙水相萃取體系。

回流/超聲提取法是中藥最常用的傳統(tǒng)提取方法，與其比較，以70%乙酸乙酯-乙醇混合溶液的改良型雙水相萃取體系提取的萃取物中猴耳環(huán)多酚含量、抗氧化活性均無明顯差異，但得率和轉(zhuǎn)移率顯著升高。

綜上所述，本研究成功建立了改良型雙水相萃取體系，可一步提取猴耳環(huán)中的多酚類成分，為多酚的提取和雙水相萃取的應(yīng)用提供了參考。

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（收稿日期：2021-05-12 修回日期：2021-08-24）

（編輯：鄒麗娟）